第15章核酸与核酸的研究方法.docx

第15章核酸与核酸的研究方法.docx

《第15章核酸与核酸的研究方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第15章核酸与核酸的研究方法.docx（22页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

第15章核酸与核酸的研究方法

第十五章核酸

核酸是遗传物质

1868年瑞士Miesher.从脓细胞的细胞核中分离出可溶于碱而不溶于稀酸的酸性物质。

间接证据：

同一种生物的不同种类的不同生长期的细胞，DNA含量基本恒定。

直接证据：

T2噬菌体DNA感染E.coli

用35S标记噬菌体蛋白质，感染E.coli，又用32P标记噬菌体核酸，感染E.coli

DNA、RNA的分布（DNA在核内，RNA在核外）。

核酸的化学组成

核酸是一种线形多聚核苷酸，基本组成单位是核苷酸。

结构层次：

核酸

核苷酸

磷酸核苷

戊糖碱基

组成核酸的戊糖有两种：

：

D-核糖和D-2-脱氧核糖，据此，可以将核酸分为两种：

核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）

P330表5-1两类核酸的基本化学组成

碱基

1.嘌呤碱：

腺嘌呤鸟嘌呤

2.嘧啶碱：

胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶

P331结构式

3.修饰碱基

植物中有大量5-甲基胞嘧啶。

E.coli噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶代替C。

稀有碱基：

100余种，多数是甲基化的产物。

DNA由A、G、C、T碱基构成。

RNA由A、G、C、U碱基构成。

核苷

核苷由戊糖和碱基缩合而成，糖环上C1与嘧啶碱的N1或与嘌呤碱的N9连接。

核酸中的核苷均为β-型核苷

P332结构式腺嘌呤核苷胞嘧啶脱氧核苷

DNA的戊糖是：

脱氧核糖

RNA的戊糖是：

核糖

核苷酸

核苷中戊糖C3、C5羟基被磷酸酯化，生成核苷酸。

构成DNA、RNA的核苷酸

P333表5-3

细胞内游离核苷酸及其衍生物

①核苷5’-多磷酸化合物

ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG

在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。

②环核苷酸

cAMP（3’，5’-cAMP）cGMP（3’，5’-cGMP）

它们作为质膜的激素的第二信使起作用，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢。

③核苷5’多磷酸3’多磷酸化合物

ppGpppppGppppApp

④核苷酸衍生物

HSCoA、NAD+、NADP+、FAD等辅助因子。

GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体。

DNA的结构

一级：

脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。

二级：

DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。

三级：

DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。

DNA的一级结构

DNA的一级结构是4种脱氧核苷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）通过3/、5/-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体。

3/、5/-磷酸二酯键是DNA、RNA的主链结构。

P334图5-1

书写方法：

5/→3/：

5’-pApCpTpG-3’，或5’…ACTG…3’（在DNA中，3/-OH一般是游离的）

在DNA分子中，不变的骨架成分磷酸二酯键被逐渐省略，真正代表DNA生物学意义的是碱基的排列顺序。

遗传信息贮存在DNA的碱基排列顺序中，生物界生物的多样性即寓于DNA分子4种核苷酸千变万化的精确的排列顺序中。

DNA的二级结构

1953年，Watson和Crick根据Chargaff规律和DNANa盐纤维的X光衍射数据提出了DNA的双螺旋结构模型。

Watson-Crick双螺旋结构建立的根据

①Chargaff规律1950年

a.所有DNA中，A=T，G=C且A+G=C+T。

P334表5—4。

b.DNA的碱基组成具有种的特异性，即不同生物的DNA皆有自己独特的碱基组成。

c.DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。

d.年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。

②DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射分析。

相对湿度92%，DNA钠盐结晶，B—DNA。

相对湿度75%，DNA钠盐结晶，A—DNA。

Z—DNA。

生物体内DNA均为B—DNA。

Franklin的工作

Watson-Crick双螺旋结构模型

P335图5—2

a.两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条5’→3’，另一条3’→5’

b.嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在外侧。

磷酸与脱氧核糖彼此通过3/、5/-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。

宽1.2nm宽0.6nm

大沟小沟

深0.85nm深0.75nm

c.螺旋平均直径2nm

每圈螺旋含10个核苷酸

碱基堆积距离：

0.34nm

螺距：

3.4nm

d.两条核苷酸链，依靠彼此碱基间形成的氢链结合在一起。

碱基平面垂直于螺旋轴。

A=T、G=C

P336图5—4

碱基互补原则具有极重要的生物学意义，DNA的复制、转录、反转录等的分子基础都是碱基互补。

稳定双螺旋结构的因素

①碱基堆积力（主要因素）形成疏水环境。

②碱基配对的氢键。

GC含量越多，越稳定。

③磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。

④碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。

DNA二级结构的不均一性和多型性

DNA二级结构的不均一性

反向重复序列（回文序列）

DNA序列中，以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同，即对称轴一侧的片段旋转180°后，与另一侧片段对称重复。

