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异亮氨酸代谢调控

L-异亮氨酸的发酵调控研究进展

摘要：

L-异亮氨酸作为必须氨基酸之一，广泛应用于医药，食品，饲料等领域。

发酵法是目前生产L-异亮氨酸的最主要方法。

文章从L-异亮氨酸的简介，发酵过程调控，生物合成途径及调控，代谢工程等方面对发酵法生产L-异亮氨酸研究进展进行了综述。

关键词：

L-异亮氨酸,发酵调控，代谢工程

1L-异亮氨酸简介

L-异亮氨酸属于中性氨基酸，是人体必需的八种氨基酸之一，它与亮氨酸、缬氨酸统称为支链氨基酸。

因为它特殊的结构和功能，在人体新陈代谢中占有重要作用[1]。

人体若长期缺乏L-异亮氨酸，将影响机体的生理功能，导致代谢紊乱，抵抗力下降等。

1.1L-异亮氨酸的理化性质[2]

名称：

L-异亮氨酸

化学名：

β-甲基-α-氨基戊酸

分子式：

C6H13NO2

相对分子质量：

131.17

等电点（pI）：

6.02

熔点：

285℃-286℃（分解）

比旋光度：

[α]20D=+41.1°（6mol／LHCl，C=4），温度系数：

0.09

含氮量：

10.68％

呈味：

苦味

结晶形状：

从乙醇中结晶，白色菱形叶片或片状晶

溶解性：

溶于水，难溶于乙醇、乙醚，几乎不溶于其它有机剂在水中溶解度随着温度升高而增大

1.2L-异亮氨酸的用途

1.2.1食品方面

L-异亮氨酸作为人体必需氨基酸，为人体不能合成的氨基酸，需从外界食物中获取。

成人每天需从外界食物中摄取20mg/kg的L-异亮氨酸，人体若缺乏L-异亮氨酸。

会引起食欲不振，贫血，体质下降等功能性问题。

它作为重要的氨基酸类营养强化剂，大量用于食品营养强化方面[3]。

L-异亮氨酸具有强化肝功能，缓解肌肉疲劳等作用，将其添加到饮料中生产氨基酸饮料已经得到广泛应用。

目前许多公司研发了氨基酸能量饮料，且国内外市场需求也在不断增长。

1.2.2医药方面

在医药方面，L-异亮氨酸主要用于配置治疗型复合氨基酸输液以及营养型氨基酸输液，尤其在高支链氨基酸输液及口服液的生产方面应用较广，对维持婴儿，儿童，成人的生长发育有重要作用，对治疗各种肝脏疾病，肾脏病有显著疗效。

1.2.3饲料方面

L-异亮氨酸作为动物必须氨基酸之一对其生长发育有特殊的作用，涂永锋等发现有力异亮氨酸对于鲫鱼具有促生长的作用[4]。

因为它具有一些特殊的生理功能，比如可以调节蛋白质的代谢，调节机体神经功能，增强机体免疫性能，改善动物泌乳，所以将其作为添加剂大量用于动物饲料生产中[5]。

1.3L-异亮氨酸市场简介

国际上，L-异亮氨酸目前合计年产量400-500吨。

主要以日本为主，占垄断地位。

厂家有味之素、协和发酵和田边制药三家，均以发酵法生产，产酸率达30-35g/L，提取率60％-70％。

鉴于L-异亮氨酸生产的高难度，L-异亮氨酸一直是高价氨基酸，国际市场医药级价格高达60-80美元／kg。

国内售价由于日本向中国倾销而逐年下降，目前医药级价格约400元／kg[6]。

我国的L-异亮氨酸发酵研究始于20世纪70年代，20世纪90年代初正式工业化生产。

目前，传统一次投糖分批发酵大罐产酸率为20-22g/L，总得率为40-50％。

国内L-异亮氨酸产量约为100吨。

与日本相比，我国的L-异亮氨酸生产水平还很低下。

1.4L-异亮氨酸生产方法

L-异亮氨酸生产方法有提取法、合成法和生物发酵法三类。

但目前在工业生产上实施的只有发酵法[7]。

1.4.1提取法

提取法是应用生化分离技术从混合氨基酸中分离提取L-异亮氨酸，该方法操作简单，生产周期短，分离效率高，但成本高且下游分离处理过程中与L-异亮氨酸难分离，因此未能应用于工业生产中[8]。

