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1、基因工程考试复习2012级基因工程考试复习姓名：_电话：_一基因工程是指将一种或多种生物体 (供体) 的基因或基因组提取出来, 或者人工合成的基因, 按照人们的愿望, 进行严密的设计, 经过体外加工重组, 通过一定的方法, 转移到另一种生物体 (受体) 的细胞内, 使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术.基因工程 是指在体外将目的基因插入病毒、质粒或者其他载体分子中、构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原来没有这些基因的寄主细胞内，且能稳定的遗传。基因工程三要素：供体 受体 载体基因工程的操作步骤：切接转检基因工程研究的内容：基因的分离与克隆 转化体的筛选 书本:（GE克隆载体的研究载体的

2、选择与构建 外源基因整合和表达的检测 GE受体系统的研究基因转化受体系统的建立 外源基因在细胞中的表达调控 目的基因的研究基因转化技术 外源基因的遗传 GE工具酶的研究 GE新技术的的研究）基因工程诞生的理论基础及技术基础1)理论基础20世纪40年代，确定了遗传信息的携带者是DNA而不是pro,从而明确了遗传物质的基础问题。50年代，DNA双链和DNA结构的双螺旋模型和DNA半保留复制机理解答了DNA的自我复制和遗传信息传递问题。50年代末和60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说，并成功破译了遗传密码，从而阐明了基因遗传信息的流向和表达方式。2）技术基础限制性核酸内切酶的发现DNA连接酶的发

3、现GE载体的发现转化（导入）方法基因表达6如何正确看待基因工程(正反两方面）虽然GE解决了生产生活中的一些问题，如：红色GE:指的是医疗部门的GE，涉及的基因改造的细菌产生的基因药物如胰岛素。白色GE:包括环境微生物学，环境技术和其他技术或工业应用。绿色GE:在农业上的应用，用在作物育种的主要重点是植物的不敏感的害虫和疾病。但是基因工程的安全性引起了强烈的关注和质疑：问题1用于筛选的标记基因或报告基因是否会对人畜有害，同时导致病原菌抗药性的提高。问题2抗除草剂基因会不会使转基因植物变成不可控制的杂草，或漂移到杂草上使杂草泛滥。问题3外源基因插入的位置效应是否会引起有害的沉默基因的表达。问题4转

4、基因动物是否会演变成对人类有极大威胁的新物种。问题5基因治疗是否对人体的正常功能产生不良影响。二DNA提取（基因组，质粒DNA，噬菌体）原核基因组DNA提取方法：苯酚氯仿抽提法。植物组织中DNA 的提取CTAB的 作用 :CTAB十六烷基三甲基溴化铵是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液0.7mol/LNaCl中是可溶的，当降低盐溶液的浓度到一定程度0.3mol/LNaCl时从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与合算的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。动物组织中DNA 的提取SD

5、S的 作用 :溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；对RNase、Dnase有一定的抑制作用；SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。载样缓冲液的作用增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔内.在电泳中形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置.使样品呈色，使加样操作更方便.质粒DNA提取的两种方法：氯化铯密度梯度离心法,利用碱变性法提取质粒DNA方法及原理）p91氯化铯-EtBr密度梯度离心法是根据“在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子质量的细菌染色体DNA易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于

6、其分子质量较小、结构紧密，仍能保持完整的状态”这种差别建立的纯化质粒DNA的技术。原理：当将含有溴化乙锭EtBr的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中时，溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。线性的或开环的DNA分子，如大肠杆菌染色体DNA片段，可结合大量的EtBr分子，直至达到饱和（每个碱基对大约结合一个溴化乙锭分子）。而像质粒这样的共价闭合环状的DNA（cccDNA）分子，由于在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入，EtBr分子的结合数量相对较少。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化

7、乙锭的氯化铯中的浮力密度也有所不同。在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越来越多，其密度也就越低。通过氯化铯密度梯度离心之后，根据它们的不同密度，就会平衡在不同位置。取出DNA，用异丙醇抽提溴化乙锭，再用缓冲液透析除去残余氯化铯，最后用两倍体积冷乙醇沉淀，就得到了纯化的质粒DNA。碱变性法提取质粒DNA方法及原理碱变性法提取质粒DNA方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间在拓扑学上的差异而发展出来的。在pH12.012.5时，线性的DNA会完全变性分开，甚至出现断裂；而共价闭合环状质粒DNA虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开。通过冷却或恢复中性pH使之复性

