浅论CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响.docx

1、浅论CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响浅论CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响【摘要】 目的 应用反义RNA技术特异性下调结缔组织生长因子(CTGF)的表达，观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移的影响，并探讨其作用机制。方法 培养原代VSMC，使用脂质体法将携带有CTGF反义RNA的真核表达载体(+)-CTGF(-)转染入VSMC，Western Blot技术观察CTGF的表达以及蛋白激酶B(Akt)的活性，MTT法及划痕试验测定VSMC增殖和迁移情况。结果 (+)-CTGF(-)转染VSMC后CTGF的表达明显降低，Akt的活性降低，VSMC的增殖和迁移

2、受到明显抑制。结论 应用反义RNA技术可特异性下调CTGF表达，并通过降低Akt的活性抑制VSMC的增殖和迁移。【关键词】 血管平滑肌细胞 结缔组织生长因子 细胞增殖 细胞迁移 反义RNA Abstract：Objective To specifically down-regulate the expression of CTGF by applying anti-sense RNA technique and observe its effect on proliferation and migration of VSMC. Methods Primary VSMCs were cultur

3、ed by adherence method. Anti-sense RNA technique was applied to specifically down-regulate the expression of CTGF. Expression of CTGF and activity of Akt were detected by WB. Proliferation and migration of VSMC were determined by MTT and scratch assay. Results Transfer of pcDNA (+)-CTGF(-) could spe

4、cifically down-regulate CTGF expression and the activity of Akt. The proliferation and migration of VSMC were inhibited. Conclusions Specific down-regulation of CTGF expression by anti-sense RNA technique could inhibit the proliferation and migration of VSMCs by decreasing the phosphorylation of Akt

5、. Key words：vascular Smooth muscle cell (VSMC);connective tissue growth factor (CTGF);cellproliferation;cell migration;anti-sense RNA 动脉粥样硬化 (Atherosclerosis，AS)始于血管内膜损伤1。在AS发生前，常有多种因素的刺激对血管内膜造成损伤，内皮细胞发生功能性和器质性改变，造成通透性改变和分泌功能障碍，促进血液中的脂质进入动脉壁。内皮细胞和动脉中层的血管平滑肌细胞(vascular endothelial cell，VSMC)进一步激活，大量合

6、成并分泌多种生长因子，使自身和周围细胞大量增殖，增殖的VSMC还可迅速合成胶原等细胞外基质2，促使VSMC在损伤修复过程中发生纤维化，形成瘢痕修复，血管壁在结构和功能上发生了变化，最终导致了AS的形成 3。 结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是从培养的人脐带静脉血内皮细胞的条件培养基中发现的。有研究表明4，CTGF参与了血管的损伤修复，能够直接诱导结缔组织细胞增殖和细胞外基质合成，促进AS的发展。AS病灶中CTGF的mRNA和蛋白质较正常的血管内有较高表达，可见CTGF在AS的发生和发展中有着重要意义5。 本课题旨在探讨CTGF在AS中

7、对VSMC增殖和迁移的影响并明确其相关机制，为CTGF对动脉粥样硬化性血管狭窄病变过程的影响提供实验依据。 1 材料与方法 实验材料 1月龄SD大鼠由辽宁医学院实验动物中心提供。CTGF反义RNA的真核表达载体(+)-CTGF(-)质粒由辽宁医学院科学实验中心构建。羊抗大鼠CTGF多克隆抗体， ECLTM 显影液，BCA-100蛋白质定量测定试剂盒(美国Santa Cruz 公司);Akt和磷酸化Akt抗体，平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(美国Sigma公司);低糖DMEM 培养基(美国Gibco 公司);小牛血清，胰蛋白酶(杭州四季青生物工程公司);其他试剂均为国产分析纯产品。 霍晓川，等：CTG

8、F反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响辽宁医学院学报 2008年2月，29(1) 实验方法 VSMC的培养和鉴定 处死大鼠浸于75%乙醇中消毒10 min。无菌状态取出双侧颈总动脉，去除血管外结缔组织，剖开血管，刮去内膜，剥离外膜，将中膜剪成1 mm2左右的组织块植入经明胶包被处理的培养皿中，种植密度约为1块/cm2，37 、5%CO2的培养箱培养倒置培养2 h，待组织块贴壁后，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，培养1周左右，待细胞爬出融合后，用%的胰蛋白酶进行消化、传代，VSMC镜下见典型的“谷峰样”生长特点，平滑肌肌动蛋白(-actin)免疫细胞化染色阳性，证实为VSMC。选35

