低温脂肪酶的实验室发酵条件优化及酶学特性的研究.docx
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低温脂肪酶的实验室发酵条件优化及酶学特性的研究
低温脂肪酶的研究
_______试验室发酵条件优化及酶学特性的研究
摘要：
低温微生物脂肪酶由于具有低温高催化活性,耐有机溶剂以及对热敏感等特点,有高效、耐热、作用周期短等优势,其独特的低温适应机制是中高温脂肪酶无法替代的，在反应中不需要加热，这对于降低能量消耗，减少环境污染具有非常重大的意义，在食品、洗涤、制药、脂类加工、低温环境修复等方面有着巨大的应用潜力。
其催化作用广泛性和巨大的工业化潜力，及它不需要辅酶等优势使它在生物合成和生物转化中具有诱人的前景。
以一种海洋产电菌作为研究对象，研究其产生的低温脂肪酶的实验室发酵条件的优化及酶学特性的研究，其中实验室的发酵条件的优化包括：
优化橄榄油乳化剂，优化发酵培养液，优化培养环境，以及优化培养的最适合温度、pH、有利于产酶的重金属离子、有抑制产酶的重金属离子、最适的碳氮源等的研究。
关键字：
低温脂肪酶；发酵条件优化；酶学特征；优化
Theresearchoflow-temperaturelipase
——laboratoryfermentationconditionsoptimizationandenzymologycharacteristics
ZhujingFenglei
Summary:
Lowtemperaturemicrobiallipasebecauseofitslowtemperaturehighcatalyticactivity,resistancetoorganicsolventandheatsensitiveetc.,havehighefficiency,heatresistance,actioncycleshort,etcadvantages,itsuniquecryogenicadaptivemechanismisofhightemperaturelipaseirreplaceable,inthereactiondon'tneedheating,thistoreduceenergyconsumption,reducethepollutionoftheenvironmentisofgreatsignificance,infood,washing,pharmacy,lipidprocessing,lowtemperatureenvironmentrestorationhasgreatapplicationpotential.Thecatalyticactionuniversalityandthehugepotentialofindustrialization,anditdoesnotneedcoaetcadvantagesmakeitinbiologicalsynthesisandbiologicaltransformationhasanattractiveprospect.InaMarineproductionelectricbacteriaastheresearchobject,andstudytheproducelow-temperaturelipaselaboratoryfermentationconditionsoftheoptimizationandenzymologycharacteristicsofresearch,includingtheoptimizationoffermentationconditionsofthelaboratoryinclude:
optimizationofoliveoilemulsifier,optimizethefermentationculturesolution,optimizetheenvironmentoftraining,aswellastheoptimizationoftrainingthemostsuitabletemperature,pH,inenzymeproductionofheavymetalions,inhibitenzymeproductionofheavymetalions,thebestcarbonandnitrogensourceetc.