较长的回文结构，在某些因素作用下，可形成茎环式的十字结构和发夹结构。

功能还不完全清楚，但转录的终止作用与回文结构有关。

较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。

富含AT的序列

高等生物中，A+T与C+G的含量差不多相等，但在它们的染色体的某一区域，AT含量可能很高。

在很多有重要调节功能（不是蛋白质编码区）的DNA区段都富含AT碱基对。

特别是在复制起点和启动的Pribnow框的DNA区中，富含AT对。

这对于复制和转录的起始十分重要，因为GC对有三个氢键，而AT对只有两个氢键，此处双键易解开。

DNA二级结构的多型性

P339表5-6A-、B-、Z-DNA的比较

B—DNA：

典型的Watson-Crick双螺旋DNA

右手双股螺旋

每圈螺旋10.4个碱基对

每对

螺旋扭角36°

螺距：

3.32nm

碱基倾角：

1°

A-DNA

在相对湿度75%以下所获得的DNA纤维。

A-DNA也是右手双螺旋，外形粗短。

RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。

Z-DNA

左手螺旋的DNA。

天然B-DNA的局部区域可以形成Z0-DNA。

DNA三股螺旋

在多聚嘧啶和多聚嘌呤组成的DNA螺旋区段，序列中有较长的镜像重复时，可形成局部三股螺旋，称H-DNA。

镜像重复：

TAT配对

C+GC酸对

DNA的三链结构常出现在DNA复制、重组、转录的起始或调节位点，第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。

环状DNA

生物体内有些DNA是以双链环状DNA的形式存在，包括：

某些病毒DNA

某些噬菌体DNA

某些细菌染色体DNA

细菌质粒DNA

真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA

环形DNA的不同构象

P340图5-8松驰环、解链环、负超螺旋

松弛环形DNA

线形DNA直接环化

解链环形DNA

线形DNA拧松后再环化

正超螺旋与负超螺旋DNA

线形DNA拧紧或拧松后再环化，成为超螺旋结构。

绳子的两股以右旋方向缠绕，如果在一端使绳子向缠紧的方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。

如果在绳子一端向松缠方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋，以解除外加的旋转所造成的胁变，这样的超螺旋称负超螺旋。

对于右手螺旋的DNA分子，如果每圈初级螺旋的碱基对数小于10.4，则其二级结构处于紧缠状态，是正超螺旋。

如果每圈初级螺旋的碱基对数大于10.4，则其二级结构处于松缠状态，是负超螺旋。

环形DNA的拓扑学特性

以260bp组成的线形B-DNA为例，螺旋周数260/10.4=25。

P340图25-8松驰环、解链环、负超螺旋

①连环数（L）

DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L表示。

松驰环：

L=25

解链环：

L=23

超螺旋：

L=23

②缠绕数（T）

DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示

松驰环T=25

解链环T=23

超螺旋T=25

③超螺旋周数（扭曲数W）

松驰环W=0

解链环W=0

超螺旋W=-2

L=T+W

④比连环差（λ）

表示DNA的超螺旋程度

λ=（L—L0）/L0

L0是指松驰环形DNA的L值

天然DNA的超螺旋密度一般为-0.03~-0.09，平均每100bp上有3-9个负超螺旋。

负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起，很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等需要将两条链分开才能进行的反应。

拓扑异构酶

此酶能改变DNA拓扑异构体的L值。

①拓扑异构酶酶I（拧紧）

能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每一次作用可使L值增加1，同时，使松驰环状DNA转变成正超螺旋。

②拓扑异构酶酶II（拧松）

能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催化使L减少2，同时能使正超螺旋转变成松驰DNA。

染色体的结构

大肠杆菌染色体

大肠杆菌染色体是由4.2×106bp组成的双链环状DNA分子，约3000个基因。

大肠杆菌DNA结合蛋白：

每个细胞

H两个28KD的相同亚基30000个二聚体

HU两个各9KD的不同亚基40000个二体聚体

HLP117KD的亚基20000个单体

P3KD的亚基未知

这些DNA结合蛋白，使4.2×106bp的E.coli染色体DNA压缩成为一个手脚架形结构，结构中心是多种DNA结合蛋白，DNA双螺旋分子有许多位点与这些蛋白结合，形成约100个小区，每个小区的DNA都是负超螺旋，一个小区的DNA有两个端点被蛋白质固定，每个小区相对独立。

