基因工程考试复习.docx
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基因工程考试复习
2012级《基因工程》考试复习
姓名：
__________电话：
___________
一
基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来,或者人工合成的基因,按照人们的愿望,进行严密的设计,经过体外加工重组,通过一定的方法,转移到另一种生物体（受体）的细胞内,使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术.
基因工程是指在体外将目的基因插入病毒、质粒或者其他载体分子中、构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原来没有这些基因的寄主细胞内，且能稳定的遗传。
基因工程三要素：
供体受体载体
基因工程的操作步骤：
切→接→转→检
基因工程研究的内容：
基因的分离与克隆转化体的筛选[书本]:
（GE克隆载体的研究
载体的选择与构建外源基因整合和表达的检测GE受体系统的研究
基因转化受体系统的建立外源基因在细胞中的表达调控目的基因的研究
基因转化技术外源基因的遗传GE工具酶的研究
GE新技术的的研究）
基因工程诞生的理论基础及技术基础
1）理论基础
20世纪40年代，确定了遗传信息的携带者是DNA而不是pro,从而明确了遗传物质的基础问题。
50年代，DNA双链和DNA结构的双螺旋模型和DNA半保留复制机理解答了DNA的自我复制和遗传信息传递问题。
50年代末和60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说，并成功破译了遗传密码，从而阐明了基因遗传信息的流向和表达方式。
2）技术基础
限制性核酸内切酶的发现
DNA连接酶的发现
GE载体的发现
转化（导入）方法
基因表达
6如何正确看待基因工程（正反两方面）
虽然GE解决了生产生活中的一些问题，如：
红色GE:
指的是医疗部门的GE，涉及的基因改造的细菌产生的基因药物如胰岛素。
白色GE:
包括环境微生物学，环境技术和其他技术或工业应用。
绿色GE:
在农业上的应用，用在作物育种的主要重点是植物的不敏感的害虫和疾病。
但是基因工程的安全性引起了强烈的关注和质疑：
问题1用于筛选的标记基因或报告基因是否会对人畜有害，同时导致病原菌抗药性的提高。
问题2抗除草剂基因会不会使转基因植物变成不可控制的杂草，或漂移到杂草上使杂草泛滥。
问题3外源基因插入的位置效应是否会引起有害的沉默基因的表达。
问题4转基因动物是否会演变成对人类有极大威胁的新物种。
问题5基因治疗是否对人体的正常功能产生不良影响。
二
DNA提取（基因组，质粒DNA，噬菌体）
原核基因组DNA提取方法：
苯酚氯仿抽提法。
植物组织中DNA的提取CTAB的作用:
CTAB[十六烷基三甲基溴化铵]是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液[0.7mol/LNaCl]中是可溶的，当降低盐溶液的浓度到一定程度[0.3mol/LNaCl]时从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与合算的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。
动物组织中DNA的提取SDS的作用:
溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；
溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；
对RNase、Dnase有一定的抑制作用；
SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。
载样缓冲液的作用①增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便.
质粒DNA提取的两种方法：
氯化铯密度梯度离心法,利用碱变性法提取质粒DNA方法及原理）p91
氯化铯-EtBr密度梯度离心法是根据“在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子质量的细菌染色体DNA易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子质量较小、结构紧密，仍能保持完整的状态”这种差别建立的纯化质粒DNA的技术。
原理：
当将含有溴化乙锭EtBr的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中时，溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。
线性的或开环的DNA分子，如大肠杆菌染色体DNA片段，可结合大量的EtBr分子，直至达到饱和（每个碱基对大约结合一个溴化乙锭分子）。
而像质粒这样的共价闭合环状的DNA（cccDNA）分子，由于在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入，EtBr分子的结合数量相对较少。
由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯中的浮力密度也有所不同。
在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越来越多，其密度也就越低。
通过氯化铯密度梯度离心之后，根据它们的不同密度，就会平衡在不同位置。
取出DNA，用异丙醇抽提溴化乙锭，再用缓冲液透析除去残余氯化铯，最后用两倍体积冷乙醇沉淀，就得到了纯化的质粒DNA。
碱变性法提取质粒DNA方法及原理
碱变性法提取质粒DNA方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间在拓扑学上的差异而发展出来的。
在pH12.0~12.5时，线性的DNA会完全变性分开，甚至出现断裂；而共价闭合环状质粒DNA虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开。
通过冷却或恢复中性pH使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，在离心时，大部分主染色体与细胞碎片、杂质等缠绕在一起被沉淀，通过离心即可除去线性染色体，而可溶性的cccDNA留在上清液中，将含有cccDNA的上清液用乙醇沉淀，获得质粒DNA。
DNA样品浓度的测定方法
a,在琼脂凝胶上用荧光染料进行标准比对。
b，利用分光光度计测吸收值。
A260.
