微生物限度方法学验证.docx

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微生物限度方法学验证

微生物限度检测方法学验证方案"N'C-?

&g0J*i/o;J'm8O+~5W3n:

o#s7e3R!

j6}"e（z*{9k3T+L7`'m0k;D.b!

I（g0`6Y文件编号：

P-AMV002-1101）o8E.g/w9V/w$n1f,j#W't"d0I"U7[,`3c'y6Q  U5?

:

G-c）N4s'c.Q;L4~8e2{（u*Y:

y*{$\1e*]$L.x$c&]:

K;e执行前批准签字页方案起草    XX    公司/岗位    签字    日期5A&K1r7E0O6E7_                方案审核    XX    公司/岗位    签字    日期.[;s-a"?

（X（o#}                

                4s）e3x!

?

&f/a2q8g方案批准    XX    公司/岗位    签字    日期

                3G;J;~6`9U5x8z目录/v;O!

I'K"y5c1t/f

1.    目的    4:

b#u3L-K!

p/K2x;c!

z,A:

t2.    X围    4

3.    责任者及职责    44.    验证简介    4$I0f3?

*e+\+A（Y/w&^#t8h5．验证过程    7）N'G5X*B#j5}2a/B4O6．结果判断    7

7．结论和建议    7

8．异常情况报告    7

9．再验证    79U.Y0c  I4^（l5R10．附件    8"d7b:

|0|,^1.    目的按照中国药典2010版（第一部），采用平皿法对龙加通络胶囊（成品）进行微生物限度检查，本方案是对此方法进行验证。

2.    X围龙加通络胶囊成品

3.    责任者及职责-[5U.i"\2c!

V&R部门    职责"N,U（H）N*V-f9i'k-?

3Y9XQC    起草并审核验证方案$V1X2c-N）Z7Y$s    进行验证试验的具体操作5j5Q$u&W+j#g  n.P5Z）i    完成验证记录中相关操作记录的填写（H+m+]3N&_"_.H    根据验证结果起草和审核验证报告QA    审核并批准验证方案和验证报告

    监督验证方案的实施

4.    验证简介"S&Q#\8X8f3B4U4.1    定义（c;t）T5U  I0gλ    CFU：

菌落数!

M,m-G5&M  `）p$q&xλ    供试液取样品10g，取pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液稀释至1g/ml（1:

10）。

3|"N5k6[8|.U  };Yλ    供试品对照组.F;\+{）l7e5S.C:

J取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

λ    试验组%k）s0Q+J0D7j取规定量供试液采用平皿法进行细菌、霉菌及酵母菌计数。

6B2u${;v&J0L3Y2C%z+dλ    菌液组6W5?

:

Z1Z,t0z8X*K6E测定所加的试验菌数。

样品组    样品溶液    菌悬液%{  G!

_;p"k0r8W-g!

U4s.z（50-100CFU）    稀释液    平均菌落数1[6Z/H3`6~（t%U6H6y（CFU/皿）2[%}/x6e-\"K;g4s供试液对照组    +    -    +    C供试液对照组试验组    +    +    +    C试验组）P.^%o%D$}:

k;e菌液组    -    +    -    C菌液组

4.2    菌悬液#S4h%X2Z$y1d  y8e9P/q2U4.2.1菌种及来源本次验证涉及到金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、枯草芽胞杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，其详细情况如下：

/l;t）_6|*M0r9Q）d#K）G,q培养基名称    名称及代号    编号    批号    代次    有效期至    来源$d6f/l9?

#|+R）\%j3Z.o7L1`营养琼脂培养基    金黄色葡萄球菌

    CMCC（B）26003        注释1    注释2    中国生物制品检定所

    大肠埃希氏杆菌

    CMCC（B）44102                

    枯草芽胞杆菌

    CMCC（B）63501                玫瑰红钠琼脂培养基    白色念珠菌

    CMCC（F）98001                

    黑曲霉,x'w!

