浅论CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响.docx

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浅论CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

浅论CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

【摘要】目的应用反义RNA技术特异性下调结缔组织生长因子（CTGF）的表达，观察其对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和迁移的影响，并探讨其作用机制。

方法培养原代VSMC，使用脂质体法将携带有CTGF反义RNA的真核表达载体（+）-CTGF（-）转染入VSMC，WesternBlot技术观察CTGF的表达以及蛋白激酶B（Akt）的活性，MTT法及划痕试验测定VSMC增殖和迁移情况。

结果（+）-CTGF（-）转染VSMC后CTGF的表达明显降低，Akt的活性降低，VSMC的增殖和迁移受到明显抑制。

结论应用反义RNA技术可特异性下调CTGF表达，并通过降低Akt的活性抑制VSMC的增殖和迁移。

【关键词】血管平滑肌细胞结缔组织生长因子细胞增殖细胞迁移反义RNA

Abstract：

ObjectiveTospecificallydown-regulatetheexpressionofCTGFbyapplyinganti-senseRNAtechniqueandobserveitseffectonproliferationandmigrationofVSMC.MethodsPrimaryVSMCswereculturedbyadherencemethod.Anti-senseRNAtechniquewasappliedtospecificallydown-regulatetheexpressionofCTGF.ExpressionofCTGFandactivityofAktweredetectedbyWB.ProliferationandmigrationofVSMCweredeterminedbyMTTandscratchassay.ResultsTransferofpcDNA（+）-CTGF（-）couldspecificallydown-regulateCTGFexpressionandtheactivityofAkt.TheproliferationandmigrationofVSMCwereinhibited.ConclusionsSpecificdown-regulationofCTGFexpressionbyanti-senseRNAtechniquecouldinhibittheproliferationandmigrationofVSMCsbydecreasingthephosphorylationofAkt.

Keywords：

vascularSmoothmusclecell（VSMC）;connectivetissuegrowthfactor（CTGF）;cellproliferation;cellmigration;anti-senseRNA

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）始于血管内膜损伤［1］。

在AS发生前，常有多种因素的刺激对血管内膜造成损伤，内皮细胞发生功能性和器质性改变，造成通透性改变和分泌功能障碍，促进血液中的脂质进入动脉壁。

内皮细胞和动脉中层的血管平滑肌细胞（vascularendothelialcell，VSMC）进一步激活，大量合成并分泌多种生长因子，使自身和周围细胞大量增殖，增殖的VSMC还可迅速合成胶原等细胞外基质［2］，促使VSMC在损伤修复过程中发生纤维化，形成瘢痕修复，血管壁在结构和功能上发生了变化，最终导致了AS的形成［3］。

结缔组织生长因子（connectivetissuegrowthfactor，CTGF）是从培养的人脐带静脉血内皮细胞的条件培养基中发现的。

有研究表明［4］，CTGF参与了血管的损伤修复，能够直接诱导结缔组织细胞增殖和细胞外基质合成，促进AS的发展。

AS病灶中CTGF的mRNA和蛋白质较正常的血管内有较高表达，可见CTGF在AS的发生和发展中有着重要意义［5］。

本课题旨在探讨CTGF在AS中对VSMC增殖和迁移的影响并明确其相关机制，为CTGF对动脉粥样硬化性血管狭窄病变过程的影响提供实验依据。

1材料与方法

　实验材料

1月龄SD大鼠由辽宁医学院实验动物中心提供。

CTGF反义RNA的真核表达载体（+）-CTGF（-）质粒由辽宁医学院科学实验中心构建。

羊抗大鼠CTGF多克隆抗体，ECLTM显影液，BCA-100蛋白质定量测定试剂盒（美国SantaCruz公司）;Akt和磷酸化Akt抗体，平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体（美国Sigma公司）;低糖DMEM培养基（美国Gibco公司）;小牛血清，胰蛋白酶（杭州四季青生物工程公司）;其他试剂均为国产分析纯产品。

霍晓川，等：

CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响辽宁医学院学报2008年2月，29

（1）实验方法

　VSMC的培养和鉴定

处死大鼠浸于75%乙醇中消毒10min。

无菌状态取出双侧颈总动脉，去除血管外结缔组织，剖开血管，刮去内膜，剥离外膜，将中膜剪成1mm2左右的组织块植入经明胶包被处理的培养皿中，种植密度约为1块/cm2，37℃、5%CO2的培养箱培养倒置培养2h，待组织块贴壁后，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，培养1周左右，待细胞爬出融合后，用%的胰蛋白酶进行消化、传代，VSMC镜下见典型的“谷峰样”生长特点，平滑肌α肌动蛋白（α-actin）免疫细胞化染色阳性，证实为VSMC。