1.4.2合成法

合成法包括化学合成和化学合成与酶法相结合两种方法，由于异亮氨酸存在四种旋光异构体，合成法多数情况下得到的为外消旋体，需要经过外消旋拆分，步骤多，反应复杂，有许多副产物，造成生产成本高，所以难以廉价制造出纯度高的L-异亮氨酸，也没有应用于工业化生产[9]。

1.4.3微生物发酵法

发酵法是利用微生物的自身代谢，合成并大量积累L-异亮氨酸，由于发酵法具有反应条件温和，成本低，环境污染小以及容易实现大规模工业化生产等优点，目前在工业上广泛应用[6]。

发酵法包括添加前体物发酵法和直接发酵法两种。

添加前体物发酵法，是以葡萄糖等作为碳源和能源，添加一些特定的前体物，如α-羟基丁酸，α-氨基丁酸等，再利用微生物的作用将这些物质转化为L-异亮氨酸[10]，由于前体物质稀少且价格较高，目前很少应用。

直接发酵法是利用微生物有合成自身代谢所需氨基酸的能力，通过对特定的菌种进行处理，包括诱变处理及构建基因工程菌，选育营养缺陷型或氨基酸结构类似物突变株，敲除代谢途径中的特定基因解除菌体代谢途径中存在的反馈抑制和反馈阻遏，从而过量积累L-异亮氨酸。

目前国内外生产厂家都采用此法来生产L-异亮氨酸，直接发酵法使用的生产菌株包括黄色短杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳糖发酵短杆菌，大肠杆菌等诱变选育而来的[6]。

2L-异亮氨酸菌种选育

2.1诱变育种

宋文军等[11]经硫酸二乙酯诱变处理，定向选育出目的突变株。

采用均匀设计法考查了发酵培养基中几种主要成分对L-异亮氨酸发酵的影响，通过软件获得最佳发酵培养基配比，并对该目的突变株的摇瓶发酵条件进行了研究。

在最佳条件下该菌株可产L-异亮氨酸20.2g/L。

沈加彬等[12]以黄色短杆菌BF420为出发菌株，经过紫外线和亚硝基胍（NTG）复合诱变处理后，获得一株甲硫氨酸缺陷（Met-）及抗α-氨基丁酸（α-AB）的L-异亮氨酸产生菌BM2610，该菌株在未进行优化的发酵条件下能够积累L-异亮氨酸的量为7．12g/L，比出发菌株BF420提高122．5％。

李进等[13]以栖糖蜜棒杆菌为出发菌株，根据代谢控制发酵原理，经硫酸二乙酯和60Co诱变处理，定向选育出一株L-异亮氨酸产生菌。

在优化的培养基和发酵条件下积累L-异亮氨酸19.2g/L,最高时可达21.3g/L。

2.2原生质体融合技术

宋文军等[14]以黄色短杆菌和谷氨酸棒杆菌为出发菌株，应用原生质体融合技术，定向选育出一株L-异亮氨酸高产菌，该菌株能在发酵液中积累,-异亮氨酸，浓度可达23.8g/L。

2.3基因工程菌

基因重组技术是在细胞体外进行DNA拼接、重组的技术，它能创造新的物种，能给予微生物新的机能，使微生物生产本来不能合成的物质也能合成或者增强它原有的合成能力。

在氨基酸产生菌的育种上应用这种新技术主要起后者的作用。

Komatsubara等[15]采用L-异亮氨酸产生菌F803的染色体DNA，通过鸟枪法克隆，分离得到重组质粒pTKl20。

此重组质粒在pLG339上含有7．5kb插入子，并携带包括ilvA2突变的4种ilv基因。

质粒pIKl20引入野生型菌株Mu910和菌株T-803的细胞中。

引入pTKl20后显著的提高了苏氨酸脱氨酶和乙酰羟基酸合成酶的活性。

采用Thr重组质粒以提高L-异亮氨酸的产酸率。

得到携带pSK301的菌株T803，在48h或72h添加蔗糖，其重组菌株T—S03（pSK301）可产L-异亮氨酸32g/L。

Sahm等[16]为获得谷氨酸棒杆菌的L-异亮氨酸高产菌株，对L-异亮氨酸的生物合成途径中相应的酶进行了基因强化，即通过基因克隆增加基因剂量。

以赖氨酸高产菌株为出发菌株，强化已经对反馈调节不敏感的高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶的相应基因，打通从天冬氨酸半醛到高丝氨酸的通道，结果大量积累苏氨酸。

