小型发酵罐的使用与发酵过程中主要生化指标测定要点.docx
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小型发酵罐的使用与发酵过程中主要生化指标测定要点
*******大学
综合性实验报告
实验名称：
小型发酵罐的使用与发酵
过程中主要生化指标测定
实验性质：
综合性实验
所属课程名称：
发酵工程工艺原理
班级：
学号：
姓名：
实验指导教师：
小型发酵罐的使用与发酵过程中主要生化指标测定
摘要：
为研究小型发酵罐分批培养过程中大肠杆菌的菌体生长状况，本实验以分批培养法培养大肠杆菌，通过控制发酵过程的温度、溶氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等参数，并每小时取样测OD值和还原糖量，制作菌体生长曲线，以此判断大肠杆菌的生长发酵状况。
从而达到了解小型发酵罐的基本结构，学习和掌握发酵罐的使用及在实验室内大规模培养微生物细胞的方法的实验目的。
实验结果表明，
关键词：
小型发酵罐、发酵、大肠杆菌、菌体生长曲线
前言：
大肠杆菌是遗传工程研究过程中常用的受体菌。
具有遗传背景清楚、载体受体系统完备、生长迅速、培养简单、重组子稳定等优点。
为满足各项技术的研究要求，需要通过控制合适的培养条件，使大肠杆菌迅速持续地生长，获得高产培养物。
本实验使用小型发酵罐对大肠杆菌进行分批培养。
发酵罐配备控制系统，能对发酵过程中的各种参数如温度、pH、溶解氧、搅拌速度、空气流量、补料、泡沫水平等进行设定、显示、记录以及对这些参数进行反馈调节控制。
所测定的大肠杆菌在发酵过程中的各项生化指标，可提供反映环境变化和细胞生长的许多重要信息，作为研究和控制发酵过程的基础。
一、材料与方法
（一）实验材料
1．菌种
大肠杆菌（E.coli）
2．培养基
种子培养基：
葡萄糖1.0g，蛋白胨1.0g，酵母膏0.5g，牛肉膏1.0g，氯化钠0.5g，水100mL，pH7.0。
发酵培养基：
葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，氯化钠5g，氯化铵5g，水1000mL，pH7.0。
3．仪器设备
BIOTECH-7BGZ发酵罐1套（配套蠕动泵、pH电极、溶氧（DO）电极、空压机及所有连接管）、分光光度计、旋转式摇床、离心机、烘箱等。
4．试剂
泡敌、斐林试剂、0.1%标准葡萄糖溶液、40%氢氧化钠等。
（二）实验方法
实验流程：
培养24h培养12h培养10h
菌种→斜面——→一级种子——→二级种子—————
37℃（250mL摇瓶）37℃（500mL摇瓶）37℃
培养基
↓8～10h
发酵罐——→管路准备→实罐灭菌→发酵——→放罐
37℃
↓
取样→分析测定
1.菌种准备
（1）配制种子培养基
配制种子固体培养基100mL，分装试管，0.1MPa（121℃）灭菌20min，然后摆成斜面。
配制种子培养液500mL，各分装50mL于两个250mL三角瓶中（作一级种子瓶），余下的培养液装进三个500mL的三角瓶中（作二级种子瓶），0.1MPa（121℃）灭菌20min。
（2）接种与培养
上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜面，37℃培养24h。
上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子瓶，37℃振荡（125r/min）培养12h，然后转接二级种子瓶，37℃振荡（125r/min）培养10h。
2．上罐前的准备及实罐灭菌
（1）洗净发酵罐及各联接胶管。
（2）配制发酵培养基4000ml，置发酵罐内，视情况加入几滴泡敌。
（3）安装好发酵罐，把取样管、电极插口、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开夹套溢流口V2、进水阀W1，使夹套充满水。
（4）用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4，启动蒸汽发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min，开启冷凝水出水阀V1，开进水阀门S1，进行在位灭菌。