Keywords:
Low-temperaturelipase;Fermentationconditionsoptimization;Enzymologycharacteristics;Optimization
1材料和方法
1.1菌种
在羊粪中筛选出H11菌种，并且研究其低温脂肪酶的活性。
低温脂肪酶具有极高的催化常数（K。
t）值，同时有较低和较稳定的米氏常数（K）值，其主要特征是具有较低的活化能和低温下的酶活力，在某些领域有着中温脂肪酶所不可比拟的优越性，在洗涤业、食品加工、生物制药、环境生物技术等领域有着广阔的应用前景[1]。
1.2仪器
4℃高速冷冻离心机、可调温度的恒温箱、恒温水浴锅、高速组织破碎机、紫外灯无菌操作台。
1.3培养基
液体发酵基本培养基：
蛋白胨1%、NaCl0.5%、CaCl2.7H2o0.01%、Tween801%、蒸馏水配制，Ph7.0以上。
1.4试验方法
发酵液中脂肪酶酶活的测定采用经典的聚乙烯醇橄榄油乳化液方法[2]。
1.4.1反应底物乳化液的制备
称取30g聚乙烯醇（PVA）,加900mL水,加热溶解,冷却后用6mol/L氢氧化钠调至pH10.0,过滤,定容至1000mL。
取上述PVA溶液150mL,加入橄榄油50mL,用高速组织捣碎机搅拌6min,8000r/min,前后各3min,间隔5min,液备用。
1.4.2甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液的制备
配制0.2mol/L甘氨酸和0.2mol/L氢氧化钠,再根据所需pH值配制不同的缓冲液。
1.4.30.05mol/L氢氧化钠溶液的制备
称取4.5g固体氢氧化钠溶于1L水中,用0.1mol/L的邻苯。
1.4.4测定酶液的制备
将产酶的菌接入液体培养基培养，酶液即取此菌的发酵液。
1.4.5酶活的定义
40℃,pH7.5条件下,每分钟催化脂肪水解产生1μmol脂肪酸的脂肪酶量定义为1个脂肪酶国际单位（U）。
1.4.6酶活的测定
在三角瓶中加入一定量混合均匀的缓冲溶液和乳化液的混合液,放入一定温度的恒温水浴锅中,再加入酶液反应并计时,一定时间后终止反应,用0.05mol/L氢氧化钠滴定游离出的脂肪酸,同时做空白样（先加终止剂,后加酶液,其余同样品操作）。
水解释放出的脂肪酸以1%酚酞（加2滴）为指示剂,0.05NNaOH为滴定液进行滴定,出现微红色时为终点。
1.4.7酶活的计算
酶活U=（V-V0）/t×50×n
其中:
V---样品所消耗碱的体积,mL;
V0---空白消耗碱的体积,mL;
t---反应时间,min;
50---1mL0.05mol/L氢氧化钠的微摩尔数;
n---稀释倍数。
根据杨华[3]等的实验得出:
采用缓冲液与乳化液混合后再吸取有利于减少误差,同时对乳化液进行快速搅拌,有利于乳化液均匀分散,提高了酶的反应速度和活力。
1.5实验步骤
1.5.1制作培养基
先将培养基按照比例加入个元素并用蒸馏水配制，将pH调到7.0以上。
接着做正交实验不断地找出最适的培养基。
最后测定酶学特性的。
1.5.2灭菌
将培养液均装入100mL的三角瓶，每瓶装50mL,并且用高温高压灭菌锅灭菌[4]：
首先检查水位是否低于桶壁下面的两个半环，低了要加水，稍微淹没那个半环就行了，然后把要灭菌的东西放到锅内，盖上盖子，打开电源，115度30分钟就可以。
灭好后带压力降到0后，拉开排气阀，开盖取出。
1.5.3接种
将灭过菌的培养基取出，在30℃以下的温度，按10%的接种量在无菌间中接种。
在接种中药避免污染。
1.5.4培养
将接种后的三角瓶，放置于30℃,150rpm的摇床上，40h后测定酶活。
通过正交试验设计对该菌株进行产酶条件进行优化[5]，得到最适产酶条件。
1.5.5测定
将发酵液取出，倒入离心管中，用低温高速离心机1500rpm/min,离心5min。
离心后将上清液用移液器吸取1mL上清液，按照1.4.6的方法测定。
1.5.6计算并画图
按照1.4.7的方法计算，并且将数据绘图。
2主要实验操作流程及具体步骤
