兽医临床诊疗技术学第十章 血液生化检验.docx

兽医临床诊疗技术学第十章 血液生化检验.docx

《兽医临床诊疗技术学第十章 血液生化检验.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《兽医临床诊疗技术学第十章 血液生化检验.docx（15页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

兽医临床诊疗技术学第十章血液生化检验

第十章　血液生化检验

第一节　常检的血液生化项目

　　一、血清总蛋白测定（双缩脲法）

　　㈠原理在强的碱性条件下，蛋白质或多肽的肽键可与硫酸铜溶液产生紫色反应，在540nm波长处的吸光度与蛋白的含量成正比。

产生此反应的最简单的化合物是双缩脲（H2N-CO-NH-CO-NH2），故称双缩脲反应。

　　㈡器材与试剂

　　1.分光光度计，微量吸管。

　　2.双缩脲试剂：

用新鲜蒸馏水溶解硫酸铜（CuSO4·5H2O）3.0g，酒石酸钾钠9.0g，碘化钾5.0g；加入刚配制的6mol／L氢氧化钠100ml，再用蒸馏水稀释至近1L时摇匀，加蒸馏水至1L。

充分混匀置聚乙烯瓶内，盖严保存。

　　3.总蛋白标准液：

50.00g／L，或标定蛋白含量的标准混合血清。

　　㈢操作取血样、标准液、质控血清（或生理盐水）各50μl，均分别加入双缩脲试剂5.0ml，混匀，置37℃水浴30min后，于540nm处比色，以空白试剂调正吸光值至零，读取各管吸光值。

　　㈣计算　（Au-Ab／As-Ab）×50＝血清总蛋白（g／L）

注：

Au、As、Ab分别为样品、标准液、空白的吸光值。

　　　参考值：

健康动物的蛋白含量（g／L）如下。

　　　　总蛋白　　　白蛋白　　球蛋白　　A／G

　　马　　58.1-76.521.5-33.527.0-52.00.62-1.45

黄牛68.0-94.534.0-55.529.5-59.0

奶牛85.5-12236.0-63.033.3-74.50.84-0.94

猪79.0-10320.0-46.031.0-82.00.37-0.51

　　犬58.0-79.0　34.0-45.020.0-37.00.60-1.10

　　猫　　54.0-79.026.0-33.026.0-51.00.45-1.20

　　㈤注意事项

　　1.本法配方是国际临床化学学会（IFCC）推荐，在实际使用时，测定液常会出现混浊现象，原法中每个样品须做测定空白管。

建议将试剂中各组分适当减少至硫酸铜1.5g，酒石酸钾钠6.0g，碘化钾3.0g，氢氧化钠不变，可以减少混浊。

但显色线性将有损失，不过按本法的样品与试剂用量比例（1:

100），测定仍无影响。

　　2.本法适于手工与自动检测，但敏感性不高，适用于血清及蛋白含量在20g／L以上的样品，脑脊液、尿液等不适用。

　　3.胆红素在0.25g／L、Hb在1g／L以下的血清基本无干扰。

　　4.结果的准确性与蛋白标准液是否准确，质控措施是否落实有较大关系。

　　㈥临床意义

　　1.血清总蛋白升高：

①血液浓缩，见于脱水症如高热、下痢、腹泻、大面积烧伤等；②血浆蛋白合成异常亢进，见于骨髓瘤。

　　2.血清总蛋白降低：

①血中水分潴留；②血浆蛋白合成障碍，如肝硬化；③蛋白大量丢失，如肾病综合症中大量蛋白尿；大出血；严重烧伤后大量血浆渗出；缺乏硒-维E时的渗出性素质；④营养不良，蛋白摄入不足；⑤吸收不良，如下痢、球虫病等。

　　　〔附〕　折射法

　　㈠特点　本法无需试剂，只用血清（或尿液、渗漏液等之液状样品）1滴，即可直读样品蛋白含量和比重；折射计体积小巧、携带方便，使用便捷；检测时不必使用其他设备与能源，成本低廉；检测范围为0～120g／L、精确度可达2.0g／L。