（5）将灭菌温度设为115℃，保温时间0.33h，设为自动。
当达到795s时，灭菌温度达到121℃。
（6）灭菌结束后，不打开保护罩，使发酵罐自然冷却至室温。
（7）用75%酒精消毒pH电极和DO电极，接入发酵罐，连接各电极导线。
（8）流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使胶管内充满液体，将输出上限设为15%，下限设为0，待一切准备就绪，将“手动”开关调节到“自动”状态。
（9）设定搅拌转速为300r/min，空气流量2~3L/min、pH7.0、DO100%，系统进入发酵状态。
3.发酵操作
（1）当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，取样（用于接种前培养基成分分析）：
松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入接料瓶，开J2、J3排出取样管内残料，夹紧J2、J3。
（2）接种：
将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入二级种子，然后旋紧接种盖，移取火焰圈。
接种后立即进行第一次取样，用于测定细菌OD值。
4.发酵管理
（1）控制发酵过程的各项参数（温度、PH、溶解氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等），如参数出现异常现象，则应及时排除。
（2）每小时取一次样，每次取样50ml。
取样时先将空气流量计旋钮调至0~1L/min，松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入量筒，当达到40mL，开J2排出取样管内残料，夹紧J3、J2。
将样液入标记有取样时间的三角瓶，用保鲜膜封口，立即入冰箱冷藏，取完样要及时清洗量筒。
（3）每次取样前（每隔1小时）记录发酵过程温度、PH值、DO、通风、转速的测定数值，并记录操作情况。
5.发酵过程中各生化指标的测定
（1）测定OD值
大肠杆菌标准曲线的绘制：
取10mL离心管，与105℃烘2h至恒重，用镊子夹取入干燥器，待冷却后于分析天平上称重（W0），精确到小数后4位，然后准确取10mL发酵液，于3000rpm离心10min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀，同上离心，弃上清液，与100℃烘至恒重，用镊子夹取如干燥器中冷却，于分析天平上称重（W1），精确至小数后4位，得细胞干重为W1-W0。
取同一发酵液，稀释2、5、10、20、50倍，于600nm下测OD值。
以0D值为纵坐标，菌液浓度（g/L）为横坐标，绘制标准曲线。
均匀取样品5mL于编号试管中，用空白发酵液稀释至一定浓度，在721分光光度计上测定A600，根据菌体浓度与吸光度之间关系地标准曲线换算出菌体浓度。
其余发酵液于3℃，2000r/min条件下离心分离8min,上清液装入编号三角瓶，用于测糖。
（2）测定葡萄糖
样品处理：
用蒸馏水对样品液进行稀释待用。
标定碱性酒石酸铜溶液：
分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，混匀，从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准溶液，控制在2min内加热至沸腾，趁沸以每2秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其平均值，计算每10mL（甲、乙液各5mL）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）。
样品溶液预标定：
分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，混匀，控制在2min内加热至沸腾，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。
样品溶液测定：
