植物基因工程真题资料.docx

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植物基因工程真题资料

植物基因工程真题（2011-2013）

一、名词解释

1、Southernblotting：

是指通过吸附或电泳方法将经凝胶电泳分离的大分子物质从胶上转移到固相载体上，再与特定的探针反应从而达到检测或鉴定这些大分子物质的过程。

2、cis-actingelement：

顺式作用元件，存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等。

它们的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任何蛋白质,仅仅提供一个作用位点,要与反式作用因子相互作用而起作用。

3、subcloing:

4、Genelibray

5、YeastTwo-HybridAssays:

6、qRT-PCR

7.Shuttleplasmidvector

8.insertinactivation

9.cDNAlibrary

10.RNAi

11.Geneknockout

12.Transductionandtransfection

13.DNAprobe

14.Enzyme-linkedimmunosorbentassay

15.Transpositionalrecombination

16.EST

17.Fluorescenceinsituhybridization

18.q-pcr

19.SNP

二、简单题

1.Pcr反应原理和步骤；基本反应过程有哪些；反应体系与反应条件？

简要介绍温度和时间设置间的关系？

PCR反应原理：

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

步骤：

由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至（90-96℃）左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至（25-65℃）左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在（70-75℃）、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

标准的反应体系：

10×扩增缓冲液　5ul

4种dNTP混合物　各200μmol/L

引物　　　　　各10～100pmol　

模板DNA　　　　0.1～2μg　

TaqDNA聚合酶　1～2U

Mg2+　　　　　　1.5～2.0mmol/L

加双或三蒸水至　50μl

反应条件：

为温度、时间和循环次数。

温度和时间设置间的关系：

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。

①变性温度与时间：

变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。

一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。

此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

②退火（复性）温度与时间：

退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。

变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。

由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。

退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。

对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。

引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

　　　　　Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）

　　　　　复性温度=Tm值-（5～10℃）

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。

复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间：

TaqDNA聚合酶的生物学活性：

　　　　　　　　　70～80℃150核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　70℃60核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　55℃24核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。

3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。

延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。

对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

循环次数　　循环次数决定PCR扩增程度。

PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。

一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

2.基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？

主要考虑以下几方面的因素。

（1）基因的特点：

如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。

基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。

（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。

启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。

如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。

（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。

3.转录因子包括什么主要的功能结构域？

其主要的结构特点与功能是什么？

作为蛋白质的转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域：

①DNA结合域（DNAbindingdomain），多由60-100个氨基酸残基组成的几个亚区组成；②转录激活域（activatingdomain），常由30-100氨基酸残基组成，这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类，一酸性结构域最多见；③连接区，即连接上两个结构域的部分。

不与DNA直接结合的转录因子没有DNA结合域，但能通过转录激活域直接或间接作用与转录复合体而影响转录效率。

与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，与DNA结合的功能域常见有以几种：

①螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）及螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）这类结构至少有两个α螺旋其间由短肽段形成的转角或环连接，两个这样的motif结构以二聚体形式相连，距离正好相当于DNA一个螺距（3.4nm）,两个α螺旋刚好分别嵌入DNA的深沟。

②锌指（zincfinger）其结构如图所示，每个重复的“指”状结构约含23个氨基酸残基，锌以4个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合。

整个蛋白质分子可有2-9个这样的锌指重复单位。

每一个单位可以其指部伸入DNA双螺旋的深沟，接触5个核苷酸。

例如与GC盒结合的转录因子SP1中就有连续的3个锌指重复结构。

③碱性-亮氨酸拉链（basicleucinezipper，bZIP）这结构的特点是蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在α螺旋的同一个方向出现。

两个相同的结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体，这二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。

若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低。

在肝脏、小肠上皮、脂肪细胞和某些脑细胞中有称为C/EBP家族的一大类蛋白质能够与CAAT盒和病毒增强子结合，其特征就是能形成bZIP二聚体结构。

4.当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施？

为什么？

注意星活性（所谓星活性又称Star活性。

是指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。

产生Star活性的结果是酶切条带增多。

），先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。

或使用通用缓冲液。

5.对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？

天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：

A,加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择，通常是抗生素基因。

B，增加或减少合适的酶切位点，便于重组。

C，缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。

D，改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。

E,根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件。

6.双向电泳的主要步骤和原理.

双向电泳是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照蛋白的pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照蛋白的分子量大小分离），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

实验步骤:

第一向等电聚焦

1）从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。

2）在小管中加入0.01gDTT，Bio-Lyte4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。

3）从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。

4）从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cmpH4-7），室温中放置10分钟。

5）沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。

在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。

注意：

不要产生气泡。

否则影响到胶条中蛋白质的分布。

6）当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

7）分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有）对应于聚焦盘的正极。

确保胶条与电极紧密接触。

不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。

同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。

如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。

8）在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。

需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

9）对好正、负极，盖上盖子。

设置等电聚焦程序。

10）聚焦结束的胶条。

立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将