DNAConcentration（浓度）Measurement
Comparisonwithastandardusingafluorescingdye（荧光染料）onanagarose-gel琼脂糖胶凝.
UsingabsorptionofDNAinaUV-spectrophotometer分光光度计
DNA纯度的测定
DNA在260纳米处有最大吸收峰，但蛋白质核酸的主要污染源在280nm处有最大吸收峰，A260/A280适合纯度测定。
纯DNA=A260/A280=1.8
纯RNA=A260/A280=2.0
低于1.8含苯酚或蛋白质，高于1.8含RNA和单核苷酸。
DNA纯化的方法：
a氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法（CsCl-EB）适合纯化大剂量DNA。
b阴离子交换层析法
c琼脂糖凝胶电泳洗脱法，适合小剂量DNA的纯化和酶切DNA片段的回收纯化。
d基因纯试剂盒
核酸杂交类型：
A转移印迹
southren杂交：
检测DNA
Northren杂交：
检测RNA
Western杂交：
检测蛋白质
B点印迹、狭缝印迹[dotblotting/slotblotting]
C原位杂交[insituhybridization]
质粒特性：
1什么叫质粒
一类存在于细菌或真核细胞中，独立于染色体之外能自主复制的裸露的双连环状（少数为线状和RNA）DNA分子，是与细菌或真核细胞共生的遗传成分。
2质粒的构型，及不同构型的大小迁移顺序
绝大多数质粒是环状双链，其分子具有3种不同的构型：
1）当其两条多核苷酸链均保持着完整的环状构型时，成为共价闭合环形DNA，即cccDNA。
这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型。
2）如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环状结构，另一条出现一至数个缺口时，称为开环DNA（ocDNA），此即OC构型。
3）若质粒DNA经过适当的限制酶切割后，发生双链断裂而成线性分子（L-DNA），通称L构型。
在正常的电泳条件下，不同构型的质粒DNA，尽管分子质量相同，但是仍然具有不同的电泳迁移率，其大小顺序为：
cccDNA（scDNA）>L-DNA（线性DNA）>OC-DNA>D-DNA（二聚体DNA）>T-DNA（三聚体DNA）。
经过合适的限制酶处理后所有结构的DNA都转化为线性分子。
3质粒的大小差异大，最小的不到1kb,最大的甚至超过500kb。
4宿主细胞在标准培养条件下，一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。
5理论上讲，几乎所有的细菌都含有质粒。
几乎所有的质粒都会带有一个至多个基因，而这些基因的表达常常赋予细胞有用的特性。
6质粒DNA都含DNA的复制起始点，这使得质粒可在宿主细胞中独立复制，分子质量小一点的DNA可利用宿主细胞中的DNA复制酶来进行自身的DNA复制；分子质量大一点的DNA本身含有DNA复制时所用酶的基因，质粒DNA复制时所用的DNA复制酶是自身DNA基因表达的产物，还有一些质粒DNA能将自身的DNA插入到寄主细胞染色体上，随寄主染色体复制而复制。
常用电泳缓冲液种类及特点
TAE
50×
242gTris
57.1ml冰乙酸
100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）
双链DNA分子的泳动速率比另两者快10%，超螺旋在其中电泳时更符合实际分子质量，回收DNA片段时首选，大片段分离效果好，缓冲容量小，过夜电泳不可选用。
TBE
5×
54gTris
27.5硼酸
20mol0.5mol/LEDTApH8.0
小片段（＜1kb）分离效果好，回收率差，不宜用于回收电泳。
缓冲容量大，过夜电泳适合
TPE
10×
108gTris
15.5ml磷酸（85%，1.679g/ml）
40ml0.5mol/LEDTApH8.0
磷酸盐的浓度偏高，容易使DNA沉淀，也不适合回收电泳，缓冲容量大，过夜电泳适合
电泳缓冲液组成及其作用
类型
6×缓冲液
储存温度
0.25%溴酚蓝
4℃
0.25%二甲苯氰FF
40%蔗糖水溶液
0.25%溴酚蓝
室温
0.25%二甲苯氰FF
15%聚蔗糖水溶液
0.25%溴酚蓝
4℃
0.25%二甲苯氰FF
30%甘油水溶液
作用：
增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔中；