分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，混匀，从滴定管滴加比预滴定体积少1mL的样品溶液，使在2min内加热至沸腾，趁沸继续以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同法平行操作3份，得出平均消耗体积。
结果计算：
，式中：
c——葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL；
V——标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL；
V1——测定时平均消耗样品溶液体积，mL；
N——被测样品稀释倍数。
6.放罐
（1）发酵8小时后，测OD值及还原糖量，当发酵液的PH不断上升且为碱性、OD值增长缓慢，且还原糖量很低时，可判断发酵结束，准备放罐。
（2）放罐操作同取样。
将全部发酵液取出后，100℃煮沸10分钟灭菌，灭完菌的发酵液可排放入下水道。
7.清洗
（1）放罐完毕后，打开自来水进水口，往发酵罐中注满水，同时开动搅拌轴搅动清洗五分钟，排水。
（2）再次注入自来水清洗，操作如1。
（3）清洗结束，关闭电源。
7.清洗
（1）放罐完毕后，打开自来水进水口，往发酵罐中注满水，同时开动搅拌轴搅动清洗五分钟，排水。
（2）再次注入自来水清洗，操作如1。
（3）清洗结束，关闭电源。
二、实验结果与分析
1.发酵过程数据结果
⑴每小时记录发酵过程温度、PH值、DO、通风、转速的测定数值，结果如下表：
时间
发酵时间h
温度℃
pH值
DO
%
通风L/min
转速
r/min
消泡
取样mL
值班人
空白
37.0
7.00
100.0
2-3
300
250
8:
20
0
37.0
7.00
95.0
2-3
300
50
9:
20
1
36.9
6.94
76.1
2-3
300
50
10:
20
2
36.9
6.93
26.7
2-3
300
50
11:
20
3
36.9
6.95
30.1
2-3
300
50
12:
20
4
37.0
6.97
8.7
2-3
300
50
13:
20
5
36.9
6.98
5.7
2-3
300
50
14:
20
6
36.9
6.99
0.6
2-3
300
50
15:
20
7
36.9
7.36
1.4
2-3
300
50
16:
20
8
36.9
7.59
7.0
2-3
300
50
17:
20
9
⑵大肠杆菌标准曲线绘制如下所示：
两者的关系曲线图1，如下图：
图1菌液OD值与干菌体浓度关系图
得大肠杆菌干菌体浓度X与菌液OD值y之间的关系为：
y=1.1658X+0.0989
则X=（y-0.0989）/1.1658
⑶测定不同时间发酵液的OD值，确定对应时间的菌液浓度，结果如下表：
表3发酵液OD值与菌液浓度关系表
样品
稀释度
OD值
X=（y-0.0989）/1.1658
干菌体浓度
空白对照
1
0.628
0.454
0.454
0
1
0.845
0.064
0.640
1
2.2
0.98
0.756
1.663
2
6.6
0.949
0.729
4.813
3
18
0.869
0.661
11.890
4
30
0.855
0.649
19.457
5
55
0.795
0.597
32.841
6
66
0.777
0.582
38.390
7
66
0.756
0.564
37.201
8
66
0.748
0.557
36.748
⑷测定不同时间发酵液的葡萄糖浓度，结果如下表：
表4培养液中葡萄糖含量表
编号
稀释倍速
预测X0
测定X1
测定X2
测定X3
平均体积
葡萄糖浓度
标定
10.80
10.90
10.90
0
18
10.51
10.97
10.92
10.42
10.770
18.162
1
15
9.25
9.06
9.62
9.40
9.360
17.415
2
13
8.62
8.62
8.56
8.51
8.563
16.497
3
10
8.70
8.35
8.70
8.80
8.617
12.611
4
7
9.00
8.70
8.80
8.75
8.750
8.693
5
3
7.23
6.78
6.88
7.32
6.993
4.662
6
2
9.75
9.20
9.55
9.12
9.290
2.339
7
1
10.22
9.85
10.30
9.88
10.01.