8、，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，在离心时，大部分主染色体与细胞碎片、杂质等缠绕在一起被沉淀，通过离心即可除去线性染色体，而可溶性的cccDNA留在上清液中，将含有cccDNA的上清液用乙醇沉淀，获得质粒DNA。DNA样品浓度的测定方法a,在琼脂凝胶上用荧光染料进行标准比对。b，利用分光光度计测吸收值。A260.DNA Concentration（浓度） MeasurementComparison with a standard using a fluorescing dye （荧光染料）on an agarose-gel琼脂糖胶凝 .Using absorption

9、of DNA in a UV-spectrophotometer分光光度计DNA纯度的测定DNA在260纳米处有最大吸收峰，但蛋白质核酸的主要污染源在280nm处有最大吸收峰，A260/A280适合纯度测定。纯DNA=A260/A280=1.8纯RNA=A260/A280=2.0低于1.8含苯酚或蛋白质，高于1.8含RNA和单核苷酸。DNA纯化的方法：a 氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法（CsCl-EB）适合纯化大剂量DNA。b 阴离子交换层析法c 琼脂糖凝胶电泳洗脱法，适合小剂量DNA的纯化和酶切DNA片段的回收纯化。d 基因纯试剂盒核酸杂交类型：A转移印迹southren杂交：检测DNANo

10、rthren杂交：检测RNAWestern杂交：检测蛋白质B 点印迹、狭缝印迹dot blotting /slot blotting C 原位杂交in situ hybridization质粒特性：1什么叫质粒一类存在于细菌或真核细胞中，独立于染色体之外能自主复制的裸露的双连环状（少数为线状和RNA）DNA分子，是与细菌或真核细胞共生的遗传成分。2质粒的构型，及不同构型的大小迁移顺序绝大多数质粒是环状双链，其分子具有3种不同的构型：1）当其两条多核苷酸链均保持着完整的环状构型时，成为共价闭合环形DNA，即cccDNA。这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型。2）如果两条多核苷酸链中只有一条保持着

11、完整的环状结构，另一条出现一至数个缺口时，称为开环DNA（ocDNA），此即OC构型。3）若质粒DNA经过适当的限制酶切割后，发生双链断裂而成线性分子（L-DNA)，通称L构型。在正常的电泳条件下，不同构型的质粒DNA，尽管分子质量相同，但是仍然具有不同的电泳迁移率，其大小顺序为：cccDNA(scDNA)L-DNA(线性DNA）OC-DNAD-DNA(二聚体DNA）T-DNA（三聚体DNA）。经过合适的限制酶处理后所有结构的DNA都转化为线性分子。3质粒的大小差异大，最小的不到1kb,最大的甚至超过500kb。4宿主细胞在标准培养条件下，一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。5理

12、论上讲，几乎所有的细菌都含有质粒。几乎所有的质粒都会带有一个至多个基因，而这些基因的表达常常赋予细胞有用的特性。6质粒DNA都含DNA的复制起始点，这使得质粒可在宿主细胞中独立复制，分子质量小一点的DNA可利用宿主细胞中的DNA复制酶来进行自身的DNA复制；分子质量大一点的DNA本身含有DNA复制时所用酶的基因，质粒DNA复制时所用的DNA复制酶是自身DNA基因表达的产物，还有一些质粒DNA能将自身的DNA插入到寄主细胞染色体上，随寄主染色体复制而复制。常用电泳缓冲液种类及特点TAE50242gTris57.1ml冰乙酸100ml0.5mol/L EDTA(pH8.0)双链DNA分子的泳动速率