在电泳中形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳速度和位置；
使样品呈色，使加样操作更方便。
DNA沉淀两种方法的优缺点
1乙醇
优点：
对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。
缺点：
需要量大，一般要求低温操作。
2异丙醇
优点：
需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。
一般不需低温长时间放置。
缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。
所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离物质原理（三个效应）
不连续电泳凝胶采用两层或3层性质不同的凝胶（样品胶，浓缩胶和分离胶）重叠起来会用，前两种胶的缓冲液、PH和孔径大小完全一样，不同的是浓缩胶中无样品。
分离胶的孔径较小，PH也不同，能使能读较低的各组分在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨率。
第一三个不连续：
凝胶孔径的不连续
缓冲液离子组成及各层凝胶ph的不连续
在电场中形成的电位梯度的不连续
第二不连续系统中的三种物理效应
电荷效应酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电荷作用下向一定的电极及一定的速度移动。
分子筛效应相对分子质量或构型不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，所受摩擦不同，受阻程度不同，表现出不同的迁移率
浓缩效应使待分开样品中的各组分在浓缩胶中被压缩成层。
基因的化学合成：
人工合成的短DNA片段5’末端为OH，而天然的DNA5’末端为—P.
（磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法）
基因组装方法：
全片段酶促链接法：
带上必要的5’磷酸基团，与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，加入T4DNA连接酶，使它们彼此连接组装成一个完整的基因或基因片段，这些组装的产物插入到适当的载体上，转化受体细胞，最后用DNA序列分析检测所组装的基因。
例如：
α—干扰素和牛视紫红质基团。
酶促填充法：
将两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，产生的单链区断在加入的klenow酶的聚合作用下合成互补链，再和载体连接。
PCR组成成分，标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
TaqDNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR引物设计原则
PrimerDesign:
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②引物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
什么是PCR
PCR技术是一种通过模拟体内DNA的复制方式，在体外两种分别与基因两端不同DNA链互补的特异引物，经聚合酶酶促作用下选择性地将DNA某个特殊区域快速扩增出来的技术。
什么是不对称PCRAsymmetricPCR
不对称PCR是用不等量的一对引物（非限制性引物与限制性引物），PCR扩增后产生大量的单链DNA。
什么是反向PCRInversePCR
一种用于指数式扩增位于一个已知DNA区段的PCR法。
什么是巣式PCRNestedPCR.
方法由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成，在第一轮扩增中，使用一对引物产生扩曾产物，然后用一对内引物对第一轮扩增的产物进行第二轮扩增，用于DNA及RNA病毒的检测。
什么是基因定点诱变Site-directedmutagenesis
是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。
（体外特异性改变某个碱基的技术）
盒式诱变cassettemutagenesis
是利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段取代野生型基因中的相应序列获得数量众多的突变体。