0.857
8
1
10.37
10.10
10.17
10.68
10.317
0.550
编号7、8反滴定
2.数据整理及分析
将数据处理之后，整理成下表：
发酵过程各参数数据表
发酵时间h
pH
DO值%
干菌体浓度（×0.1）g/L
葡萄糖浓度（×1/6）g/L
0
70.00
95
6.4
108.97
1
69.40
76.1
16.63
104.49
2
69.30
26.7
48.13
98.98
3
69.50
30.1
118.9
75.67
4
69.70
8.7
194.57
52.16
5
69.80
5
328.41
27.97
6
69.90
0.6
383.9
14.04
7
73.60
1.4
372.01
5.14
8
75.90
7
367.48
3.30
根据上表，以发酵时间h为横坐标，以pH值（×0.1）、DO值%、干菌体浓度（×0.1）g/L、葡萄糖浓度（×1/6）g/L等为纵坐标，绘制发酵过程中各参数的变化规律的坐标图，观察并分析其变化规律，从而得到发酵过程中大肠杆菌的生长情况和培养基的利用情况。
大肠杆菌经过8个小时的分批发酵培养，发酵过程中pH值（×0.1）、DO值%、干菌体浓度（×0.1）g/L、葡萄糖浓度（×1/6）g/L等参数的变化规律曲线如图所示，可以分为3个阶段：
第一阶段（延迟期）：
从图可以看出，0-1h时，PH趋于稳定，干菌体浓度缓慢上升至500g/L左右，DO值%迅速从95%减至26.7%，葡萄糖浓度曲线趋于平缓。
这是因为大肠杆菌处于延迟期（又称适应期），它需要消耗一定的氧气和葡萄糖进行较为慢速的自我繁殖。
此时的大肠杆菌大多采用有氧呼吸，因此发酵过程中会产酸产气，导致PH有小幅度的下降。
第二阶段（对数生长期）：
从图可以看出，1h-6h时，PH趋于稳定，干菌体浓度迅速增长至最高值，DO值%维持在较低水平（30%以下），葡萄糖浓度也迅速下降。
这是因为大肠杆菌处于对数生长期，代谢旺盛，菌体快速生长，它利用大量的氧气和葡萄糖进行快速的自我繁殖，此时新生的细胞数大大多于死亡的细胞数，自然增长率保持在很高的水平，
第三阶段（稳定期）：
从图可以看出，6h-8h时，PH趋于稳定，干菌体浓度保持在较高水平，DO值%虽有所增加但总体上整个环境处于低氧状态，葡萄糖浓度降到历史最低值。
这是因为此时大肠杆菌处于稳定期，出生率和死亡率基本持平，因此大肠杆菌的总数保持在最高水平上，但因为大肠杆菌为好氧或兼性厌氧菌，因此即使此时的DO值%和葡萄糖浓度值很低，它仍然能够进行一定的有氧呼吸和无氧呼吸。
对于发酵后PH升高问题，主要是大肠杆菌先利用糖，分解产酸会使PH下降，但随后继续繁殖或其它菌的生长，促使蛋白胨的分解，产生了代谢产物又呈现碱性，因此会表现出PH增高现象。
但是在发酵24小时后更加明显。
由于实验发酵时间有限，无法完成整个发酵过程，故不能得到大肠杆菌生长的衰亡期。
在发酵的过程中，有几个重要因素会影响到大肠杆菌的生长，以下逐一进行分析：
①碳源的添加量：
通过对重组大肠杆菌生产谷胱甘肽（GSH）发酵条件的研究表明:
初糖浓度为10g/L时,重组大肠杆菌WSH-KE发酵24h,细胞干重达最大,细胞内GSH含量也高于其它糖浓度[1]。
对高密度发酵大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白-2A的研究也表明:
基质中初糖浓度为10g/L时细胞浓度和产物表达量均获得了较好的效果[2]。
一般选择葡萄糖作为碳源，而大肠杆菌培养时营养的抑制浓度为:
葡萄糖（50g/L）、氮（3g/L）、Fe2+（1.15g/L）、Mg2+（8.7g/L）、PO43-（10g/L）、Zn2+（0.038g/L）[3]，因此，优化大肠杆菌的培养过程可以对碳源的添加量进行控制。
②DO值
溶氧浓度是影响高密度发酵的一个重要参数。
大肠杆菌菌群在扩增过程中,需大量氧气参与代谢,因而,饱和氧的供给很重要。
溶氧浓度过高或过低,都会影响菌体的生长和产物的生成。