9、代对数生长期VSMC进行实验。 实验分组 取培养第35代的VSMC细胞30瓶，随机分为组：反义RNA组，对照组及空白组，每组10瓶细胞。分别实施(+)-CTGF(-)转染、空白脂质体转染以及空白处理。 (+)-CTGF(-)转染VSMC 转染前更换无血清培养基，待VSMC生长到50%60%后，加入含有4 g (+)-CTGF(-)的转染复合物，置于37 ，5%CO2培养箱孵育。4 h后移除转染复合物，加入无血清培养基，置于37 ，5%CO2培养箱孵育48 h后，备用于指标检测。 指标检测Western blot检测组细胞CTGF表达和Akt磷酸化状态。 取第35代VSMC长至次融合后，给予相应

10、干预因素后，无血清DMEM培养24 h，使细胞统一于G0期，加入700 预冷的改良RIPA裂解缓冲液(Tris-HCl， 50 mmol/L， ;NaCl， 150 mmol/L; NP-40，1%;脱氧胆酸钠，%; SDS， %; EDTA，mmol/L; PMSF， mmol/L; Leupeptin，g/m)裂解细胞，冰浴30 min，其间不时摇晃培养瓶;收集细胞，10 000 g4 离心15 min，上清液即为细胞提取物，保存样品于-20 备用。BCA-100蛋白质定量测定试剂盒检测总蛋白浓度。按分子克隆的操作进行免疫印迹杂交测定:取样本30 g进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭。1

11、:500稀释的抗CTGF多抗杂交4 过夜，1:5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗杂交1 h，ECL显影液放射自显影，以20 min曝光时间较佳。图像分析由Total Lab分析软件进行光密度扫描。 甲基噻唑基四唑(MTT)比色法检测各组VSMC增殖情况 第3代VSMC按5104/mL接种于96孔培养板上，每孔 mL，培养24 h后进行各分组的相应处理，测定前2 h加入MTT，置于37 孵育箱中保温2 h以上，弃去上清液，加DMSO 150 L/孔，使结晶物充分溶解，用酶联免疫检测仪于570 nm 处测定OD值。每培养板接种12孔，每天取1板，连续测7 d，绘出生长曲线。 划痕实验检测各组

12、VSMC迁移情况 各组细胞接种于在35 mm的培养皿中(2105/mL)，待细胞汇合成单层用灭菌移液器头在细胞上小心的做一个划痕，PBS彻底漂洗3次，显微镜下拍照，然后加入含10 g/mL衣霉素的培养液继续培养，各组细胞于第24 h观察划痕愈合情况，显微镜下拍照，选取3个不同的位置，用刻度尺测量划痕宽度，计算平均值，根据这些数值计算划痕愈合指数。划痕愈合指数(初始划痕宽度-愈合后划痕宽度)/初始划痕宽度。 统计学分析 各组细胞指标检测内容重复测量3次，所有数据以xs表示，采用软件，首先进行方差齐性检验，然后进行重复测量的方差分析进行比较分析，P为有统计学意义。 2 结 果 原代VSMC形态及细

13、胞特异性蛋白免疫组化的鉴定 倒置相差显微镜下单个平滑肌细胞呈梭形或带状，有多个细胞突起，胞浆丰富，胞质密度高，不透明，核卵圆形居中，有多个核仁。细胞生长致密时平行排列成束，部分重叠，表现为典型“谷峰状”生长。培养第5代的细胞经特异的平滑肌-actin免疫细胞化学染色后，胞浆着色，呈阳性反应，高倍镜下可见胞浆内大量棕色、与细胞长轴平行的纤维细丝，即平滑肌肌动蛋白丝，细胞来源于VSMC(见图1)。 Western blot检测转染后CTGF的表达 Western blot结果显示，反义RNA转染组VSMC中CTGF的表达水平显着低于对照组和空白组(P)，结果表明CTGF反义RNA转染能够有效的下调

14、VSMC内CTGF的表达 (见图2)。 MTT法测定下调CTGF表达对VSMC增殖的影响 大鼠的VSMC经分离、培养和传代后，取第3-5代VSMC，经过相应因素处理后，MTT法检测反义RNA组、对照组和空白组第1 d至第7 d细胞增殖状况，绘制细胞增殖曲线，结果显示CTGF反义RNA组VSMC的增殖较其它组受到显着的抑制，表明下调VSMC内CTGF的表达能够明显的抑制VSMC的增殖(见表1，图3)。 表1 MTT法检测第17d细胞增殖(OD值)因素 大鼠的VSMC经分离、培养和传代后，取第3-5代VSMC，经过相应因素处理后，划痕试验法检测反义RNA组、对照组和空白组0 h及24 h创口愈合情