kunkel定点诱变原理
诱变之前将复制型的MB噬菌体转化到dut和ung双缺陷型菌株中生长，dut突变导致dutp水平升，ung突变则会使尿嘧啶取代DNA链中的胸腺嘧啶，因此，从dut-ung-大肠杆菌寄主中制备MB单链DNA模板含有许多尿嘧啶残基，进行寡核苷酸引物诱变，产生的异源双链DNA导入大肠杆菌ung+菌株野生型模板复制之前被降解，合成链不会被降解，正常复制，从而产生大量的突变体，提高突变的效率。
常见的印记杂交
A
southern杂交：
检测DNA
northern杂交：
检测RNA
western杂交：
检测蛋白质
B
点印记，狭缝印迹（dotblotting/slotblotting）
C
原位杂交（insituhybridzation）
什么是放射自显影
Autoradiography（放射自显影）:
利用放射性同位素所发射出来的带电离子（α或β粒子）作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，用显影液显示这种潜影，成为可见的“像”。
三
限制性内切核酸酶的种类
分为三类：
型、
型、
型
型、
型
型
ATP、Mg2+
AACN6IGCT
TGAN8TGCT
1000bp以外切割
Mg2+
回文序列
切割位点在识别位点区域
ATPMg2+
AGAAC
CAGCA
24-26bp外切割
限制性内切核酸酶的命名方法
例如EcoRI
E:
表示大肠杆菌属名的第一个字母；
co:
表示种名的前两个字母
R：
表示株名；
I:
表示该菌种中第一个被分离出的酶。
同裂酶同尾酶新裂酶的区别
同裂酶：
相同识别位点和切割位点不同但来源不同的酶称为同裂酶。
新裂酶：
来源不同相同识别位点但切割位点不同的酶。
同尾酶：
来源不同，识别位点不同，切割位点也不同，但产生了相同的粘性末端的酶。
影响限制性内切核酸酶酶活性的因素
a能源分子浓度；
b酶浓度，例如，T4DNA连接酶在连接平末端时酶用量为1~2单位连接效率最高；而在连接粘性末端时酶用量为0.1单位时便能得到最佳的连接效率。
c反应时间;
d反应温度，对DNA连接酶而言，连接粘性末端最适37℃，在此温度下，粘性末端处氢键易遭热破坏降低粘性末端结合的速率；因此，连接粘性末端最佳温度应介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。
e作为底物的DNA片段的摩尔比等。
典型酶切反应体系组成
无菌水14ul
10×buffer2ul
BSA牛血清蛋白（保护酶）2ul
DNA样品0.2-1ug在TE1ul
保护酶2-10ug1ul
最终体系20ul
酶在冰上，最后加入反应中，加入酶前把它们全混匀。
酶加样顺序一般为：
水+缓冲液+DNA+酶，以保证酶的活性。
什么是星号活性及其引起因素
星号活性：
某些条件下，一种特异性识别顺序的限制性内切酶，在每位同一种DNA片段时会产生新的酶切微位点而得到不同的酶切片段，这种酶活性则称星号活性。
引起因素：
高浓度的甘油（＞5%）
低离子强度小于25mM
高PH（＞8.0）
乙醇，乙二醇等有机溶剂
Mn2+、Cu2+、Co2+等正离子，与Mg2+竞争
物理图谱physicalmap（RestrictionMaps限制性图谱,）
（限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱）。
限制性图谱分布图，顺序，距离
（如图）
常用DNA连接酶的特性
T4DNA连接酶:
来源T4噬菌体，粘性末端和平末端都可连接，必须以ATP作为辅助因子
E.coliDNA连接酶:
来源于大肠杆菌，只催化双链DNA片段互补粘性末端之间的连接。
连接反应温度16℃
匹配末端连接的方法存在的问题及其解决方案
匹配粘性末端：
同一种酶切割，混合在一起，自己发生配对，连接。
产生的问题：
a.载体自身环化降低了重组子的效率
b.插入的外源DNA片段有两个方向
解决方法：
a.碱性磷酸酶的处理，去除载体DNA片段的5’磷酸，阻止载体DNA分子的自身环化，从而增加了重组DNA的比率。
b.利用双酶切的方法来实现基因的定向克隆，没有合适的双酶切的位点可以通过加衔接物的方法实现定向克隆。
不匹配粘性末端如何进行连接？
a.将粘性末端修饰成平末端。
b.将平末端修饰成互补粘性末端（补平）
平末端的连接方法（提高平末端的效率）
a.T4DNA连接酶连接平末端
提高T4DNA酶的浓度；
提高DNA片段的浓度；
降低ATP浓度，以增强连接物与DNA结合；
加入多胺化合物，如亚精胺，降低DNA静电排斥力；