特别是在发酵后期,由于菌体密度的急剧扩增,耗氧量极大,发酵罐的各项物理参数均不能满足对氧的供给,使菌体生长变得极为缓慢。
所以维持较高水平的溶氧浓度,不但有利于菌体生长。
要使发酵过程中保持适宜溶氧浓度，必需确定发酵罐的通气量和搅拌速度。
在一定范围内,通气量越大,溶氧浓度越高。
但不能单纯依靠提高通气量来获得充足氧气。
如果气流速度过大,再提高通气量,会使发酵液产生大量气泡,使罐的有效利用率降低。
另外,在发酵液中添加H2O2，在细胞过氧化酶的作用下,也可释放出氧气，供菌体利用[4]。
③温度
培养温度对细菌的生长发育具有很大影响。
若培养温度适宜,则会明显促进细菌生长。
随着温度的升高,细菌代谢加快,但其生长过程中的代谢副产物也会随着增加,它们会对菌体生长产生一定抑制作用。
此外,温度还通过改变发酵液的物理性质间接影响细菌的生长。
李向阳[5]等人探究了温度对大肠杆菌的作用影响，如下表1所示。
由表可知，大肠杆菌在311K/38°C时的生长速率最大，因此该温度为最佳培养温度。
实验过程中应严格控制温度在最适温度附近。
④PH
细菌的生长发育及各种能量代谢都要受其环境pH值影响。
特别是在发酵过程中,pH值的改变会直接影响菌体的产量和目的产物的表达。
因此,一定要充分考虑细菌的最适pH值范围,并在发酵过程中保持一定的pH值。
但在发酵过程中,由于大肠杆菌可利用葡萄糖产酸产气,特别是产生大量乙酸和CO2,从而使pH降低。
因此,在产生发酵过程中,必须及时调节pH值,以避免pH值激烈变化对细菌生长代谢和目的产物表达的不利影响。
李向阳[5]等人探究了PH对大肠杆菌的作用影响，如下表2所示。
由表2可知，PH为7.91时大肠杆菌的生长速率最高，因此该PH值为大肠杆菌的最适生长PH。
在发酵过程中，要严格控制PH以达到更好的发酵效果。
综合分析，在发酵过程中，应严格控制pH值、温度、DO值、通风量、搅拌转速等发酵条件，从而发挥菌种的最大生产潜力，得到最大的比生产速率和最大的生产率。
3.最大比生长速率和平均细胞得率系数
⑴分批培养是一种非恒态的培养法，分批培养中细胞的生长动力学：
X—干菌体浓度（g/L）
t—发酵时间（h）
μ—比生长速率（h-1），即单位重量菌体的瞬时增量g/（g·h）
在对数生长阶段，细胞的生长不受限制，因此比生长速率达到最大值μm：
→
→
→
干菌体浓度X与lnX的关系：
x
1.663
4.813
11.890
19.457
32.841
38.390
lnx
0.509
1.571
2.476
2.968
3.492
3.648
由于比生长速率达到最大值是在对数生长期内，故取1h到6h这阶段的时间与lnX的关系直线图，如下图：
根据上图，取中间值3h和5h，得：
→
→
=0.266h-1
即大肠杆菌的最大比生长速率为0.266h-1。
⑵细胞得率系数，即菌体的生长量相对于基质消耗量的收得率，用YX/S表示：
YX/S—相对于基质消耗的实际生长得率（g/mol或g/g）
ΔX—干细胞的生长量（g）
ΔS—基质的消耗量（mol或g）
测0-8h的细胞得率系数：
即大肠杆菌的平均细胞得率系数为0.178
参考文献
[1]李寅,陈坚,毛英鹰等.重组大肠杆菌生产谷胱甘肽发酵条件的研究[J].微生物学报,1999,39（4）:
355～360
[2]李民,陈常庆,朴勤等.利用恒溶氧补料分批技术高密度发酵大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白-2A[J].生物工程学报,1998,14（4）:
270～275
[3]RiesenbergD,Curr,O.Biotechnol.,1991,2:
380～384
[4]刘文波大肠杆菌高密度发酵研究动物科学与动物医学 2001年1月 第18卷第1期（总第73期）：
27-29
[5]李向阳温度、pH、药物对大肠杆菌抑制作用的量热法研究2007,Vol.28,No.06食品科学：
252-255
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