13、比另两者快10%，超螺旋在其中电泳时更符合实际分子质量，回收DNA片段时首选，大片段分离效果好，缓冲容量小，过夜电泳不可选用。TBE554gTris27.5硼酸20mol0.5mol/L EDTA pH8.0小片段（1kb）分离效果好，回收率差，不宜用于回收电泳。缓冲容量大，过夜电泳适合TPE10108gTris15.5ml磷酸（85%，1.679g/ml)40ml 0.5mol/L EDTA pH8.0磷酸盐的浓度偏高，容易使DNA沉淀，也不适合回收电泳，缓冲容量大，过夜电泳适合电泳缓冲液组成及其作用类型6缓冲液储存温度0.25%溴酚蓝40.25%二甲苯氰FF40%蔗糖水溶液0.25%溴酚蓝

14、室温0.25%二甲苯氰FF15%聚蔗糖水溶液0.25%溴酚蓝40.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液作用：增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔中；在电泳中形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳速度和位置；使样品呈色，使加样操作更方便。DNA沉淀两种方法的优缺点1乙醇优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点： 需要量大，一般要求低温操作。2异丙醇优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70乙醇漂洗数次。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离物质原理（三个效应

15、）不连续电泳凝胶采用两层或3层性质不同的凝胶（样品胶，浓缩胶和分离胶）重叠起来会用，前两种胶的缓冲液、PH和孔径大小完全一样，不同的是浓缩胶中无样品。分离胶的孔径较小，PH也不同，能使能读较低的各组分在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨率。第一 三个不连续：凝胶孔径的不连续 缓冲液离子组成及各层凝胶ph的不连续 在电场中形成的电位梯度的不连续第二 不连续系统中的三种物理效应电荷效应 酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电荷作用下向一定的电极及一定的速度移动。分子筛效应 相对分子质量或构型不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，所受摩擦不同，受阻程度不同，表现出不同的迁移率浓缩效应 使待分开样品中的各组

16、分在浓缩胶中被压缩成层。基因的化学合成：人工合成的短DNA片段5末端为OH，而天然的DNA5末端为P.（磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法）基因组装方法：全片段酶促链接法：带上必要的5磷酸基团，与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，加入T4DNA连接酶，使它们彼此连接组装成一个完整的基因或基因片段，这些组装的产物插入到适当的载体上，转化受体细胞，最后用DNA序列分析检测所组装的基因。例如：干扰素和牛视紫红质基团。酶促填充法：将两条具有互补3末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，产生的单链区断在加入的klenow酶的聚合作用下合成互补链，再和载体连接。PCR组成成分

17、，标准的PCR反应体系：10扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR引物设计原则Primer Design: 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 引物不能形成二级结构。 引物长度一般在1530碱基之间。 G+C含量在40%60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物5端可以修饰。 引物3端不可修饰。 引物3端要避开密码子的第3位。什么是PCRPCR技术是一种通过模

18、拟体内DNA的复制方式，在体外两种分别与基因两端不同DNA链互补的特异引物，经聚合酶酶促作用下选择性地将DNA某个特殊区域快速扩增出来的技术。什么是不对称PCR Asymmetric PCR不对称PCR是用不等量的一对引物（非限制性引物与限制性引物），PCR扩增后产生大量的单链DNA。什么是反向PCR Inverse PCR一种用于指数式扩增位于一个已知DNA区段的PCR法。什么是巣式PCR Nested PCR. 方法由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成，在第一轮扩增中，使用一对引物产生扩曾产物，然后用一对内引物对第一轮扩增的产物进行第二轮扩增，用于DNA及RNA病毒的检测。什么是基因定点

19、诱变 Site-directed mutagenesis是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。（体外特异性改变某个碱基的技术）盒式诱变cassette mutagenesis是利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段取代野生型基因中的相应序列获得数量众多的突变体。kunkel定点诱变原理诱变之前将复制型的MB噬菌体转化到dut和ung双缺陷型菌株中生长，dut突变导致dutp水平升，ung突变则会使尿嘧啶取代DNA链中的胸腺嘧啶，因此，从dut-ung-大肠杆菌寄主中制备MB 单链DNA模板含有许多尿嘧啶残基，进行寡核苷酸引物诱变，产生的异源双链DNA