加入浓缩剂，如大分子排阻物聚乙二醇（PEG）、强水化合物三氯化六氨钴等。
b.同聚物加尾法ccc一般用GC更稳定
c.衔接物连接法两端平末端，人工合成双链使得一端为平末端，另一端为粘性末端
d.DNA片段接头连接法
接头
它是一类由人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。
衔接物
是指用化学法合成的一段由10~12个核苷酸组成具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。
Klenow大片段
DNA聚合酶
在枯草杆菌蛋白酶下生成大片段和小片段，，大片段即为klenow片段，是具有3’—5’核酸外切酶活性及聚合酶活性。
末端脱氧核苷酸转移酶的特性
①合成方向5’→3’
②合成时不要模板，但底物至少要3个核苷酸，
③对dNTP非特异性，任一种都可以作前体物，
④可催化3’－OH末端单链或3’－OH突出的双链，
需要Mg++或Mn++，
⑤用Co++代替Mg++作辅助因子，可在平末端
DNA分子上进行末端转移。
用途：
①给载体或cDNA加上互补同聚物尾，
②标记DNA片段的3’－OH端，可用α－32P－dNTP
也可催化非放射性标记物参入DNA3’－末端
③可按底物合成多聚脱氧核苷酸同聚物。
修饰酶：
碱性磷酸酶
将DNARNA或蛋白质的5”磷酸基团切掉，防止DNA的自身环化和5”末端标记前的去鳞。
多聚核苷酸激酶
将ATP的5’磷酸盐催化转移到DNARNA的5”端，常用于正向反应，交换反应。
RNA酶A（核糖核酸酶A）
a可特意剪切3”末端为嘧啶核苷酸的单链RNA，将RNA降解为3’磷酸化的单核苷酸和低聚核苷酸。
b低盐（0~100mmol/L）可以切割单链\双链\杂交双链
c高盐0.3mol/L只切单链
S1核苷酸酶（Nuclease）的特性
以内切酶方式降解单链DNA及RNA，产生以5”磷酸为末端的产物，双联核苷酸不能被降解，除非是有极高浓度的醇。
该酶可以用于去除双链DNA的单链末端、单链DNA的选择性切除和RNA转录图谱。
四
载体:
是细菌的DNA，运载外源基因进入宿主细胞，并在宿主细胞内进行复制和表达。
穿梭载体：
质粒的迁移：
有一些非接合型质粒在接合型质粒的帮助下，从一个细胞转移到另一个细胞的作用称之为质粒的迁移性。
载体需要满足的条件/具有的特点
低分子量；
选择标记；
高拷贝的宿主细胞；
复制序列（复制起始位点）；
有多个限制酶的识别位点且切点是单一的，供外源基因插入；
较高稳定性，可以稳定遗传不易丢失；
安全性；
扩增。
质粒的不相容性
在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒是不能在同一宿主细胞中稳定共存的，这一现象称为不亲和性或者不相容性。
常见的载体结构pEMBPBRPUC
pEMBL8
PBR:
PUC:
如何鉴定重组λ噬菌体：
a.蓝白筛选：
清亮噬菌斑为重组子，蓝噬菌斑为非重组子。
b.SPI表型筛选原理定义
野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶原性E.coli的生长会受到限制的表型，称作SPI，即对P2噬菌体的干扰敏感。
这种生长抑制作用是受λ噬菌体red和gam这两个基因编码的产物控制的。
如果λ噬菌体缺少两个参与重组的基因red和gam同时带有chi位点，并且宿主菌为rec+，则可以在P2溶原性E.coli中生长良好，λ噬菌体的这种表型称作spi-，因此，通过λ噬菌体载体DNA的red或gam基因的缺失或替换，可在P2噬菌体溶原性鉴别重组和非重组λ噬菌体，能够在噬菌体P2溶原性的大肠杆菌中生长并形成噬菌斑。
λ噬菌体载体的野生型为什么不能作为基因克隆的载体？
a.λDNA基因组大而且复杂，特别是其中具有许多基因克隆常用的限制酶识别位点。
b.λ噬菌体外壳只能接纳一定长度（相当于λ基因组75%~105%）DNA分子。
因此，λDNA只能作为小片段外源DNA分子（2.5kb左右）的克隆载体。
这一克隆容量是显然不能满足大多数基因克隆工作的要求，必须对其进行改造。
λ噬菌体包装限制范围
70%＜λ噬菌体＜150
构建的λ噬菌体载体类型（两种）
插入型载体：
一类可容纳一定长度DNA片段的噬菌体载体，在克隆时无需去除与插入大小相当的片段。
容纳外源基因15kb
替换型载体：
具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代在其中央部位有一个可以
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