然后将失去反馈调节作用的苏氨酸脱氨酶进行基因强化，苏氨酸被转化成L-异亮氨酸，产量可达30g/L。

3L-异亮氨酸发酵过程工艺控制

3.1营养条件控制

3.1.1碳源和氮源的影响

发酵培养基的成分和配比是决定菌体代谢的主要因素，对异亮氨酸的产量及提取率有很大的影响。

在异亮氨酸发酵中，葡萄糖是最主要，最常见的碳源，糖蜜也可作为碳源。

氮源一般以硫酸铵，尿素为无机氮源；玉米浆，豆饼水解液作为有机氮源。

生物素浓度是异亮氨酸发酵生产中的关键因素。

在发酵中，培养基浓度太大，增大了培养基的渗透压。

进而影响微生物的生理代谢，不利于L-异亮氨酸的代谢合成，不利于发酵生产。

因此，选择合适的碳氮源以及其浓度对发酵生产有重大的影响。

张伟国等[17]研究了发酵培养基对L-异亮氨酸发酵的影响，得到选用玉米浆和葡萄糖对发酵产酸的影响浓度玉米浆为20ml／L、葡萄糖为140g／L较好。

3.1.2无机盐离子的影响

无机盐离子是微生物生命活动不可缺少的物质，它是细胞成分和酶的促成部分的重要组成，还作为酶的抑制剂或激活剂。

常见的金属离子如Na+主要起调节培养基渗透压的作用，Mg2+，K+，Mn2+常作为酶的激活剂。

微生物对无机盐的需要量很少，但无机盐对微生物的生长代谢是必不可少的。

陈宁等[18]利用SAS软件，采用PB试验设计法及响应面法分析，对发酵培养基进行优化，确定了最合适的碳源，氮源，无机盐的浓度，优化后的发酵培养基使菌株的L-异亮氨酸产率提高了22.52%。

3.1.3生长因子的影响

生长因子是一类对微生物正常代谢必不可少却不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物。

它的需要量一般很少。

在配制培养基时，可通过加入富含生长因子的原料如酵母膏、玉米浆、麦芽汁、豆饼水解液等起作用。

3.2环境条件的控制

3.2.1温度和pH值的影响

pH对异亮氨酸的影响主要是酶活性和菌的代谢能力。

控制pH值有流加尿素和流加氨水2种方法。

发酵前期pH控制在6.4-6.6，中后期控制在6.6-6.9，发酵过程中pH不能超过7.0，超过7.0将严重影响发酵水平。

温度影响菌体生长和产物积累。

L-异亮氨酸属于生长部分偶联型，菌体生长开始达到一定程度后才开始产生异亮氨酸，因此菌体生长最适温度和异亮氨酸合成最适温度是不同的。

3.2.2溶氧的影响

L-异亮氨酸是由α-酮基-β-甲基戊酸在支链氨基酸转氨酶作用下合成的，L-异亮氨酸的合成中全部碳元素都来源于丙酮酸，所以在L-异亮氨酸的发酵中需要选择高效的把糖转化为丙酮酸的培养条件。

而丙酮酸的前体物是糖酵解途径的磷酸稀醇式丙酮酸。

因此，在L-异亮氨酸发酵中氧的供给是至关重要的控制条件。

供氧过高，L-异亮氨酸合成受阻。

白亚磊等[19]研究表明：

高溶氧浓度有利于菌体生长，15%溶氧浓度下产酸速率高且维持的时间长，有利于L–异亮氨酸的积累．为此提出了分段控氧模式：

在菌体生长期，溶氧浓度控制为25%；在产酸稳定期，溶氧浓度控制为15%．在此溶氧控制模式下，在30L发酵罐上补料分批发酵60h，L–异亮氨酸产量可达31.8g/L，糖酸转化率可达18.3%，且乳酸、丙氨酸等副酸明显减少。

