低温脂肪酶的实验室发酵条件优化及酶学特性的研究.docx

1、低温脂肪酶的实验室发酵条件优化及酶学特性的研究低温脂肪酶的研究_试验室发酵条件优化及酶学特性的研究摘要：低温微生物脂肪酶由于具有低温高催化活性,耐有机溶剂以及对热敏感等特点, 有高效、耐热、作用周期短等优势, 其独特的低温适应机制是中高温脂肪酶无法替代的，在反应中不需要加热，这对于降低能量消耗，减少环境污染具有非常重大的意义，在食品、洗涤、制药、脂类加工、低温环境修复等方面有着巨大的应用潜力。其催化作用广泛性和巨大的工业化潜力，及它不需要辅酶等优势使它在生物合成和生物转化中具有诱人的前景。以一种海洋产电菌作为研究对象，研究其产生的低温脂肪酶的实验室发酵条件的优化及酶学特性的研究，其中实验室的发

2、酵条件的优化包括：优化橄榄油乳化剂，优化发酵培养液，优化培养环境，以及优化培养的最适合温度、pH、有利于产酶的重金属离子、有抑制产酶的重金属离子、最适的碳氮源等的研究。关键字：低温脂肪酶；发酵条件优化；酶学特征；优化The research of low-temperature lipaselaboratory fermentation conditions optimization and enzymology characteristicsZhujing FengleiSummary: Low temperature microbial lipase because of its low

3、temperature high catalytic activity, resistance to organic solvent and heat sensitive etc., have high efficiency, heat resistance, action cycle short, etc advantages, its unique cryogenic adaptive mechanism is of high temperature lipase irreplaceable, in the reaction dont need heating, this to reduc

4、e energy consumption, reduce the pollution of the environment is of great significance, in food, washing, pharmacy, lipid processing, low temperature environment restoration has great application potential. The catalytic action universality and the huge potential of industrialization, and it does no

5、t need coa etc advantages make it in biological synthesis and biological transformation has an attractive prospect. In a Marine production electric bacteria as the research object, and study the produce low-temperature lipase laboratory fermentation conditions of the optimization and enzymology char

6、acteristics of research, including the optimization of fermentation conditions of the laboratory include: optimization of olive oil emulsifier, optimize the fermentation culture solution, optimize the environment of training, as well as the optimization of training the most suitable temperature, pH,

7、 in enzyme production of heavy metal ions, inhibit enzyme production of heavy metal ions, the best carbon and nitrogen source etc. Keywords: Low-temperature lipase; Fermentation conditions optimization; Enzymology characteristics; Optimization 1 材料和方法1.1 菌种在羊粪中筛选出H11菌种，并且研究其低温脂肪酶的活性。低温脂肪酶具有极高的催化常数(K

8、。t)值，同时有较低和较稳定的米氏常数(K)值，其主要特征是具有较低的活化能和低温下的酶活力，在某些领域有着中温脂肪酶所不可比拟的优越性，在洗涤业、食品加工、生物制药、环境生物技术等领域有着广阔的应用前景1。1.2 仪器4高速冷冻离心机、可调温度的恒温箱、恒温水浴锅、高速组织破碎机、紫外灯无菌操作台。1.3 培养基液体发酵基本培养基：蛋白胨 1%、NaCl 0.5%、CaCl2.7H2o 0.01%、Tween80 1%、蒸馏水配制，Ph7.0以上。1.4 试验方法发酵液中脂肪酶酶活的测定采用经典的聚乙烯醇橄榄油乳化液方法2。1.4.1 反应底物乳化液的制备 称取 30 g 聚乙烯醇(PVA)

9、, 加 900 mL 水, 加热溶解, 冷却后用 6mol/L 氢氧化钠调至 pH 10.0, 过滤, 定容至 1 000mL。取上述 PVA 溶液 150 mL, 加入橄榄油 50 mL,用高速组织捣碎机搅拌 6 min, 8 000 r/min, 前后各3 min, 间隔 5 min, 液备用。1.4.2 甘氨酸- 氢氧化钠缓冲溶液的制备 配制0.2 mol/L 甘氨酸和 0.2 mol/L 氢氧化钠, 再根据所需 pH 值配制不同的缓冲液。1.4.3 0.05mol/L 氢氧化钠溶液的制备 称取 4.5g固体氢氧化钠溶于 1 L 水中, 用 0.1 mol/L 的邻苯。1.4.4 测定酶