15、况，结果显示CTGF反义RNA组VSMC的创口愈合较其它组受到显着的抑制，表明下调VSMC内CTGF的表达能够明显的抑制VSMC的迁移(图4)。 Western blot测定细胞Akt的表达和磷酸化水平 为了进一步探讨下调CTGF表达后，VSMC增殖和迁移受到抑制的相关机制，我们通过使用Western blot技术测定各组细胞内Akt的表达以及磷酸化Akt的表达情况。Akt的活性是通过其磷酸化程度而得到实现的，我们的实验结果显示下调CTGF表达可降低Akt磷酸化的水平，而对Akt总量的表达无影响(图5)。 3 讨 论 CTGF最初是在血小板源性生长因子的诱导下从人脐静脉内皮细胞cDNA库中克隆

16、出来的，是一种富含半胱氨酸的分泌性多肽，其分子量为3638 kD。它广泛表达于人类多种组织器官中，在病理情况下，其过度表达与某些增生性或纤维化疾病的发生发展密切相关，如硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤维化、动脉粥样硬化等5。研究表明6，CTGF能够直接诱导结缔组织细胞增殖和细胞外基质合成， CTGF-mRNA及其蛋白质在动脉粥样硬化血管中的表达比在正常血管中高50100倍。 VSMC是一种多功能性间叶细胞，其功能主要是通过收缩和舒张来维持血管壁的张力，通过增生和ECM ，来维持血管的完整性。VSMC的增殖、迁移可导致新生内膜形成，这在血管损伤修复后AS形成和发展的过程中起到了关键性的作用，如何有

17、效的促进损伤血管壁的修复，抑制VSMC的过度增殖和迁移是控制动脉粥样硬化进展的关键步骤7。 细胞增殖和迁移是一个严格的受控过程，受细胞内外多种信号分子的调节。蛋白激酶B(Akt)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞分化、细胞生长、细胞迁移等过程中具有重要的调节作用，目前的研究表明Akt的磷酸化水平增高可以促进细胞增殖和迁移8。本研究通过反义RNA技术能够特异性的下调CTGF的表达，并且经过进一步的实验研究证实，下调CTGF的表达可以通过减少Akt的磷酸化来显着降低VSMC的增殖和迁移能力。 CTGF在AS病变整个发生发展过程中起着的不同作用，本实验初步探讨了CTGF对VSMC增殖和迁移的影响，

18、丰实了动脉粥样硬化性缺血性脑血管病发病机制的研究。而AS的影响因素毕竟是多方面的，我们应继续深入综合研究其相关影响因素，为动脉粥样硬化性脑血管病开辟有效的治疗方法打下基础。 【参考文献】 1 Lauer MS. Primary prevention of atherosclerotic cardiovascular disease: the high public burden of low individual risk J. JAMA，2007，297(12):1376-1378. 2 OBrien KD， Lewis K， Fischermuscle cell biglycan over

19、expression results in increased lipoprotein retention on extracellular matrix: implications for the retention of lipoproteins in atherosclerosis J. Atherosclerosis，2004，177(1):29-35.3 Cai X. Regulation of smooth muscle cells in development and vascular disease: current therapeutic strategies J. Expe

20、rt Rev Cardiovasc Ther，2006，4(6):789-800.4 Hughes JM，Kuiperglycation end products cause increased CCN family and extracellular matrix gene expression in the diabetic rodent retina J. Diabetologia，2007，50(5):1089-1098.5 Game BA，He L. Pioglitazone inhibits connective tissue growth factor expression in

21、 advanced atherosclerotic plaques in low-density lipoprotein receptor-deficient mice J. Atherosclerosis，2006，8(11):85-101.6 Cicha I， Yilmaz A， Klein M. Connective tissue growth factor is overexpressed in complicated atherosclerotic plaques and induces mononuclear cell chemotaxis in vitro J. Arterios

22、cler Thromb Vasc Biol，2005，25(5):1008-1013.7 Ohtsuka M， Miyashitadeposited in human atheromatous lesions induce apoptosis of human vascular smooth muscle cells J. Atheroscler Thromb，2006，13(5):256-262.8 Galaria II， Nicholl SM. Urokinase-induced smooth muscle cell migration requires PI3-K and Akt activation J. Surg Res，2005，127(1):46-52.