3.3培养方式

L-异亮氨酸生产工业上多采用分批发酵方式，高浓度初糖往往会抑制菌体产酸能力，同时使糖酸转化率下降，而补料分批培养则能较好解决这一问题。

补料工艺可使生产菌的自溶期被推迟，生物合成期得到延长，可维持较高的产物增长幅度和增加发酵的总体积等，从而使产量大幅度上升。

补料的原则在于控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。

宋文军[20]以摇瓶分批发酵优化条件为基础，进行了不同补糖方式的摇瓶分批发酵研究，结果为初糖浓度在80g／L，于发酵过程第24，32，60和80h分4次补加补料液，发酵96h时，产L一异亮氨酸为21.96g／L，比摇瓶分批发酵提高了7.29％，糖酸转化率达15.34％。

4L-异亮氨酸代谢途径调控

4.1L-异亮氨酸生物合成途径

以葡萄糖为原料合成L-异亮氨酸涉及到EMP/HMP/TCA/乙醛酸循环、伍德-沃克曼反应，以及苏氨酸合成水平和分支链氨基酸合成水平的调节控制，其生物合成途径如下图所示[21]。

4.2L-异亮氨酸生物合成代谢调控

L-异亮氨酸生物合成的基本调节机制有反馈控制盒合成途径分支点处的优先合成。

在其生物合成的主流代谢中，有5个关键酶控制其强度，它们分别受不同的代谢产物的反馈调节，活化这些酶有利于异亮氨酸的生物合成。

（1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PC）PC是介于合成和分解代谢定向途径的第一个酶，受天冬氨酸、苹果酸的反馈抑制，受天冬氨酸。

（2）天冬氨酸激酶（AK）AK受苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制。

通过选育赖氨酸营养缺陷型积累中间代谢物苏氨酸，从而使终产物Ｌ-异亮氨酸积累。

（3）高丝氨酸脱氢酶（HD）HD受苏氨酸的反馈抑制和蛋氨酸的反馈阻遏。

通过选育苏氨酸结构类似物抗性突变株、蛋氨酸结构类似物抗性变株，或蛋氨酸缺陷型可活化该酶。

（4）苏氨酸脱氨酶（TD）TD是异亮氨酸生物合成途径的第1个限速酶，受异亮氨酸的反馈抑制,其抑制率依赖于苏氨酸的浓度。

筛选异亮氨酸结构类抗性突变株可以遗传性的解除异亮氨酸对苏氨酸脱氨酶的反馈抑制，有利于积累L-异亮氨酸。

（5）乙酰羟酸合成酶（AS）　AS是异亮氨酸合成途径的第2个限速酶，受缬氨酸的反馈抑制以及缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的多价反馈阻遏。

筛选缬氨酸结构类似物抗性突变株来活化该酶。

　　通过上述有关Ｌ-异亮氨酸的生物合成途径及调节机制分析可以看出，选育Ｌ-异亮氨酸高产菌株应：

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶固定CO2能力强；天冬氨酸合成酶，天冬氨酸激酶，高丝氨酸脱氢酶，高丝氨酸激酶，苏氨酸脱水酶以及乙酰羟酸合成酶活力要高，二羟吡啶－２－６－二羧酸合成酶以及琥珀酰高丝氨酸转琥珀酰酶活力微弱或丧失，谷氨酸脱氢酶活力弱[22]。