T:

O-}"N%["c+K    CMCC（F）98003                备注    检查人：

        复核人：

          检查日期：

        5N"B;x7{+q4~#u:

i4.2.2菌液制备（^0W  t#p（S'^接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30~35℃培养18~24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，20~25℃培养24~48h。

上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50~100CFU的菌悬液。

6y-A6a8j0Z*f接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28℃培养5~7天，加入3~5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100CFU的孢子溶液。

（`'D!

\3\0A"?

:

v9?

）_4.3    培养基及稀释液

4.3.1培养基和稀释液的名称培养基：

营养琼脂培养基（121℃15分钟）、玫瑰红钠琼脂培养基（121℃15分钟）4A4K/X3V$Q7S+s稀释液：

pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液（121℃30分钟）;T-e$u4S'V,x4.3.2培养基灵敏度复核

    培养基灵敏度复核，参见《培养基的灵敏度检查操作规程》，结果见附件1。

4.4    供试液的制备  D*o"a'P（H3G5g9\4.4.1样品名称及数量样品名称    批号    取样量龙加通络胶囊（成品）        10g

        10g

        10g6x0^&U9~!

A!

o3b:

H6o0?

8U4.4.2样品预处理方法5D#Y0X6M）c4R,i&H取样品10g，取pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液稀释至1g/ml（1:

10）。

4.5    实验用品λ    实验设备  U;m6C6P（N名  称    型  号    规格    厂  家    有效期低温培养箱        注释3        生化培养箱        注释3        洁净工作台        ——        生物安全柜        ——        水浴锅        ——        备注    +{9W,P）q1S$^'N检查人：

        复核人：

          检查日期：

        λ    实验中使用培养基名  称    规格    厂  家营养琼脂培养基        玫瑰红钠琼脂培养基        硫乙醇酸盐流体培养基        +c;V/w5E5T:

%d1U改良马丁培养基        8t;o4R9P$E&O8~4h7N营养肉汤培养基        ）U/C）~（_  x4~（w:

d+c（?

-}改良马丁琼脂培养基        -?

0V;U-y8j9U#g.r$?

  d.}8~:

%`4.6    参考文件中国药典2010版第一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法8t&n6F2n9d&o:

K9y2k9S%\1a《验证管理规程》《超标数据调查及处理管理规程》;}8W&X%d3q）Z$s《异常情况管理规程》《取样管理规程》2b/d.z.T/z7[!

_《培养基管理规程》《培养基的灵敏度检查操作规程》《菌种复苏、传代及菌悬液制备操作规程》《微生物限度检查操作规程》-P-I5t&v#V*m5．验证过程,E）r#b）g:

T8k#|5.1试验次数：

验证试验应进行3次独立平行实验

5.2试验器具准备试验前，将先前已准备的适量稀释液和培养基灵敏度复核检查合格的培养基、检品和无菌的玻璃平皿（Φ90mm）一同放入无菌室的传递厨内，打开送风和灭菌按钮。

用当月使用的消毒剂对无菌室进行消毒，并擦拭超净台，打开超净工作台风机及紫外灯灭菌1小时以上。

5.3测定

5.3.1  按照无菌室更衣程序更衣，进入无菌室。

5.3.2  用70%酒精棉球擦拭工作台面与待测品表面。

"x3f1n$H+d#{1a5S1A9w）[5.3.3  在无菌环境下，取4.2.2项下配制的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml，分别注入无菌平皿中，立即将保温在水浴锅中（45℃）无菌营养琼脂培养基倾倒入内，每个平皿约20ml，每株试验菌平行制备2个平皿。

待培养基混匀、凝固后准备培养计数；取4.2.2项下配制的白色念珠菌、黑曲霉各1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注保温在水浴锅中（45℃）无菌玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，待培养基混匀、凝固后准备培养计数；以上作为菌液组。

2g  o-b7L:

K#W3n%o4r5.3.4  无菌操作取4.4.2制备的预处理后的样品，加入至4个无菌平皿中，每个加入1.0ml。

将保温在水浴锅中（45℃）无菌营养琼脂培养基和无菌玫瑰红钠琼脂培养基培养基分别倒入2个无菌平皿中，每个约20ml。

作为供试液对照组。

:

C,n0H;z6p+?

