PCR技术包含引物设计.docx
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PCR技术包含引物设计
聚合酶链式反应(PCR)
原理:
DNA的半保留复制时,双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验条件下,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。
因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性-退火(复性)-延伸三个基本反应步骤构成:
①模板DNA的变性:
模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
②模板DNA与引物的退火(复性):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至40~60℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸:
DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下,于72℃左右,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR技术分类(常用)
(1)反向PCR技术(InversePCR,IPCR):
反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法.主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA.后酶切片段自身环化.以环化的DNA作为模板,用一对与已知序列两端特异性结合的引物,扩增夹在中间的未知序列。
该扩增产物是线性的DNA片段,大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。
用不同的限制性内切酶消化,可以得到大小不同的模板DNA,再通过反向PCR获得未知片段。
(2)锚定PCR技术(AnchoredPCR,APCR):
用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列,然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增,称为APCR。
(3)不对称PCR技术(asymmetricPCR):
两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。
在扩增循环中引入不同的引物浓度,常用50~100÷1比例。
在最初的10~15个循环中主要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。
(4)反转录PCR技术(reversetranscriptionPCR,RT-PCR):
当扩增模板为RNA时,需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。
应用非常广泛,无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。
(5)巢式PCR技术(NEST-PCR):
先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量,然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带,此为巢式PCR。
若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。
为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些,且用量较少,同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度,这样在第一次PCR时,由于较高退火温度下内引物不能与模板结合,故只有外引物扩增产物,经过若干次循环,待外引物基本消耗尽,无需取出第一次PCR产物,只需降低退火即可直接进行PCR扩增。
这不仅减少操作步骤,同时也降低了交叉污染的机会。
这种PCR称中途进退式PCR,主要用于极少量DNA模板的扩增。
(6)多重PCR技术(multiplexPCR):
在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。
主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。
(7)重组PCR技术:
重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中,两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。
(8)原位PCR技术:
利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。
直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增,可进行细胞内定位,适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。
(9)荧光定量实时PCR技术
反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升,最终DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算,Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平均每次的扩增效率,n表示循环次数。
平均扩增效率理论值为100%,但实际情况达不到,反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,此效应称平台期,与DNA聚合酶数量和活性、PCR扩增效率、非特异性产物的竞争等因素有关。
PCR扩增产物
可分为长产物片段和短产物片段两部分,短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间,是需要扩增的特定片段。
短、长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3’端开始延伸,其5’端是固定的,3’端则没有固定的止点,长短不一,这就是长产物片段。
进入第二个反应周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(长产物片段)结合引物在与新链结合时,由于新链模板的5’端序列是固定的,故这次延伸的片段3’端被固定了止点,保证了新片段的起点、止点都限定于引物扩增的序列以内,形成长短一致的短产物片段。
由于短产物片段是按指数倍数增加,而长产物片段则以算术倍数增加,故可忽略不计,使得PCR的反应产物不需再纯化既可以保证足够纯的DNA片段供分析、监测。
反应五要素---引物、模板、DNA聚合酶、四种dNTP、Mg2+
(1)引物设计
①引物长度:
15-30bp,常用为20bp左右。
②引物扩增跨度:
以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:
G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布,引物自身连续互补碱基不能超过3个,一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。
【引物的GC含量和Tm值应该协调:
Tm=4(G+C)+2(A+T)】
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端为关键碱基,是PCR延伸的起始端,不能进行任何修饰,也不能形成二级结构的可能,一般3‘端也不能发生错配,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