原始培养基（测定酶活）→正交实验（筛选出最适培养基）→筛选最适碳氮源→筛选最适重金属离子→测定酶学特性（各项稳定性的测定）。
2.1原始培养基酶活的测定
蛋白胨1%、NaCl0.5%、CaCl2.7H2o0.01%、Tween801%、蒸馏水配制，将pH调到7.0以上，在4℃、10℃、15℃分别测定酶活以筛选出在那个温度下酶活较高。
2.2正交实验
在上述原始培养基的不同温度培养下，找出最适的温度后，每个元素上下各加件0.5个单位的量做正交。
正交表如下
脂肪酶筛选培养基
蛋白胨
氯化钠
氯化钙
吐温80
1
0.5
0
0.01
0.5
2
1
0.3
0.02
1
3
1.5
0.5
0.03
1.2
脂肪酶筛选培养基（%）正交实验表
蛋白胨
氯化钠
氯化钙
吐温80
1
0.5
0
0.01
0.5
2
1
0
0.02
1
3
1.5
0
0.03
1.2
4
0.5
0.3
0.02
1.2
5
1
0.3
0.03
0.5
6
1.5
0.3
0.01
1
7
0.5
0.5
0.03
1
8
1
0.5
0.01
1.2
按照这种方法，不断的筛选，知道筛选出最高的酶活在正交实验的中心停止。
2.3筛选最优培养基下产低温脂肪酶的最适温度
将实验筛选出的最适培养基与原始培养基对比培养，并且分别放置于4℃、15℃、30℃恒温箱中，测定脂肪酶活性。
以得出提高温度后此酶的最适温度。
2.4不同体积装量的培养基的酶活比较
将装量设置为每10mL为一个单位的装量测酶活，分别设置为10、20、30、40、50、60、70、80Ml,测其最高酶活的装量。
2.5不同接种量培养基酶活的比较
将原始培养基中分别接种2%、4%、6%、8%、10%的菌种，测定酶活，筛选最适的接种量。
2.6不同碳氮源对酶活的影响
氮源和碳源是利用微生物发酵的主要原料，氮源和碳源的选择和配比直接影响酶的产生[6]。
大部分微生物脂肪酶是胞外酶，合适的发酵条件对微生物脂肪酶的产生非常重要，培养条件不仅影响酶的产生，还影响酶在胞内、胞外的比例[7]。
在原始培养基中加入不同的碳源0,5%，选择的是：
麦芽糖、果糖、葡萄糖、乳糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、淀粉。
在原始培养基加入不同的氮源1%，选择的氮源有：
酵母膏、蛋白胨、硫酸钾、硫酸铵、牛肉膏。
2.7不同重金属对酶活的影响
不同的常用重金属离子，分别加入原始的培养基[8]，加入浓度为4mmol/L。
参照高修功[9]等所做脂肪酶特性研究实验，选择的重金属离子有：
Ba2+Mg2+AL3+Zn2+Ni2+Fe2+K+Cu2+Mn2+Cr3+Co2+Na+Ca2+以不添加的作为对照。
2.8酶学特性的的研究
2.8.1pH的稳定性与最适的pH
取酶液2mL与等体积的pH2-10的各种缓冲液混匀后，在40℃存放24h后，用0.5mol/L的NaoH或HclpH至7.5，测定残留酶活力。
2.8.2反应温度的稳定性及最适反应温度和时间
在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴60min,每隔15min取样一次，取样后立即冰浴。
3结果与讨论
3.1原始酶活的测定
表1原始培养基的酶活
时间/h
4℃
10℃
15℃
99
0
0.33
1
123
0.63
1.665
2.198
147
2.331
2.99
3.67
171
3.196
3.663
3.663
195
2.963
2.997
1.998
图一原始培养基的酶活
实验得出的结论是15℃、10℃、4℃依次达到最高酶活，且15℃不但在最短时间即147小时率先达到最高峰并且酶活比其他两个温度都高（如图一所示）。
3.2正交实验
表2脂肪酶筛选培养基
蛋白胨
氯化钠
氯化钙
吐温80
1
0.5
0
0.01
0.5
2
1
0.3
0.02
1
3
1.5
0.5
0.03
1.2
表2.1脂肪酶筛选培养基（%）正交实验表1
蛋白胨
氯化钠
氯化钙
吐温80
65h
89h
113h
161h
1
0.5
0
0.01
0.5
1.332
0.667
4.329
1
2
1
0
0.02
1
3.33