10、液的制备 将产酶的菌接入液体培养基培养，酶液即取此菌的发酵液。1.4.5 酶活的定义 40,pH 7.5条件下, 每分钟催化脂肪水解产生 1 mol 脂肪酸的脂肪酶量定义为 1个脂肪酶国际单位(U)。1.4.6 酶活的测定 在三角瓶中加入一定量混合均匀的缓冲溶液和乳化液的混合液, 放入一定温度的恒温水浴锅中, 再加入酶液反应并计时, 一定时间后终止反应, 用 0.05 mol/L 氢氧化钠滴定游离出的脂肪酸, 同时做空白样( 先加终止剂, 后加酶液, 其余同样品操作)。水解释放出的脂肪酸以1%酚酞(加2滴)为指示剂,0.05NNaOH为滴定液进行滴定,出现微红色时为终点。 1.4.7 酶活的计

11、算 酶活 U= (V- V0)/t 50 n其中: V-样品所消耗碱的体积, mL;V0-空白消耗碱的体积, mL;t-反应时间, min;50-1 mL 0.05 mol/L 氢氧化钠的微摩尔数;n-稀释倍数。根据杨华3等的实验得出:采用缓冲液与乳化液混合后再吸取有利于减少误差, 同时对乳化液进行快速搅拌,有利于乳化液均匀分散, 提高了酶的反应速度和活力。1.5 实验步骤1.5.1 制作培养基先将培养基按照比例加入个元素并用蒸馏水配制，将pH调到7.0以上。接着做正交实验不断地找出最适的培养基。最后测定酶学特性的。 1.5.2 灭菌将培养液均装入100mL的三角瓶，每瓶装50mL,并且用高温

12、高压灭菌锅灭菌4：首先检查水位是否低于桶壁下面的两个半环，低了要加水，稍微淹没那个半环就行了，然后把要灭菌的东西放到锅内，盖上盖子，打开电源，115度30分钟就可以。灭好后带压力降到0后，拉开排气阀，开盖取出。1.5.3 接种将灭过菌的培养基取出，在30以下的温度，按10%的接种量在无菌间中接种。在接种中药避免污染。1.5.4 培养将接种后的三角瓶，放置于30,150rpm的摇床上，40h后测定酶活。通过正交试验设计对该菌株进行产酶条件进行优化5，得到最适产酶条件。1.5.5 测定将发酵液取出，倒入离心管中，用低温高速离心机1500rpm/min,离心5min。离心后将上清液用移液器吸取1mL

13、上清液，按照 1.4.6的方法测定。1.5.6 计算并画图按照1.4.7的方法计算，并且将数据绘图。2 主要实验操作流程及具体步骤原始培养基（测定酶活）正交实验（筛选出最适培养基）筛选最适碳氮源筛选最适重金属离子测定酶学特性（各项稳定性的测定）。2.1原始培养基酶活的测定蛋白胨 1%、NaCl 0.5%、CaCl2.7H2o 0.01%、Tween80 1%、蒸馏水配制，将pH调到7.0以上，在4、10、15分别测定酶活以筛选出在那个温度下酶活较高。2.2正交实验在上述原始培养基的不同温度培养下，找出最适的温度后，每个元素上下各加件0.5个单位的量做正交。正交表如下脂肪酶筛选培养基蛋白胨氯化钠

14、氯化钙吐温8010.500.010.5210.30.02131.50.50.031.2脂肪酶筛选培养基（%）正交实验表蛋白胨氯化钠氯化钙吐温8010.500.010.52100.02131.500.031.240.50.30.021.2510.30.030.561.50.30.01170.50.50.031810.50.011.2按照这种方法，不断的筛选，知道筛选出最高的酶活在正交实验的中心停止。2.3筛选最优培养基下产低温脂肪酶的最适温度将实验筛选出的最适培养基与原始培养基对比培养，并且分别放置于4、15、30恒温箱中，测定脂肪酶活性。以得出提高温度后此酶的最适温度。2.4 不同体积装量的培

15、养基的酶活比较将装量设置为每10mL为一个单位的装量测酶活，分别设置为10、20、30、40、50、60、70、80Ml,测其最高酶活的装量。2.5不同接种量培养基酶活的比较将原始培养基中分别接种2%、4%、6%、8%、10%的菌种，测定酶活，筛选最适的接种量。2.6 不同碳氮源对酶活的影响氮源和碳源是利用微生物发酵的主要原料，氮源和碳源的选择和配比直接影响酶的产生6。大部分微生物脂肪酶是胞外酶，合适的发酵条件对微生物脂肪酶的产生非常重要， 培养条件不仅影响酶的产生，还影响酶在胞内、胞外的比例7。在原始培养基中加入不同的碳源0,5%，选择的是：麦芽糖、果糖、葡萄糖、乳糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、