　　㈡器材　D-2型蛋白屈折计；胶头吸管；擦镜纸。

　　㈢操作

　　1.调焦：

将屈折计物镜朝光亮处，调节目镜视度调节环，使刻度清晰可见。

　　2.调零：

加1滴蒸馏水于棱镜面，关闭盖板后调节校正W线，使明暗界线与W线一致。

　　3.检测：

打开盖板并擦净棱镜端面后，滴入1～2滴血清样品再关闭盖板，目视到明暗分界线所对应的数据即为所求之数值。

　　㈣注意事项

　　1.被检血清不宜放置过久，否则会因蒸发而使血清变浓，测定值偏高。

　　2.要避免血清溶血；加血样时，切勿出现气泡；血量要加足使充满整个视场并涂抹均匀，至明暗界线清晰可见。

　　3.每测完一个样本后，务必要擦干、清净棱镜面，然后再测其他样本。

　　4.本法不适于高脂血、高色素血的蛋白检测。

　　二、血清白蛋白测定（溴甲酚绿法）

　　㈠原理　在pH4，白蛋白带正电荷,能与阴离子染料溴甲酚绿（BCG）结合，使BCG试液从黄色转变成绿色。

绿色的深浅与白蛋白浓度成正比。

BCG与白蛋白反应迅速，而与球蛋白反应则慢而弱，故立即比色，球蛋白对其基本无干扰。

　　㈡器材与试剂

　　1.分光光度计　微量吸管

　　2.BCG试剂：

BCG150mmol／L；柠檬酸缓冲液75mmol／L；叠氮钠1.5mmol／L；Brij-35（聚氧化乙烯月桂醚）2.4g／L；pH4.2。

　　在约0.9L蒸馏水中溶解BCG钠盐108.0mg、无水柠檬酸19.2g、叠氮钠100mg、Brij-35（300g／L）8ml，混匀后用1mol／L氢氧化钠调pH至4.20，加水至1L。

　　3.白蛋白标准液：

40.00g／L。

　　㈢操作　血清、标准液及生理盐水各20μl，分别加BCG试剂4.0ml，混和，于室温放置10分钟后比色，628nm处以空白试剂调零，读取各管吸光值。

　　㈣计算　（Au-Ab／As-Ab）×40＝血清白蛋白（g／L）

　　　参考值见血清总蛋白测定。

　　㈤注意事项

　　1.Brij－35是非离子型表面活性剂，可使空白吸光度降低，且可消除血清的混浊，提高反应的敏感性。

　　2.血清如有轻度溶血、黄疸或脂血，对检测基本无干扰。

严重溶血或混浊时，可用缓冲液作血清空白，扣除其读数。

　　3.肝素对本法有干扰而使结果偏低，故不宜用肝素抗凝的血浆测定白蛋白。

　　㈥临床意义　与总蛋白的基本相同。

　　1.血清白蛋白升高：

①血液浓缩，见于脱水症如高热、下痢、腹泻；②血浆蛋白合成异常亢进，见于骨髓瘤。

　　2.血清白蛋白下降：

①白蛋白合成不足：

肝硬化、慢性肝炎等慢性肝病，淋巴细胞性白血病；②白蛋白丢失过多：

肾病时由尿丢失，胃肠病时由消化道丢失，而大面积烧伤、硒与维生素E缺乏时由皮肤渗出；③消耗过多：

甲亢、恶性肿瘤、慢性发热等；④蛋白摄入不足：

营养不良或吸收障碍。

　　三、血清球蛋白测定（乙醛酸比色法）

　　㈠原理球蛋白含色氨酸比白蛋白高得多，乙醛酸可与球蛋白分子中的乙酰色氨酸在酸性介质中缩合成紫色化合物，利用此呈色反应可直接测定血清球蛋白含量。

试剂中的铜离子能促进该反应，本法在临床检验中应用较多。

　　㈡试剂1.乙醛酸试剂：

5水硫酸铜1.0g于蒸馏水90ml中溶解，与冰醋酸400ml，乙醛酸1.0g混合，缓加浓硫酸60ml搅匀冷却后，以冰醋酸定容至1L。

　　2.标准液：

N-乙酰-DL色氨酸1.75g溶于10ml的0.75mol／L氢氧化钠中，以蒸馏水稀释至1000ml，此液相当于血清球蛋白30.0g／L。

　　㈢操作　取试管两支，标明"测定"及"标准"，吸取血清20μl加于测定管中、标准液20μl加于标准管中，分别加入乙醛酸试剂4ml，充分混匀，加盖后置沸水浴中准确加热4min，冷却后用分光光度计在550nm处比色，以乙醛酸试剂调零，读取各管吸光度。

　　㈣计算　（测定管A／标准管A）×30＝血清球蛋白（g／L）

　　㈤临床意义

　　1.引起血清球蛋白升高的原因：

①慢性肝病，以γ-球蛋白增高为主；②某些自身免疫性疾病，免疫功能亢进时，如风湿热、类风湿性关节炎、硬皮病、皮肌炎等；③慢性感染可使免疫反应增强，如血吸虫病、结核病等；④肿瘤如骨髓瘤、淋巴瘤等。