1.67
0.667
2.331
3
1.5
0
0.03
1.2
0.667
0.33
1
0.667
4
0.5
0.3
0.02
1.2
0.667
1
0.667
0.33
5
1
0.3
0.03
0.5
0.667
0.33
0
0.667
6
1.5
0.3
0.01
1
1.332
1.32
0.33
0
7
0.5
0.5
0.03
1
2.331
0.33
1
0.667
8
1
0.5
0.01
1.2
0
1
0.33
0.667
图二脂肪酶筛选培养基（%）正交实验酶活
图二脂肪酶筛选培养基（%）正交实验一的酶活
正交实验一得出的结论是一号培养基在113小时达到最高峰，并且远远高出其他的8个培养基（如图二所示）。
表3脂肪酶培养基筛选（%）2
蛋白胨
氯化钠
氯化钙
吐温80
1
0.2
0.1
0
0.5
2
0.5
0.2
0.01
0.7
3
0.7
0.3
0.015
0.1
表3.1脂肪酶培养基筛选（%）正交实验表2
蛋白胨
氯化钠
氯化钠
吐温80
酶活（U/mL）30℃150rpm40h
1
0.2
0.1
0
0.5
1.65
2
0.5
0.1
0.01
0.7
1.98
3
0.7
0.1
0.015
0.1
0.66
4
0.2
0.2
0.01
0.1
0.66
5
0.5
0.2
0.015
0.5
0.66
6
0.7
0.2
0
0.7
1.32
7
0.2
0.3
0.015
0.7
0.33
8
0.5
0.3
0.01
0.1
0.99
9
0.7
0.3
0.01
0.5
2.31
原
1
0.5
0.01
1
1.65
图三脂肪酶培养基筛选（%）正交实验表2
根据正交实验一的结果，将一号培养基作为中见量，继续做正交实验二，实验二可由图看出，9号培养基的酶活最高达到了2.31U/Ml（如图三所示）。
表4脂肪酶培养基筛选（%）3
蛋白胨
氯化钠
氯化钙
吐温80
1
0.5
0.2
0.005
0.4
2
0.7
0.3
0.01
0.5
3
1.2
0.5
0.02
0.8
表4.1脂肪酶培养基筛选（%）正交实验表3
蛋白胨
氯化钠
氯化钙
吐温80
酶活（U/mL）
30℃150rpm42h
1
0.5
0.2
0.005
0.4
0.99
2
0.7
0.2
0.01
0.5
0
3
1.2
0.2
0.02
0.8
1.65
4
0.5
0.3
0.01
0.8
0.33
5
0.7
0.3
0.02
0.4
1.32
6
1.2
0.3
0.005
0.5
0.66
7
0.5
0.5
0.02
0.5
0.66
8
0.7
0.5
0.005
0.8
1.65
9
1.2
0.5
0.01
0.4
2.97
图四脂肪酶培养基筛选（%）正交实验3的酶活
根据实验二中得出的最高酶活是9号培养基，将9号培养基作为中间量，再一次构建正交
实验三，实验得出最高酶活是9号培养基，酶活达到了2.97U/Ml（如图四所示）
表5脂肪酶培养基筛选（%）4
蛋白胨
氯化钠
氯化钙
吐温80
1
1
0.3
0.005
0.1
2
1.2
0.5
0.01
0.2
3
1.5
0.8
0.02
0.3
表5.1脂肪酶培养基筛选（%）正交实验表4
蛋白胨
氯化钠
吐温80
酶活（U/mL）
30℃150rpm40h
1
1
0.3
0.005
0.1
2.33
2
1.2
0.3
0.01
0.2
3.33
3
1.5
0.3
0.02
0.3
4
4
1
0.5
0.01
0.3
3.33
5
1.2
0.5
0.02
0.1
3.33
6
1.5
0.5
0.005
0.2
4.66
7
1
0.8
0.02
0.2
4
8
1.2
0.8
0.005
0.3
3
9
1.5
0.8
0.01
0.1
5.33
原9号
1.2
0.5
0.01
0.4
3.33
图五脂肪酶培养基筛选（%）正交实验4酶活
通过正交实验3得出的最高酶活是9号培养基，所以由9号培养基为中间量，继续做正交试验，正交试验4中得出9号培养基的酶活最高，达到了5.33U/Ml（如图五所示）。
表6脂肪酶培养基筛选（%）正交实验5
蛋白胨