16、淀粉。在原始培养基加入不同的氮源1%，选择的氮源有：酵母膏、蛋白胨、硫酸钾、硫酸铵、牛肉膏。2.7不同重金属对酶活的影响不同的常用重金属离子，分别加入原始的培养基8，加入浓度为4mmol/L。参照高修功9等所做脂肪酶特性研究实验，选择的重金属离子有：Ba2+ Mg2+ AL3+ Zn2+ Ni2+ Fe2+ K+ Cu2+ Mn2+ Cr3+ Co2+ Na+ Ca2+以不添加的作为对照。2.8酶学特性的的研究2.8.1 pH的稳定性与最适的pH取酶液2mL与等体积的pH 2-10的各种缓冲液混匀后，在40存放24h后，用0.5mol/L的NaoH或Hcl pH至7.5，测定残留酶活力。 2.

17、8.2反应温度的稳定性及最适反应温度和时间在30、40、50、60、70、80水浴60min,每隔15min取样一次，取样后立即冰浴。3 结果与讨论3.1 原始酶活的测定表1 原始培养基的酶活时间/h410159900.3311230.631.6652.1981472.3312.993.671713.1963.6633.6631952.9632.9971.998图一 原始培养基的酶活实验得出的结论是15、 10、4依次达到最高酶活，且15不但在最短时间即147小时率先达到最高峰并且酶活比其他两个温度都高（如图一所示）。3.2 正交实验表2 脂肪酶筛选培养基蛋白胨氯化钠氯化钙吐温8010.500

18、.010.5210.30.02131.50.50.031.2表2.1脂肪酶筛选培养基（%）正交实验表1蛋白胨氯化钠氯化钙吐温8065h89h113h161h10.500.010.51.3320.6674.32912100.0213.331.670.6672.33131.500.031.20.6670.3310.66740.50.30.021.20.66710.6670.33510.30.030.50.6670.3300.66761.50.30.0111.3321.320.33070.50.50.0312.3310.3310.667810.50.011.2010.330.667图二 脂肪酶筛选培

19、养基（%）正交实验酶活图二 脂肪酶筛选培养基（%）正交实验一的酶活正交实验一得出的结论是一号培养基在113小时达到最高峰，并且远远高出其他的8个培养基（如图二所示）。表3 脂肪酶培养基筛选（%）2蛋白胨氯化钠氯化钙吐温8010.20.100.520.50.20.010.730.70.30.0150.1表3.1 脂肪酶培养基筛选（%）正交实验表2蛋白胨氯化钠氯化钠吐温80酶活（U/mL）30 150rpm 40h10.20.100.51.6520.50.10.010.71.9830.70.10.0150.10.6640.20.20.010.10.6650.50.20.0150.50.6660.7

20、0.200.71.3270.20.30.0150.70.3380.50.30.010.10.9990.70.30.010.52.31原10.50.0111.65图三 脂肪酶培养基筛选（%）正交实验表2根据正交实验一的结果，将一号培养基作为中见量，继续做正交实验二，实验二可由图看出，9号培养基的酶活最高达到了2.31U/Ml（如图三所示）。表4 脂肪酶培养基筛选（%）3蛋白胨氯化钠氯化钙吐温8010.50.20.0050.420.70.30.010.531.20.50.020.8表4.1 脂肪酶培养基筛选（%）正交实验表3蛋白胨氯化钠氯化钙吐温80酶活（U/mL）30 150rpm 42h10.

21、50.20.0050.40.9920.70.20.010.5031.20.20.020.81.6540.50.30.010.80.3350.70.30.020.41.3261.20.30.0050.50.6670.50.50.020.50.6680.70.50.0050.81.6591.20.50.010.42.97图四 脂肪酶培养基筛选（%）正交实验3的酶活根据实验二中得出的最高酶活是9号培养基，将9号培养基作为中间量，再一次构建正交实验三，实验得出最高酶活是9号培养基，酶活达到了2.97 U/Ml（如图四所示）表5 脂肪酶培养基筛选（%）4蛋白胨氯化钠氯化钙吐温80110.30.0050.

