分子生物学实验理论及操作答案汇总.docx
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分子生物学实验理论及操作答案汇总
实验答案
一、基本原理题
1、限制性内切酶有那些特点？
能识别双链分子的某种特定核苷酸序列
使每条DNA链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
2、限制性内切酶有那些类型，我们DNA重组时常用的是哪类？
答：
限制性内切酶主要分成三大类。
第一类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中没有多大用处，无法用于分析DNA结构或克隆基因。
这类酶如EcoB、EcoK等。
第二类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。
由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。
所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合DNA分子。
因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、9个、10个和11个核苷酸的。
第二类限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。
这种酶的切割可以有两种方式。
一是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。
另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。
第三类限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。
它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。
但这几个核苷酸对则是任意的。
因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。
这对于克隆基因或克隆DNA片段没有多大用处。
3、何为细菌的限制修饰系统？
是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，主要有限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。
细菌的限制修饰系统包含三个连锁基因：
（1）hsdR：
编码限制性核酸内切酶
（2）hsdM：
编码限制性甲基化酶
（3）hsdS：
编码限制性酶和甲基化酶的协同表达
大多数限制性内切酶常常伴随有1~2种修饰酶（DNA甲基化酶），后者能保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏。
修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同，它们的作用是甲基化每条链中的一个碱基，而不是切开DNA链。
甲基化所形成的甲基基团能伸入到限制性内切酶识别位点的双螺旋大沟中，阻碍限制性内切酶发挥作用。
这样，限制性内切酶和它的“搭档”修饰酶一起组成R-M系统。
在某些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，它们各自独立行使自己的功能；另一些R-M系统本身就是一种大的限制-修饰复合酶，由不同亚基或同一种亚基的不同结构域来分别执行限制或修饰的功能。
4、说说热激转化法和电击转化法的区别。
电击法：
使用瞬时高压电（数千伏特）处理细胞悬液，微生物细胞膜在高压电的作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的孔洞进入细胞内部。
化学法：
使用低渗溶液处理细胞悬液（0.1MCaCl2），微生物细胞膜结构会发生一些变化，使得细胞在热激时（42度90秒）变得很容易从溶液中摄取DNA。
具体机理目前仍然不是十分清楚，但是很有效。
做电击转化时，悬液中有近70%的细胞会因电击而死亡，但是这种方法很直接，转化效率很高。
当需要高的转化效率时，比如制作基因文库，可以采用电击转化，另外，做酵母等真核生物转化时一般都是电击。
化学转化法操作简单，不需要特殊设备，转化效率足以满足一般克隆实验的需要，故使用范围非常广。
5、碱裂解法提取质粒的基本原理是什么？
在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA的氢键断裂，致使宿主染色体DNA变性，但闭合环状的质粒DNA由于拓扑缠绕而不能彼此分开。
当以pH4.0的NaAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，质粒DNA迅速恢复原有的构型，重新形成超螺旋分子，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
6、CsCl密度梯度离心的原理是什么？
将质量差异微小的分子分开。
用氯化铯浓盐液，以105g以上的强大离心力的作用，盐的分子被甩到离心管的底部。
同时，扩散作用使溶液中Cs＋和Cl－离子呈分散状态，与离心力的方向相反，经过长时间的离心，溶液达到一种平衡状态。
反向扩散力与沉降力之间的平衡作用，产生了一个连续的CsCl浓度梯度。
离心管底部溶液的密度最大，上部最小。
DNA分子溶于CsCl溶液中，经过离心，将逐渐集中在一条狭窄的带上。
带上的DNA分子密度与该处CsCl相等。
7、质粒载体具备的基本要素是什么？
是染色质外的双链共价闭合环形DNA、能自主复制，是能独立复制的复制子、质粒对宿主生存并不是必需的。
必须包括三部分：
遗传标记基因，复制区，目的基因。
8、质粒图谱上的MCS指的是什么？
MCS多克隆位点（multiplecloningsite）:
是包含多个（最多20个）限制性酶切位点（restrictionsite）的一段很短的DNA序列。
也称为多位点接头（polylinker），是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列.MCS中，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。
9、按拷贝数，质粒有哪些基本类型？
我们使用的pUC19和pBS属于哪种类型？
高拷贝数的质粒载体
ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。
适合大量增殖克隆基因，或需要大量表达的基因产物。
低拷贝数的质粒载体
由pSC101派生来的载体特点是分子量小的拷贝数。
它有特殊的用途：
当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌的死亡时，就需要低拷贝的载体。
pUC19载体,高达500～700个
以高效克隆的pBS-T为载体,其目的基因拷贝数可等同pUC19载体,高达500～700个
10、氯霉素提高质粒拷贝数的原理是什么？
氯霉素是一种蛋白质合成抑制剂，能够抑制染色体的复制，而不影响质粒pBR322的复制。
这样经过氯霉素处理使得细胞内pBR322得到高拷贝。
11、蓝白斑筛选的基本原理是什么？
蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：
是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。
现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。
如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