选3～5代对数生长期VSMC进行实验。

　实验分组

取培养第3～5代的VSMC细胞30瓶，随机分为３组：

反义RNA组，对照组及空白组，每组10瓶细胞。

分别实施（+）-CTGF（-）转染、空白脂质体转染以及空白处理。

　（+）-CTGF（-）转染VSMC

转染前更换无血清培养基，待VSMC生长到50%～60%后，加入含有4μg（+）-CTGF（-）的转染复合物，置于37℃，5%CO2培养箱孵育。

4h后移除转染复合物，加入无血清培养基，置于37℃，5%CO2培养箱孵育48h后，备用于指标检测。

　指标检测

　Westernblot检测３组细胞CTGF表达和Akt磷酸化状态。

取第3～5代VSMC长至次融合后，给予相应干预因素后，无血清DMEM培养24h，使细胞统一于G0期，加入700μＬ预冷的改良RIPA裂解缓冲液（Tris-HCl，50mmol/L，;NaCl，150mmol/L;NP-40，1%;脱氧胆酸钠，%;SDS，%;EDTA，　mmol/L;PMSF，mmol/L;Leupeptin，　μg/mＬ）裂解细胞，冰浴30min，其间不时摇晃培养瓶;收集细胞，10000g4℃离心15min，上清液即为细胞提取物，保存样品于-20℃备用。

BCA-100蛋白质定量测定试剂盒检测总蛋白浓度。

按分子克隆的操作进行免疫印迹杂交测定:

取样本30μg进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭。

1:

500稀释的抗CTGF多抗杂交4℃过夜，1:

5000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗杂交1h，ECL显影液放射自显影，以20min曝光时间较佳。

图像分析由TotalLab分析软件进行光密度扫描。

　甲基噻唑基四唑（MTT）比色法检测各组VSMC增殖情况

第3代VSMC按5×104/mL接种于96孔培养板上，每孔mL，培养24h后进行各分组的相应处理，测定前2h加入MTT，置于37℃孵育箱中保温2h以上，弃去上清液，加DMSO150μL/孔，使结晶物充分溶解，用酶联免疫检测仪于570nm处测定OD值。

每培养板接种12孔，每天取1板，连续测7d，绘出生长曲线。

　划痕实验检测各组VSMC迁移情况

各组细胞接种于在35mm的培养皿中（2×105/mL），待细胞汇合成单层用灭菌移液器头在细胞上小心的做一个划痕，PBS彻底漂洗3次，显微镜下拍照，然后加入含10μg/mL衣霉素的培养液继续培养，各组细胞于第24h观察划痕愈合情况，显微镜下拍照，选取3个不同的位置，用刻度尺测量划痕宽度，计算平均值，根据这些数值计算划痕愈合指数。

划痕愈合指数＝（初始划痕宽度-愈合后划痕宽度）/初始划痕宽度。

　统计学分析

各组细胞指标检测内容重复测量3次，所有数据以x±s表示，采用软件，首先进行方差齐性检验，然后进行重复测量的方差分析进行比较分析，P＜为有统计学意义。

2结果

　原代VSMC形态及细胞特异性蛋白免疫组化的鉴定

倒置相差显微镜下单个平滑肌细胞呈梭形或带状，有多个细胞突起，胞浆丰富，胞质密度高，不透明，核卵圆形居中，有多个核仁。

细胞生长致密时平行排列成束，部分重叠，表现为典型“谷峰状”生长。

培养第5代的细胞经特异的平滑肌α-actin免疫细胞化学染色后，胞浆着色，呈阳性反应，高倍镜下可见胞浆内大量棕色、与细胞长轴平行的纤维细丝，即平滑肌α肌动蛋白丝，细胞来源于VSMC（见图1）。

　Westernblot检测转染后CTGF的表达

Westernblot结果显示，反义RNA转染组VSMC中CTGF的表达水平显着低于对照组和空白组（P＜），结果表明CTGF反义RNA转染能够有效的下调VSMC内CTGF的表达（见图2）。

　　　MTT法测定下调CTGF表达对VSMC增殖的影响

大鼠的VSMC经分离、培养和传代后，取第3-5代VSMC，经过相应因素处理后，MTT法检测反义RNA组、对照组和空白组第1d至第7d细胞增殖状况，绘制细胞增殖曲线，结果显示CTGF反义RNA组VSMC的增殖较其它组受到显着的抑制，表明下调VSMC内CTGF的表达能够明显的抑制VSMC的增殖（见表1，图3）。