5.3.5  无菌操作取4.4.2制备的预处理后样品，加入至10个无菌平皿中，每个加入1.0ml，同时将4.2.2项下配制的5种菌液每种加入到2个已加入样品的平皿中，每个平皿加入1.0ml。

将保温在水浴锅中（45℃）无菌营养琼脂培养基和无菌玫瑰红钠琼脂培养基培养基按4.2.1项下规定，加入到平皿中，每个约20ml。

作为对照组。

  T6G-w&O%|4{$Z!

h.S5.3.9  将5.3.3-5.3.5制得的平皿按下表进行培养，结果记录在附件2上。

.C（}+]9n）j*F&^%I0t%[培养基    培养温度    培养时间    菌种名称'x9U3[4[!

u"H$D%y6D营养琼脂培养基    30-35℃    3天    金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌+l2e-}4S/d3i7|+v玫瑰红钠琼脂培养基    23-28℃    5天    白色念珠菌、黑曲霉

6．结果判断

  在三次独立的平行试验中，试验组的菌落数回收率K（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%。

若三次独立试验中任何一次K低于70%，应改进试验方法以消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

试验组的菌落数回收率K=  ×100%'c#Q$k'x9D&I（X9U7．结论和建议）c-q*z;E,D8D（m&{此项中将根据实际测试的结果给出结论，有异议的将给出建议。

%R#e9U;d$S2Z  c%n:

L&H8．异常情况报告4r;G,?

6j9^对验证中发现的任何异常/不合格情况应按照《异常情况管理规程》执行。

9．再验证9~:

`:

T8S:

I,q如该验证的试验方法或试验相关试剂发生改变，需再验证。

%X9d.c,M*J8K"I0e9q'^10．附件

10.1附件1  培养基灵敏度检查记录  T0H,o0K6e  S*m10.2附件2  微生物方法学验证记录8u'l%{0K$L$d）|  A*Y10.3附件3  培养基厂家报告3E8I1^+H（t9R1?

:

h6f9E10.4附件4  菌种报告#v7A*t/F:

$B3~执行后批准签字页$|:

}2O*e*C!

b:

\:

b*k记录起草    XX    公司/岗位    签字    日期7U"S"Z,b:

A5s/c5C9S,D                （A!

l3?

3^;P  R&v&S"r.O4T.j8Q2f记录审核    XX    公司/岗位    签字    日期5y-M/y&z5U2u!

_1r6U6W,N2U%n                                0X5A8T'Q+d4w5w'c+C5Y%G,y  W7Z记录批准    XX    公司/岗位    签字    日期

            "M,k2]+Q!

[,j7S!

M5H0J+j）z$D*~1h）~  k2]2D0J）e（Y  J4z0t&U）u5m4G%?

8{）l7d"M!

L4A!

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J*m#?

3m9l"b4Y）B控制菌检测方法验证方案$|+A（w#f  Y"L'J2_%[（_-e+d2G.D&a9S!

V,m!

_4R1o*^8i（k4P6T%j  n#H#h#|0^,h,V#W"g*~4z%u1o%f"v.t"^!

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O*]*q-I,X"w5J0E7d#A1O,\1t;R.y（}&A）u文件编号：

P-AMV003-1101!

i#U-H'L+U:

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W#E:

y（y*t8Y8k9d3T"O3j;\2J0S/F9R"K:

H"{+A/C5t9j:

V0G-Q0y:

R8]5`）G;n%u$h'O1m*o.S4O%`%O9k"R5b9N*o  v0A/l执行前批准签字页方案起草

    XX+Y$k8?