12、作为受体的大肠杆菌应该具有什么特性？
遗传背景清楚;目标基因表达水平高;表达系统成熟完善;易于培养（培养方法简单、生长快、培养周期短、抗污染能力强）、成本低;被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。
缺点：
表达产物缺少饭以后的修饰（如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等）；同时高表达时易折叠错误导致表达产物没有活性，而且大肠杆菌本身含有内毒素和有毒蛋白，可能混在产物里，应用受限。
真核基因在大肠杆菌中表达：
1，真核生物的启动子不能被原核细胞（大肠杆菌）的RNA聚合酶识别；2，真核生物的mRNA上没有SD序列，因此不能被原核细胞核糖体结合；3，真核生物的基因含有内含子，原核细胞缺乏见他们的转录物进行拼接加工的机制；4，真核细胞的基因产物，往往需要翻译后加工，真核细胞缺乏翻译后加工有关的酶；5，真核生物基因表达的蛋白质易被原核细胞蛋白酶所降解。
13、转化的概念，转化有哪些方法？
转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。
该现象首先发现于细菌。
质粒转化方法主要有：
高压电穿孔法转化大肠杆菌（电转化法），氯化钙法制备感受态细胞的大肠杆菌转化法．
14、CaCl2制备感受态细胞的基本原理？
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。
此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。
转化效率可达106－107转化子/微克DNA。
本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在低温下进行。
15、热激转化法的基本原理是什么？
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。
被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
16、影响感受态细胞效率的因素有哪些？
1．细菌的生长状态：
实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。
DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；
2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
3．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；
4．化合物及无机离子的影响：
在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；
5．所使用的器皿必须干净。
迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；
6．质粒的大小及构型的影响：
用于转化的应主要是超螺旋的DNA；
7．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；
17、利用分光光度计测定DNA浓度的基本原理是什么？
1OD值相当于多大浓度的双链DNA？
单链DNA？
单链RNA？
DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。
波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。
对标准样品来说，浓度为1μg/ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg/mlssDNA浓度约为37μg/mlRNA浓度约为40μg/ml寡核苷酸浓度约为30μg/ml（youyu底物不同有差异）
当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。
一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。
经验值：
纯DNA：
OD260/OD280≈1.8（＞1.9,表明有RNA污染；＜1。
6，表明有蛋白质、酚等污染）
纯RNA：
1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）
若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量
18、核酸的定性测定中，OD268/OD280比值大小说明什么问题？
符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。
要纠正一下，纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0，样品中如果含有蛋白质及苯酚，A260/A280比值会明显下降。
对于纯的样品，只要读出260nm的A值即可以算出含量。
通常以A值为1相当于50微克/ml双螺旋DNA，或者40微克/ml单链DNA（RNA），或者20微克/ml寡核苷酸计算。
OD260／OD2801.9-2.0RNA居多纯度已经很高了
纯DNA：
OD260/OD280≈1.8（＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）
纯RNA：
1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）
OD是opticaldensity（光密度）的缩写，OD＝1og（1／trans），其中trans为检测物的透光值。
吸光度吸光度,absorbance,是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。
只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。
当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。
吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。
吸光度用A表示，A＝abc，其中a为吸光系数，单位L/（g•cm）,b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm，c为溶液浓度，单位g/L影响吸光度的因数是b和c。
a是与溶质有关的一个常量，温度通过影响c，而影响A。
一般来说OD260代表核酸的吸光度,OD280代表蛋白质的吸光度,OD230代表其他杂质（多糖等）的吸光度。
A260/A280与OD260/OD280的意思是一样的。
A代表吸光值，而OD是光密度值，一个意思。
A260/280比值一度成为判断核酸纯度的唯一通用标准，纯的DNA一般在1.8-2.0之间；后来发现在抽提过程中使用的许多试剂影响A260和A280读数；同时，对同一样品10倍数量级稀释后测定吸光值发现，分光光度计的吸光值仅在一定的区域是线性的。
结论是：
当A260读数处在0.1-0.5之间，A200到A320之间的数值构成一条光滑的曲线时，
少量苯酚（30ul/ml）残留使A230，A260，A280均变大（差不多增加一倍），但A260/A280和A260/A230均在2左右。
少量异硫氰酸胍（132uM）残留使A230变大，但A260，A280几乎不变，所以A260/A280仍在2左右，而A260/A230大大低于2。
大量异硫氰酸胍（2.4M）残留使A230，A260，A280均变大，根本就没有办法测定了。
PEG（6.25%）残留使A230，A260，A280均变大，但对A230，A260影响更大，所以A260/A280比2大不少，而A260/A230仍在2左右。