5代谢工程在L-异亮氨酸生物合成中的应用

代谢工程是利用基因工程技术改造细胞并达到改善细胞性能的一门新技术。

它把重组DNA技术和分子遗传学手段相结合，对细胞进行目标确定的基因操作，改变其原有的调节系统，实现过量积累目标产物的目的。

应用代谢工程生产L-异亮氨酸的策略大致有以下几种。

5.1强化代谢主流

通过对L-异亮氨酸的代谢途径进行途径分析,引导最优途径,使代谢途径中的关键酶过量表达,敲除不必要的基因,在不破坏整个代谢途径的情况下来提高L-异亮氨酸的产酸量。

通过切断代谢支路不仅可以使合成途径中某一步骤发生缺陷,致使终产物不能积累,从而遗传性地解除了终产物的反馈调节,使得中间产物或另一分支途径的末端产物得以积累,而且还可以节约碳源,使分支酸更多的流向L-异亮氨酸的合成方向,如切断蛋氨酸和切断赖氨酸的合成支路,使代谢流更加畅通,造成异亮氨酸的前体物苏氨酸大量积累,从而使异亮氨酸的积累量提高;切断亮氨酸的合成支路,仅可以解除亮氨酸等分支链氧基酸对生物合成酶系的多价阻遏,还可以避免L-异亮氨酸生产中的副产物正缬氨酸和高异亮氨酸的生成,从而有利于目的产物L-异亮氨酸的积累[23]。

5.2增加前体物质的供应量

由异亮氨酸的代谢途径可以看出，苏氨酸是异亮氨酸的前体物。

为了大量积累异亮氨酸，除了设法解除对异亮氨酸生物合成的反馈调节外，还应解除对其前体物苏氨酸生物合成的反馈控制，增强苏氨酸的生物合成能力，从而提高异亮氨酸的积累量。

已知苏氨酸和异亮氨酸生物合成途径的关键酶高丝氨酸脱氨酶（HD）受苏氨酸的反馈抑制，为了解除苏氨酸对HD的反馈调节，可选育高丝氨酸脱氨酶抗性突变株，使异亮氨酸产量提高[24]。

Guillouet等[25]直接用苏氨酸高产菌株来构建L-异亮氨酸高产菌株，将含有高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸脱水酶的编码基因的质粒pAPE20转化到苏氨酸高产菌株C．glutamicumATCC21799中，强化了L-异亮氨酸代谢途径，同时也增加了苏氨酸的供应量，使碳流向异亮氨酸生物合成的方向，结果在4L发酵罐中异亮氨酸最高积累可达40g／L。

5.3增加限速步骤酶编码基因的拷贝量

L-异亮氨酸是从L-苏氨酸转化而来,，其中苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合成酶是代谢途径的关键酶，因此可以利用重组技术克隆关键酶苏氨酸脱氨酶或（和）乙酰强酸合成酶的基因，再把它连接到合适的载体上，然后通过转化等方法，把重组质粒的遗传物质传递到受体菌中进行无性繁殖，随着质粒拷贝数的增加，酶基因的表达量加大，关键酶的活性提高，L-异亮氨酸的合成能力得到加强，使产酸量提高。

Colon等[26]利用PCR技术克隆苏氨酸脱氨酶基因，连接到质粒上构建成pGC77，增加苏氨酸脱氨酶的拷贝数，过量表达苏氨酸脱氨酶，使酶的活性增大，提高异亮氨酸的产量。

徐庆阳等[27]以L–异亮氨酸生产菌C.glutamicumYILW基因组为模板克隆高丝氨酸脱水酶基因，将高丝氨酸脱水酶基因与表达载体pXMJ19连接构建出重组质粒pXMJ19-hom，再转入C.glutamicumYILW构建C.glutamicumYILW（pXMJ19-hom）。

结果显示，重组酶的表达使菌株对L–苏氨酸的抗反馈抑制作用得到加强，最终L–异亮氨酸和L–蛋氨酸积累量分别为36.5g/L和2.8g/L，分别较出发菌株提高7%和33%，同时L–赖氨酸合成量仅为2.1g/L，较出发菌株降低了63.8%。

LianghongYin等[28]在谷氨酸棒杆菌中共表达突变的抗反馈抑制的苏氨酸脱水酶和乙酰羟酸合成酶，产量与野生菌相比提高131.7%，可以达到30.7g/L。

6研究展望

L-异亮氨酸的生产在相当长的一段时间内达不到工业化生产的要求，主要原因是其代谢途径长，分支路代谢多导致主代谢流也比较弱，而且异亮氨酸的合成需要多种关键前体物，若想进一步提高异亮氨酸的积累量就必需设法切断其他分支途径的代谢流，增强合成其前体物的代谢流。

随着人们对各种工业微生物基因组更多的了解，代谢途径分子生物学研究的不断积累，代谢工程中代谢物流的分布与控制和新的代谢途径的设计等方面的研究取得巨大的进展，将为高产异亮氨酸基因工程菌的构建提供新的思路。

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