20、导入大肠杆菌ung+菌株野生型模板复制之前被降解，合成链不会被降解，正常复制，从而产生大量的突变体，提高突变的效率。常见的印记杂交 A southern杂交：检测DNAnorthern杂交：检测RNAwestern杂交：检测蛋白质B点印记，狭缝印迹（dot blotting/slot blotting)C原位杂交（in situ hybridzation)什么是放射自显影Autoradiography(放射自显影): 利用放射性同位素所发射出来的带电离子(或粒子)作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，用显影液显示这种潜影，成为可见的“像”。三限制性内切核酸酶的种类分为三类：型、型、型型、型

21、型ATP、Mg2+AAC N6I GCTTGA N8T GCT1000bp以外切割Mg2+回文序列切割位点在识别位点区域ATP Mg2+AG AACCAGCA24-26bp外切割限制性内切核酸酶的命名方法例如EcoRIE:表示大肠杆菌属名的第一个字母；co:表示种名的前两个字母R：表示株名；I:表示该菌种中第一个被分离出的酶。同裂酶 同尾酶 新裂酶的区别同裂酶：相同识别位点和切割位点不同但来源不同的酶称为同裂酶。新裂酶：来源不同相同识别位点但切割位点不同的酶。同尾酶：来源不同，识别位点不同，切割位点也不同，但产生了相同的粘性末端的酶。影响限制性内切核酸酶酶活性的因素a能源分子浓度；b酶浓度，例

22、如，T4DNA连接酶在连接平末端时酶用量为12单位连接效率最高；而在连接粘性末端时酶用量为0.1单位时便能得到最佳的连接效率。c反应时间;d反应温度，对DNA连接酶而言，连接粘性末端最适37，在此温度下，粘性末端处氢键易遭热破坏降低粘性末端结合的速率；因此，连接粘性末端最佳温度应介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15比较合适。e作为底物的DNA片段的摩尔比等。典型酶切反应体系组成无菌水 14ul10buffer 2ulBSA牛血清蛋白（保护酶） 2ulDNA样品0.2-1ug在TE 1ul保护酶2-10ug 1ul最终体系 20ul酶在冰上，最后加入反应中，加入酶前把它们全混匀。

23、酶加样顺序一般为：水+缓冲液+DNA+酶，以保证酶的活性。什么是星号活性及其引起因素星号活性：某些条件下，一种特异性识别顺序的限制性内切酶，在每位同一种DNA片段时 会产生新的酶切微位点而得到不同的酶切片段，这种酶活性则称星号活性。引起因素： 高浓度的甘油（5%） 低离子强度小于25mM 高PH(8.0） 乙醇，乙二醇等有机溶剂 Mn2+、Cu2+、Co2+等正离子，与Mg2+竞争物理图谱physical map （Restriction Maps限制性图谱,)(限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱)。限制性图谱分布图，顺序，距离（如图）常用DNA连接酶的特性T4DNA连接酶:来源T4噬菌

24、体，粘性末端和平末端都可连接，必须以ATP作为辅助因子E.coliDNA连接酶:来源于大肠杆菌，只催化双链DNA片段互补粘性末端之间的连接。连接反应温度16匹配末端连接的方法存在的问题及其解决方案匹配粘性末端：同一种酶切割，混合在一起，自己发生配对，连接。产生的问题：a.载体自身环化降低了重组子的效率b.插入的外源DNA片段有两个方向解决方法：a.碱性磷酸酶的处理，去除载体DNA片段的5磷酸，阻止载体DNA分子的自身环化，从而增加了重组DNA的比率。b.利用双酶切的方法来实现基因的定向克隆，没有合适的双酶切的位点可以通过加衔接物的方法实现定向克隆。不匹配粘性末端如何进行连接？a.将粘性末端修饰

25、成平末端。b.将平末端修饰成互补粘性末端（补平）平末端的连接方法（提高平末端的效率）a.T4DNA连接酶连接平末端提高T4DNA酶的浓度；提高DNA片段的浓度；降低ATP浓度，以增强连接物与DNA结合；加入多胺化合物，如亚精胺，降低DNA静电排斥力；加入浓缩剂，如大分子排阻物聚乙二醇（PEG）、强水化合物三氯化六氨钴等。b.同聚物加尾法 ccc一般用GC更稳定c.衔接物连接法 两端平末端，人工合成双链使得一端为平末端，另一端为粘性末端d.DNA片段接头连接法接头它是一类由人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。衔接物是指用化学法合成的一段由1012个核苷酸