5’端无严格限制,只起限定PCR产物长度的作用,对扩增特异性影响不大,因此常用来引进修饰位点或标记物。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
⑧引物量:
每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
(2)DNA聚合酶:
目前有两种TaqDNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量0.5-2.5U/50ml,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
(3)dNTP的质量与浓度:
dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1MNaOH或1MTris-HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
(4)模板(靶基因)核酸:
模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是:
溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
(5)Mg2+浓度:
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。
RT-PCR--是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。
总RNA提取(-70℃保存)
Trizol法:
1、取组织100㎎于玻璃匀浆器中,加入1mlTrizol冰上抽打匀浆(边匀浆边暂停)
2、移入1.5mlEP管中,颠倒混匀,室温保存5min
3、加氯仿0.2ml(总体积的1/5),振荡混合,室温放置5min
4、4℃,离心12000rpm,15min
5、取上层液相(约400μl)移入一新1.5mlEP管中,加等体积异丙醇(约400μl),振荡混合,室温保存10min
6、4℃,离心12000rpm,10min
7、弃上清液,加1ml75%无水乙醇(4℃保存),振荡混合
8、4℃,离心7500rpm,5min
9、弃上清液,室温放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥(不能完全干燥)
10、加20ulDEPC水至EP管中,在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解(可保存在液氮或低温冰箱-70℃)
测RNA浓度:
走RNA变性电泳观察18s、28s条带,分光光度计检测260/280吸光度比值
调零:
750ulDEPC水
测量:
745ulDEPC水+5ulRNA
总RNA浓度=OD260×40×稀释倍数(150倍)ug/ml
=OD260×40×150ug/ml
=OD260×6ug/ul
A1/A2应在1.8-2.0之间
注意:
提取RNA的质量主要是要通过260/280的比值看是不是在2.0左右,当OD260/OD280<1.8时提示有蛋白或酚的污染,需要进一步纯化RNA;还要跑胶看看28s、18s、5s的三条带是不是清晰,一般质量好的RNA,28s:
18s的亮度比例在2:
1左右,最后一条5s的应该比较淡。
②逆转录RT(cDNA:
一周内-20℃保存,长期-70℃保存)
RT反应体系:
20ul体系
第一步:
约20分钟
RNA抽提物5μl
Radome引物2μl
RNAsin0.5μl
1、65℃15分钟
2、立即放入冰浴
第二步:
约2小时
RNAsin0.5μl
10mMdNTP1μl
5×RT缓冲液4μl
25mMMgCl24μl
AMV3μl
1、37℃1.5小时
2、94℃5-10分钟
3、反应物保存于-20℃或进行PCR
③聚合酶链反应PCR(产物-20℃保存)
PCR反应体系:
100μl体系
约4.5小时约5小时
25mMMgCl22μl3μl
10×PCR缓冲液5μl5μl
10mMdNTP1μl1μl
10pmol/μl上游引物2.5μl2.5μl
10pmol/μl下游引物2.5μl2.5μl
cDNA模板2.5μl5μl
ddH2O34μl30μl
Taq酶0.5μl1μl
轻质石蜡油50μl50μl
1、94℃2分钟,55℃1分钟,72℃2分钟为第一个步1个循环
2、94℃45秒,55℃40秒,72℃1分钟为第二步30/40个循环
3、72℃10分钟
4、取出后4℃保存,5分钟后-20℃保存或走电泳
④琼脂糖凝胶电泳:
约1.25小时
1、配制0.5×TBE电泳缓冲液300ml
2、配制凝胶浓度1.7%(40ml0.5×TBE加0.68g胶),微波炉中火2分钟溶解胶,冷却至60℃加入溴乙锭2μl(10mg/ml的终浓度0.5μg/ml),充分混匀
3、将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后现进行电泳
4、加样8μlPCR反应产物+2μl溴酚兰,空一格加DNAmarker
5、电泳50-80V,电场强度不宜高于5V/cm
6、在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存。
电泳缓冲液(5×TBE贮存液):
Tris54g、硼酸27.5g、0.5MEDTA20mlpH8.0、加蒸溜水至1000ml。
使用时,将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度)。
上样缓冲液(6×缓冲液,4℃保存):
0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油
琼脂糖凝胶配制:
(1.0%)1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液,微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶,一定要煮透,以不出现泡沫为标志),熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭5μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼脂糖凝固)后现进行电泳。
1.5%同上,将琼脂糖的量改为1.5g。
试剂:
1、DEPC水:
吸出1mlDEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml,配成1‰DEPC水,并充分振荡混匀备用。
2、75%乙醇:
用无水乙醇+DEPC水配,然后放-20℃保存。
(DEPC水需先高压,高压时注意:
1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头;2.高压时间在40-45分钟,所以水要适当多加一点;3.高压结束后,不要强行放气,要让压力自然下降,不然水会喷出)。
3、异丙醇:
放入棕色瓶中。
4、氯仿:
放入棕色瓶中。
5、轻质石蜡油
Trizol:
一种新型总RNA抽提试剂,可以直接从细胞或组织中提取总RNA。
其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
DEPC:
焦碳酸二乙酯,是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂
随机引物、Oligo(dT)、基因特异性引物:
用于反转录的引物可视实验的具体情况选择
M-MLV、AMV(配10×RT-buffer):
逆转录酶
RNasin:
RNA酶抑制剂
dNTP:
脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dTTP、dCTP、dUTP)
Taq酶(配10×PCR-buffer、MgCl2):
DNA聚合酶
Primer(上游、下游)
Marker:
是分子量不同的DNA片段,主要用途就是DNA分子凝胶电泳时,加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。
附:
TBE(Tris硼酸缓冲液)