表1MTT法检测第1～7d细胞增殖（OD值）因素

大鼠的VSMC经分离、培养和传代后，取第3-5代VSMC，经过相应因素处理后，划痕试验法检测反义RNA组、对照组和空白组0h及24h创口愈合情况，结果显示CTGF反义RNA组VSMC的创口愈合较其它组受到显着的抑制，表明下调VSMC内CTGF的表达能够明显的抑制VSMC的迁移（图4）。

　Westernblot测定细胞Akt的表达和磷酸化水平

为了进一步探讨下调CTGF表达后，VSMC增殖和迁移受到抑制的相关机制，我们通过使用Westernblot技术测定各组细胞内Akt的表达以及磷酸化Akt的表达情况。

Akt的活性是通过其磷酸化程度而得到实现的，我们的实验结果显示下调CTGF表达可降低Akt磷酸化的水平，而对Akt总量的表达无影响（图5）。

3讨论

CTGF最初是在血小板源性生长因子的诱导下从人脐静脉内皮细胞cDNA库中克隆出来的，是一种富含半胱氨酸的分泌性多肽，其分子量为36～38kD。

它广泛表达于人类多种组织器官中，在病理情况下，其过度表达与某些增生性或纤维化疾病的发生发展密切相关，如硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤维化、动脉粥样硬化等［5］。

研究表明［6］，CTGF能够直接诱导结缔组织细胞增殖和细胞外基质合成，CTGF-mRNA及其蛋白质在动脉粥样硬化血管中的表达比在正常血管中高50～100倍。

VSMC是一种多功能性间叶细胞，其功能主要是通过收缩和舒张来维持血管壁的张力，通过增生和ECM，来维持血管的完整性。

VSMC的增殖、迁移可导致新生内膜形成，这在血管损伤修复后AS形成和发展的过程中起到了关键性的作用，如何有效的促进损伤血管壁的修复，抑制VSMC的过度增殖和迁移是控制动脉粥样硬化进展的关键步骤［7］。

细胞增殖和迁移是一个严格的受控过程，受细胞内外多种信号分子的调节。

蛋白激酶B（Akt）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞分化、细胞生长、细胞迁移等过程中具有重要的调节作用，目前的研究表明Akt的磷酸化水平增高可以促进细胞增殖和迁移［8］。

本研究通过反义RNA技术能够特异性的下调CTGF的表达，并且经过进一步的实验研究证实，下调CTGF的表达可以通过减少Akt的磷酸化来显着降低VSMC的增殖和迁移能力。

CTGF在AS病变整个发生发展过程中起着的不同作用，本实验初步探讨了CTGF对VSMC增殖和迁移的影响，丰实了动脉粥样硬化性缺血性脑血管病发病机制的研究。

而AS的影响因素毕竟是多方面的，我们应继续深入综合研究其相关影响因素，为动脉粥样硬化性脑血管病开辟有效的治疗方法打下基础。

【参考文献】

［1］LauerMS.Primarypreventionofatheroscleroticcardiovasculardisease:

thehighpublicburdenoflowindividualrisk［J］.JAMA，2007，297（12）:

1376-1378.

［2］O‘BrienKD，LewisK，Fischer　musclecellbiglycanoverexpressionresultsinincreasedlipoproteinretentiononextracellularmatrix:

implicationsfortheretentionoflipoproteinsinatherosclerosis［J］.Atherosclerosis，2004，177

（1）:

29-35.

［3］CaiX.Regulationofsmoothmusclecellsindevelopmentandvasculardisease:

currenttherapeuticstrategies［J］.ExpertRevCardiovascTher，2006，4（6）:

789-800.

［4］HughesJM，Kuiper　glycationendproductscauseincreasedCCNfamilyandextracellularmatrixgeneexpressioninthediabeticrodentretina［J］.Diabetologia，2007，50（5）:

1089-1098.

［5］GameBA，HeL.Pioglitazoneinhibitsconnectivetissuegrowthfactorexpressioninadvancedatheroscleroticplaquesinlow-densitylipoproteinreceptor-deficientmice［J］.Atherosclerosis，2006，8（11）:

85-101.

［6］CichaI，YilmazA，KleinM.Connectivetissuegrowthfactorisoverexpressedincomplicatedatheroscleroticplaquesandinducesmononuclearcellchemotaxisinvitro［J］.ArteriosclerThrombVascBiol，2005，25（5）:

1008-1013.

［7］OhtsukaM，Miyashita　depositedinhumanatheromatouslesionsinduceapoptosisofhumanvascularsmoothmusclecells［J］.AtherosclerThromb，2006，13（5）:

256-262.

［8］GalariaII，NichollSM.Urokinase-inducedsmoothmusclecellmigrationrequiresPI3-KandAktactivation［J］.SurgRes，2005，127

（1）:

46-52.