26、组成具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。Klenow大片段DNA聚合酶在枯草杆菌蛋白酶下生成大片段和小片段，大片段即为klenow片段，是具有35核酸外切酶活性及聚合酶活性。末端脱氧核苷酸转移酶的特性 合成方向53 合成时不要模板，但底物至少要3个核苷酸， 对dNTP非特异性，任一种都可以作前体物， 可催化3OH末端单链或3OH突出的双链， 需要Mg+或Mn+， 用Co+代替Mg+作辅助因子，可在平末端 DNA分子上进行末端转移。用途： 给载体或cDNA加上互补同聚物尾， 标记DNA片段的3OH端，可用32PdNTP 也可催化非放射性标记物参入DNA 3末端 可按底物合成

27、多聚脱氧核苷酸同聚物。修饰酶：碱性磷酸酶将DNA RNA或蛋白质的5”磷酸基团切掉，防止DNA的自身环化和5”末端标记前的去鳞。多聚核苷酸激酶 将ATP的5磷酸盐催化转移到DNA RNA的5”端，常用于正向反应，交换反应。RNA酶A（核糖核酸酶A） a可特意剪切3”末端为嘧啶核苷酸的单链RNA，将RNA降解为3磷酸化的单核苷酸和低聚核苷酸。 b低盐(0100mmol/L)可以切割单链双链杂交双链 c 高盐0.3mol/L只切单链S1核苷酸酶（Nuclease)的特性以内切酶方式降解单链DNA及RNA，产生以5”磷酸为末端的产物，双联核苷酸不能被降解，除非是有极高浓度的醇。该酶可以用于去除双链D

28、NA的单链末端、单链DNA的选择性切除和RNA转录图谱。四载体:是细菌的DNA，运载外源基因进入宿主细胞，并在宿主细胞内进行复制和表达。穿梭载体：质粒的迁移：有一些非接合型质粒在接合型质粒的帮助下，从一个细胞转移到另一个细胞的作用称之为质粒的迁移性。载体需要满足的条件/具有的特点低分子量；选择标记；高拷贝的宿主细胞；复制序列（复制起始位点）；有多个限制酶的识别位点且切点是单一的，供外源基因插入；较高稳定性，可以稳定遗传不易丢失；安全性；扩增。质粒的不相容性在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒是不能在同一宿主细胞中稳定共存的，这一现象称为不亲和性或者不相容性。常见的载体结构pEMB

29、 PBR PUCpEMBL8PBR:PUC:如何鉴定重组噬菌体： a.蓝白筛选：清亮噬菌斑为重组子，蓝噬菌斑为非重组子。 b.SPI表型筛选原理 定义 野生型噬菌体在带有P2原噬菌体的溶原性E.coli的生长会受到限制的表型，称作SPI，即对P2噬菌体的干扰敏感。这种生长抑制作用是受噬菌体red和gam这两个基因编码的产物控制的。如果噬菌体缺少两个参与重组的基因red 和gam同时带有chi位点，并且宿主菌为rec+，则可以在P2溶原性E.coli中生长良好，噬菌体的这种表型 称作spi-，因此，通过噬菌体载体DNA的red或gam基因的缺失或替换，可在P2噬菌体溶原性鉴别重组和非重组噬菌体，

30、能够在噬菌体P2溶原性的大肠杆菌中生长并形成噬菌斑。噬菌体载体的野生型为什么不能作为基因克隆的载体？a.DNA基因组大而且复杂，特别是其中具有许多基因克隆常用的限制酶识别位点。b.噬菌体外壳只能接纳一定长度（相当于基因组75%105%）DNA分子。因此，DNA只能作为小片段外源DNA分子（2.5kb左右）的克隆载体。这一克隆容量是显然不能满足大多数基因克隆工作的要求，必须对其进行改造。噬菌体包装限制范围70%噬菌体150构建的噬菌体载体类型（两种）插入型载体：一类可容纳一定长度DNA片段的噬菌体载体，在克隆时无需去除与插入大小相当的片段。容纳外源基因15kb替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代在其中央部位有一个可以