6w5Z5Y.[/X5s8~    公司/岗位

    签字;D;a.[5|&h'B:

T!

N/e    日期                方案审核

    XX"?

-I2w4I,J;C,w    公司/岗位

    签字

    日期

                方案批准'r:

3n/t7B#N  y    XX2]1n*i（x*C2A:

z;A（U    公司/岗位

    签字

    日期2G1O%J.h#s4S#_8['n*k1\.J*h"]$Y#[4J  y#V$`5V                ;T0?

%H*P!

Z-a's0E;C#P  e6|  u0R!

b2l;T!

U#t-a+c9n&l7x%D0l8L8[2]%l）M/[+i2  e"+]"O0w4`6z;i/K'I,`（}1W3S!

}3w4l2d.d）T6r%J7m目录6]+T2W:

G  z

1  目的    4/~7{$U1g9K'B.U2  验证简介    4,J4a'f%h1Z:

S-J4C+j3d3  环境设备及物料    4

4  参考文件    51D!

M$x8d!

D/W/D5  验证过程及可接受标准    5

6  结果评估    8

7  异常情况及变更：

    8

8  结论和建议    8!

H6[6k&z,_'|'%Q%C$W9  再验证周期    810  附件清单    8

11  变更历史    9;{;E（m/X3y  D*{:

~3Y9N/J5s0g1v5r1^;C8a0n:

]1  目的本验证的目的是根据中国药典2010版第一部，对进行大肠埃希菌和沙门菌检测的样品的进行方法验证。

2  验证简介5u/R0D&S6j$B.H2.1  本验证是对控制菌检测方法进行验证。

其中----胶囊（成品）检测的控制菌为大肠埃希菌，空心胶囊检测的控制菌为沙门菌。

2.2  本验证所采用的方法依据2010版中国药典一部中控制菌验证检验方法。

3  设备和物料

3.1  验证设备名称    型号    设备编号    有效期    厂家1\-t:

d&K/_#r%t9Q:

I生化培养箱（30-35℃）                生化培养箱（23-28℃）                洁净工作台            ——    备注    检查人：

          复核人：

          检查日期：

          .-c&Y;N（G!

v's4g）h3.2  验证所用物料+?

1h,v:

v!

_+_,_（]（w:

E+P名称    厂家    批号胆盐乳糖培养基        

4-甲基伞形酮葡糖甘酸培养基（MUG）        营养肉汤培养基        四硫磺酸钠亮绿培养基        9t4?

4L（q'h8`胆盐硫乳琼脂培养基        曙红亚甲蓝琼脂培养基        %A'K,H2z6F8N5]三糖铁琼脂培养基        9X0B1A0v"E7x1U6?

'L5_KH2PO4        ,i4q1v0f（[$w6c0\Na2HPO4        -L6l$r1p0C）B/PNaCl        蛋白胨        &c,|  R$N1p;f'C#B+J（`8c对二甲氨基苯甲醛        'z:

j/z8[（S9l+|!

J/\95％乙醇        :

H!

y#?

9D/A*h2_浓盐酸          },I6J*D'M!

h（N  k备注    2g+m*k.F#F&^+|$u检查人：

          复核人：

          检查日期：

            F4z6V（M*I（y;I$q3.3  样品样品包括-------络胶囊（成品）和空心胶囊；按照下表中所列样品名称进行3次独立平行试验，进行3次独立取样，取样方法参见QC004《取样管理规程》。

1W.V$A9W8|样品编号    样品名称    取样量/批    取样批号8e'|'I3Z"B/]01    ****胶囊（成品）        #K'd）N;M/^;S9Q;H7^            

02    空心胶囊        

            ,`,x0E"s/t5T4U            4Z.p）k&N0[7I5U备注    %i  r6{'P+g3C检查人：

          复