22、121.20.50.010.231.50.80.020.3表5.1 脂肪酶培养基筛选（%）正交实验表4蛋白胨氯化钠吐温80酶活（U/mL）30 150rpm 40h110.30.0050.12.3321.20.30.010.23.3331.50.30.020.34410.50.010.33.3351.20.50.020.13.3361.50.50.0050.24.66710.80.020.2481.20.80.0050.3391.50.80.010.15.33原9号1.20.50.010.43.33图五 脂肪酶培养基筛选（%）正交实验4酶活通过正交实验3得出的最高酶活是9号培养基，所以由9号培

23、养基为中间量，继续做正交试验，正交试验4中得出9号培养基的酶活最高，达到了5.33U/Ml（如图五所示）。 表6 脂肪酶培养基筛选(%)正交实验5蛋白胨氯化钠氯化钙吐温8011.20.50.005021.50.80.010.13210.020.2表6.1 脂肪酶培养基筛选(%)正交实验表5蛋白胨氯化钠氯化钙吐温80酶活（U/mL）30 150rpm 42h11.20.50.00503.96121.50.80.010.12.5423210.020.22.06541.20.020.010.22.74351.50.010.0204.623620.0050.0050.16.99171.20.020.0

24、20.11.98281.50.0050.0050.23.421920.010.0103.332原9号1.50.010.010.14.931图六 脂肪酶培养基筛选(%)正交实验酶活通过正交实验5得出结论，6号培养基的酶活最高达到了6.991U/Ml（如图六所示）。3.3 筛选最优培养基下产低温脂肪酶的最适温度将实验筛选出的最适6号培养基与原始培养基对比培养，并且分别放置于4、15、30恒温箱中，测定脂肪酶活性。图七-1 不同温度下静置6号培养基的酶活图七-2 原始培养基在不同温度下的酶由上实验可得出正交试验5中的6号培养基的酶活最高，正好在正交试验的中心，与原培养基的酶活相比较较为明显（如图七-

25、1、图七-2所示）。6号培养基酶活达到了6.991U/mL。3.4 不同体积装量的培养基的酶活比较表8 不同体积装量的设置体积（mL）40h64h88h103.3334.334.995202.6643.3333.696302.6643.6634.329403.9964.3295.994503.9964.3294.995603.6634.3295.661703.3333.6634.995803.3333.6634.995图八 不同体积装量的培养基的酶活比较实验结果表明，40mL体积装量的酶活相比较其他装量而言最高（如图八所示）。3.5 不同接种量培养基酶活的比较图九 不同接种量的酶活实验表明接种

26、量为10%时，酶活最高（如图九所示）。36 不同碳氮源对酶活的影响图十-1 不同碳源（原始培养基中加不同的碳源0.5%）的酶活结果表明碳源加山梨醇远远高于其他的碳源（如图十所示）。图十一-1 不同氮源（原始培养基中加不同的氮源1%）的酶实验表明，硫酸铵远远高于其他的氮源（如图十一-1）3.7 不同重金属对酶活的影响不同的常用重金属离子，分别加入最优的培养基8，加入浓度为4mmol/L。图十二 不同的常用重金属离子的酶活由未添加金属离子为参照，可以得出，Ba2+、 Mg2+、 AL3+ 、Fe2+ 、Mn2+、 Ca2+等会提高酶的活性，而Mn2+、 Ca2+的影响较大，Ca2+影响最大，活性也

27、最高。另一方面也可以看出Zn2+、 Ni2+、Cu2+、 Co2+对脂肪酶的活性有抑制作用。其中K+、Cr3+与未添加的持平，说明这些重金属离子对酶活既没有抑制也没有促进的作用（如图十二）。3.8 酶学特性的的研究3.8.1 pH的稳定性与最适的pH取酶液2mL与等体积的pH 2-10的各种缓冲液混匀后，在40存放24h后，用0.5mol/L的NaoH或Hcl pH至7.5，测定残留酶活力。图十三 pH稳定性与最适pH的酶活结果表明，此酶作用的最适pH为8.0，最具有稳定性（如图十三）。3.8.2 反应温度的稳定性及最适反应温度和时间在30、40、50、60、70、80水浴60min,每隔15min取样一次，取样后立即冰浴。表14 反应温度的稳定性及最适反应温度和时间温度/时间15min30min45min60min304.835.9945.6615.328404.9955.3284.9954.67