　　2.引起血清球蛋白降低的原因：

①抑制机体免疫功能的疾病；②使用皮质激素或其它免疫抑制剂时，可使球蛋白合成减少；③遗传性的低γ-球蛋白血症。

　　四、血清钙测定（O-CPC比色法）

　　㈠原理邻甲酚酞络合铜（O-CPC）在碱性溶液中与钙镁离子作用，生成紫色复合物，试剂中的8-羟基喹啉能排除样品中镁的干扰，故颜色强度与钙离子浓度成正比。

用同样的方法处理钙标准液，580nm处比色，可算出血清钙离子的含量。

　　㈡试剂

　　1.显色应用液：

（O-CPC）与0.1NNaOH溶液，临测前将二者等量混合。

　　2.钙标准液（2.50mmol／L）；亦可自行配制：

称取干燥碳酸钙（C.P）250mg置于1000ml容量瓶中，加蒸馏水约100ml、浓盐酸1ml，待溶解后以蒸馏水稀释至刻度。

　　㈢操作

　　　　　步　骤　　　　　测定管　　　　标准管　　　　空白管

　　　　　血清ml0.02--

　　　　　钙标准ml　　　　　-　　　　　0.02-

　　　　　去离子水ml　　　　-　　　　　　　-　　　　　0.02

显色液ml　　　　1.0　　　　1.0　　　　1.0

　　充分摇匀，室温放置3min，用去离子水调零，在573nm处测吸光度。

㈣计算　（Au-Ab／As-Ab）×2.5＝血清钙mmol／L。

参考值（mmol／L）如下：

　　　马2.3～3.0；黄牛2.0～2.7；奶牛2.0～3.0；猪1.9～3.3；犬2.3～2.9；猫2.0～3.3。

　㈤注意事项

　　1.测试所用的器皿均应经过彻底清洁处理（可用稀盐酸浸泡，再用去离子水冲洗，之后烘干），严格防止钙污染，否则结果会有偏差。

　　2.高浓度的胆红素对钙测定有负干扰，而溶血则有正干扰。

　　3.若在试剂中加入8-羟喹啉，可消除镁的干扰。

　　㈥临床意义钙是体内含量最多的无机元素，血清中的钙主要有三种形式存在，即钙离子（约占45％）、柠檬酸钙（约占5％）、蛋白结合钙（约占50％）。

前两者称为可扩散钙，后者称为非扩散钙。

血清钙增减的意义：

　　1.血清钙增高（hypercalcemia）：

肠炎、脱水、酸中毒、紫外线照射后。

　　2.血清钙降低（hypocalcemia）：

骨软症、佝偻病、贫血、白血病。

　　五、血清无机磷测定（紫外法）

　　㈠原理　以血清中无机磷直接与试剂结合产生非还原性磷钼酸，在波长340nm处读取吸光度，从而求得结果。

　　㈡试剂

　　1.钼酸试剂500ml；2.表面活性剂5ml；3.磷标准液。

　　㈢操作　于临测前将钼酸试剂与表面活性剂按100:

1混匀，作为显色剂。

自动分析仪检测按下表操作（单位:

mL），手工法则按比例加2～4倍量。

　　　　　步　骤　　　　　测定管　　标准管　　空白管

　　　　　血清　0.02　—　　　　—

　　　　　磷标准应用液　　　—　　　0.02　　—

　　　　　显色剂　　　　1.01.01.0

混匀，放置10min后，在340nm处比色。

以空白管校正光密度至零，读取测定管及标准管的光密度（OD）。

　　㈣计算　（Au-Ab／As-Ab）×标准浓度＝血清磷（mmol／L）。

参考值（mmol／L）如下：

　　　马0.7～2.1；黄牛1.5～2.3；奶牛1.2～2.1；猪1.3～3.6；犬0.9～1.8；猫1.5～2.5。

　　㈤注意事项

　　1.应尽快分离出血清，以免红细胞中的有机磷水解成无机磷而令结果偏高。

　　2.血液标本不能溶血。

　　3.室温低于5℃时，制备的血清滤液往往混浊。

为此，可在血清中加入三氯醋酸溶液混合后，置于37℃的温箱或水浴中10min以上，然后离心沉淀。

　　六、血糖测定（葡萄糖氧化酶-过氧化物酶比色法）

　　血糖含量的测定方法较多，以下介绍一种特异性较强的酶促反应比色法。

　　㈠原理　葡萄糖可被葡萄糖氧化酶（GOD）氧化成葡萄糖酸，并产生过氧化氢，后者与苯酚及4-氨基安替比林在过氧化物酶（POD）作用下生成红色化合物，该化合物的吸光度与葡萄糖含量成正比。

反应过程如下：

　　　　　　　　　　葡萄