核酸抽提中常用的试剂，如Phenol，GuanidineIsothiocyanate，PEG都能使A260和A280的值变大，但是却可能使二者的比值与高纯度核酸的比值一致。
因为A260值几乎是峰值，所以有必要在其两边各取一个：
A280和A230。
干净的核酸A260/A230应该在2左右。
如果有在230nm处的强吸收提示污染有酚盐离子等有机化合物
1.蛋白质污染：
确保不要吸入中间层及有机相。
减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。
加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。
如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。
2.苯酚残留：
确保不要吸入中间层及有机相。
加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。
3.多糖或多酚的残留：
一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。
因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。
4.设备限制：
测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。
此范围线性最好。
用水稀释样品：
测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mMTris，pH7.5。
用水作为稀释液将导致比值偏低。
比值低可能有蛋白污染，高了可能有DNA污染，建议你抽提的RNA分三管，两管保存，另一管用来跑胶和测定OD，跑胶是最直观的，1%的胶就可以，抽提后马上跑，一般不会降解很多，所以设备材料不需要去酶处理
不会有影响的。
你的od比低可能是溶解时用的水的PH值偏酸。
可以试着调到8.0左右再测，这样就会上来了。
19、普通琼脂糖凝胶电泳分离DNA的范围是多少？
普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb。
20、聚丙烯酰胺凝胶分离DNA的范围是多少？
丙烯酰胺（%）
有效分离范围（bp）
溴酚兰*
二甲苯青*
3.5
100～2000
100
460
5.0
80～500
65
260
8.0
60～400
45
160
12.0
40～200
30
70
15.0
25～150
15
60
20.0
10～100
12
45
21、分离大片段DNA，比如50kb以上，一般采取什么形式的电泳？
介绍基本原理。
大分子DNA（一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb）在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别（也称“极限迁移率”），不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb之间的DNA片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法（FIGE）。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳（FIGE）设备能把大小范围在10～2000kb的DNA片段分开。
FIGE也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb。
22、检测DNA时，有哪些些形式的染色方式？
原理是什么，各有何特点。
聚丙烯酰胺凝胶-银染、琼脂糖电泳-SYBRGreen
染色及EB染色方法
银染的原理：
一、银离子（一般是AgNO3）和DNA结合;二、还原剂甲醛把Ag+还原成银颗粒，最终DNA呈现为黑褐色。
SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。
在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。
因此，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，未与核酸结合的溴化乙锭可被激发出橙红色萤光。
在与DNA或双股RNA结合时，萤光强度会增强20倍，使得核酸电泳后的胶片可以辨识核酸的相对位置。
在核酸分子中，EB分子插入到两层碱基对之间，发出红色荧光。
在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，这种方法使用于一般性的核酸检测。
23、PCR的基本原理是什么？
包括哪三个基本步骤？
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR是一种体外DNA扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。
模板DNA的变性
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
模板DNA与引物的退火（复性）
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
引物的延伸
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期（Plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
24、PCR扩增产物理论上的计算公式是什么？
PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y=（1+X）n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
25、何为PCR的平台效应，产生的因素包括哪些？
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。
大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
26、PCR中引物设计应该遵循哪些基本原则？
一 设计引物应遵循以下原则
1 、引物长度：
15-30bp，常用为20bp左右。
2 、引物扩增跨度：
以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3 、引物碱基：
G C含量以40-60%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
附加序列（RT site, Promoter sequence）加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们. 引物对的Tm差异不超过5℃， 设计时温度和GC含量是个主要的参数，做复合扩增时更要设计成相近的温度，而且引物加个尾影响不大。
但要切记BLAST，包括查阅文献的引物.如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃, 或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
4 、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
5 、引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第
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