氯化钠
氯化钙
吐温80
1
1.2
0.5
0.005
0
2
1.5
0.8
0.01
0.1
3
2
1
0.02
0.2
表6.1脂肪酶培养基筛选（%）正交实验表5
蛋白胨
氯化钠
氯化钙
吐温80
酶活（U/mL）30℃150rpm42h
1
1.2
0.5
0.005
0
3.961
2
1.5
0.8
0.01
0.1
2.542
3
2
1
0.02
0.2
2.065
4
1.2
0.02
0.01
0.2
2.743
5
1.5
0.01
0.02
0
4.623
6
2
0.005
0.005
0.1
6.991
7
1.2
0.02
0.02
0.1
1.982
8
1.5
0.005
0.005
0.2
3.421
9
2
0.01
0.01
0
3.332
原9号
1.5
0.01
0.01
0.1
4.931
图六脂肪酶培养基筛选（%）正交实验酶活
通过正交实验5得出结论，6号培养基的酶活最高达到了6.991U/Ml（如图六所示）。
3.3筛选最优培养基下产低温脂肪酶的最适温度
将实验筛选出的最适6号培养基与原始培养基对比培养，并且分别放置于4℃、15℃、30℃恒温箱中，测定脂肪酶活性。
图七-1不同温度下静置6号培养基的酶活
图七-2原始培养基在不同温度下的酶
由上实验可得出正交试验5中的6号培养基的酶活最高，正好在正交试验的中心，与原培养基的酶活相比较较为明显（如图七-1、图七-2所示）。
6号培养基酶活达到了6.991U/mL。
3.4不同体积装量的培养基的酶活比较
表8不同体积装量的设置
体积（mL）
40h
64h
88h
10
3.333
4.33
4.995
20
2.664
3.333
3.696
30
2.664
3.663
4.329
40
3.996
4.329
5.994
50
3.996
4.329
4.995
60
3.663
4.329
5.661
70
3.333
3.663
4.995
80
3.333
3.663
4.995
图八不同体积装量的培养基的酶活比较
实验结果表明，40mL体积装量的酶活相比较其他装量而言最高（如图八所示）。
3.5不同接种量培养基酶活的比较
图九不同接种量的酶活
实验表明接种量为10%时，酶活最高（如图九所示）。
3．6不同碳氮源对酶活的影响
图十-1不同碳源（原始培养基中加不同的碳源0.5%）的酶活
结果表明碳源加山梨醇远远高于其他的碳源（如图十所示）。
图十一-1不同氮源（原始培养基中加不同的氮源1%）的酶
实验表明，硫酸铵远远高于其他的氮源（如图十一-1）
3.7不同重金属对酶活的影响
不同的常用重金属离子，分别加入最优的培养基[8]，加入浓度为4mmol/L。
图十二不同的常用重金属离子的酶活
由未添加金属离子为参照，可以得出，Ba2+、Mg2+、AL3+、Fe2+、Mn2+、Ca2+等会提高酶的活性，而Mn2+、Ca2+的影响较大，Ca2+影响最大，活性也最高。
另一方面也可以看出Zn2+、Ni2+、Cu2+、Co2+对脂肪酶的活性有抑制作用。
其中K+、Cr3+与未添加的持平，说明这些重金属离子对酶活既没有抑制也没有促进的作用（如图十二）。
3.8酶学特性的的研究
3.8.1pH的稳定性与最适的pH
取酶液2mL与等体积的pH2-10的各种缓冲液混匀后，在40℃存放24h后，用0.5mol/L的NaoH或HclpH至7.5，测定残留酶活力。
图十三pH稳定性与最适pH的酶活
结果表明，此酶作用的最适pH为8.0，最具有稳定性（如图十三）。
3.8.2反应温度的稳定性及最适反应温度和时间
在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴60min,每隔15min取样一次，取样后立即冰浴。
表14反应温度的稳定性及最适反应温度和时间
温度/时间
15min
30min
45min
60min
30℃
4.83
5.994
5.661
5.328
40℃
4.995
5.328
4.995
4.67
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