图

用极微量的DNA酶I处理时，只能使少量小区的DNA成为松驰状态，而其它小区仍然保持超螺旋状态。

真核生物染色体

主要由组蛋白和DNA组成。

组蛋白是富含碱性a.a（Lys、Arg）的碱性蛋白质，根据Lys/Arg比值不同，可分为H1、H2A、H2B、H3、H4五种，均为单链蛋白质，分子量11000-21000。

H2A、H2B、H3、H4各两分子对称聚集成组蛋白八聚体。

146bp长度的DNA双螺旋盘绕在八聚体上形成核小体。

核小体间DNA长度15-100bp（一般60bp）其上结合有H1

图

2H2A、2H2B、2H3、2H4组蛋白八聚体146bpDNA核小体

串联染色质折叠染色体

DNA（直径2nm）

盘绕组蛋白八聚体上，结合H1，压缩比1/7

核小体（一级结构）

螺旋化，压缩比1/6

螺线管（二级结构）

再螺旋化，压缩比1/40

超螺线管（三级结构）

折叠，压缩比1/5

染色单体（四级结构）

总压缩比：

1/8400~1/10000

DNA的生物学功能

首次直接证明DNA的遗传功能的是Avery的肺炎双球菌转化实验。

P3421~4Avery的肺炎双球菌转化实验

RNA的结构

RNA的一级结构

RNA是AMP、GMP、CMP、UMP通过3/、5/磷酸二酯键形成的线形多聚体。

P343图5-10RNA基本结构

1组成RNA的戊糖是核糖

2碱基中RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中还有一些稀有碱基。

3天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。

双螺旋区一般占RNA分子的50%左右。

RNA的类型

细胞中的RNA，按其在蛋白质合成中所起的作用，主要可分为三种类型。

核糖体RNArRNA

转运RNAtRNA

信使RNAmRNA

此外，真核生物细胞中有少量核内小RNA（smallnuclearRNAsnRNA）

P344表5-7大肠杆菌中的RNA

沉降系数：

单位离心场中的沉降速度，以S为单位，即10-13秒。

如23SrRNA，单位离心场中沉降23×10-13秒

5SrRNA，单位离心场中沉降5×10-13秒

tRNA的结构

tRNA约占全部RNA的15%

主要功能：

在蛋白质生物合成过程中转运氨基酸。

已知一级结构的tRNA有160种，每种tRNA可运载一种特定的a.a，一种a.a可由一种或多种tRNA运载。

结构特点

①分子量在25kd左右，70-90b，沉降系数4S左右

②碱基组成中有较多稀有碱基

图

③3’末端为…CpCpA-OH，用来接受活化的氨基酸，此末端称接受末端。

④5’末端大多为pG…或pC…

⑤二级结构是三叶草形

P345图5-12tRNA的二级结构（三叶草模型）

1966年Crick对于tRNA能识别几种密码子的现象，提出碱基配对的“摆动学说”：

认为除A-U、G-C配对外，还有非标准配对，I-A、I-C、I-U，并强调密码子的5’端第1、2个碱基严格遵循标准配对，而第3个碱基可以非标准配对，具有一定程度的摆动灵活性。

mRNA的结构

mRNA是从DNA上转录而来的，其功能是依据DNA的遗传信息，指导各种蛋白质的生物合成，每一种蛋白质都由一种相应的mRNA编码，细胞内 mRNA种类很多，大小不一，每种含量极低。

从功能上讲，一个基因就是一个顺反子，原核生物的mRNA是多顺反子，真核mRNA是单顺反子。

顺反子：

是由顺反试验所规定的遗传单位，相当于一种蛋白质的基因。

真核mRNA

3’-端有一段约30-300核苷酸的polyA。

PolyA是转录后，经polyA聚合酶添加上，polyA聚合酶对mRNA专一。

原核mRNA一般无polyA。

polyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA，其polyA较长；而衰老的mRNA，其polyA较短。

polyA功能：

PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。

PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。

5’-帽子帽子

5’末端的鸟嘌呤N7被甲基化，鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5’-5’-磷酸二酯键。

P346帽子结构

帽子的功能：

可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。

可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。

原核mRNA（多顺反子）

原核mRNA由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。

没有5/帽子和3/polyA。

举列：

MS2病毒mRNA，3569b，有三个顺反子，分别编码A蛋白、外壳蛋白和复制酶三种蛋白质。

图MS2病mRNA

5’端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5’-AGGAGGU-3’，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列。

SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补，这种互补序列与mRNA对核糖体的识别有关。

原核mRNA代谢很快，半寿期几秒至十几分钟。

rRNA的结构

rRNA占总RNA的80%左右。

功能：

rRNA是构成核糖体的骨架，与核糖体结合蛋白一起构成核糖体，为蛋白质的合成提供场所。

大肠杆菌中有三类rRNA（原核）

5SrRNA

16SrRNA

23SrRNA

真核细胞有四类rRNA

5SrRNA

5.8SrRNA

18SrRNA

28SrRNA

图原核核糖体（rRNA 部分）

图真核核糖体（rRNA部分）

P346图5-14大肠杆菌5SrRNA结构

核酸的性质

解离性质

多聚核苷酸有两类可解离的基团：

磷酸和碱基能发生两性解离。

磷酸是中等强度的酸，碱基的碱性较弱，因此，核酸等电点在较低的pH范围内。

DNA等电点4—4.5

RNA等电点2—2.5

RNA链中，核糖C’2-OH的氢能与磷酸酯中的羟基氧形成氢链，促进磷酸酯羟基氢原子的解离。

水解性质

碱水解

室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。

图

在相同条件下，DNA不被水解。

这是因为RNA中C’2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解。

DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。

DNA稳定，遗传信息。

RNA是DNA的信使，完成任务后降解。

酶水解

生物体内存在多种核酸水解酶

RNA水解酶RNase

DNA水解酶DNase

核酸外一切酶

核酸内切酶最重要的：

限制性核酸内切酶

光吸收性

碱基具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，　　　　λmax=260nm

鉴定纯度

纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。

纯RNA的A260/A280应为2.0。

若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。

含量计算

1ABS值相当于：

50ug/mL双螺旋DNA

或：

40ug/mL单螺旋DNA（或RNA）

或：

20ug/mL核苷酸

增色效应与减色效应

P347图5-15DNA的紫外吸收光谱

增色效应：

在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大

减色效应：

在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。

沉降特性（DNA）

不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），起密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来，这一方法常用于质粒DNA的纯化。

P348图5—16Cs-Cl密度梯度离心纯化质粒DNA

相对沉降常数

线型双螺旋分子1.00

松驰双链闭环1.14

切刻双链环1.14

单链环1.14

线型单链1.30

正超或负超螺旋双链环状1.41

坍缩3.0

变性、复性及杂交

变性、复性是核酸的重要的物化性质，相对蛋白质来说，核酸可以耐受反反复复的变性、复性。

这也是核酸研究技术的基础。

变性

变性：

核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。

多核苷酸骨架上共价键的断裂称核酸的降解。

DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。

P350图5-18变性过程

热变性

因素酸碱变性（pH小于4或大于11，碱基间氢键全部断裂）

变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）

260nm吸收值升高。

变性后粘度降低，浮力密度升高。

二级结构改变，部分失活。

熔解温度（Tm）或称熔点：

DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。

DNA的Tm一般在70—85℃之间。

浓度50ug/mL时，双链DNAA260=1.00，完全变性（单链）A260=1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。

影响DNA的Tm值的因素

①DNA均一性均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围

内。

②G-C含量与Tm值成正比，G-C含量高，则Tm越高，测定Tm，可推知G-C含量。

。

G-C%=（Tm-69.3）×2.44

P351图5-19图5-20Tm值与GC含量的关系

③介质中离子强度

其它条件不变，离子强度高，Tm高。

P351图5-21

复性

变性DNA在适当（一般低于Tm20—25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。

变性DNA在缓慢冷却时（快速冷却可防止复性），可以复性。

DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。

复性速度可用Co·t衡量。

Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，t为时间，以秒表示。

P352图5-22，不同DNA的复性时间。

A．1个核苷酸对（A.U）

图上查出Cot1/2=4×10-6mol.s/L

若浓度为Co=1.0mmol/L

则复性50%所需时间t=0.004秒

若要全部复性，Cot=10-4t=0.1秒

B．E.coli4.2×106碱基对

图上查出Cot1/2=10mol.s/L

若浓度Co=1.0umol/L则复性50%所需时间t=107秒，约115天。

复性100%Cot=500mol.s/L

t=5×108秒，5758天。

对于E.coli，4.2×106bp，浓度达到umol/L级时，浓度已很高。

复性机制：

10-20bp成、拉链

杂交（DNA—DNA、DNA—RNA）

将不同来源的DNA混合加热，变性后，慢慢冷却使它复性。

若这些异源DNA之间，在某些区域有相同的序列，则复性时会形成杂交分子。

核酸研究技术

核酸的分离纯化

要求：

尽可能保持其天然状态。

条件温和，防止过酸、过碱。

避免剧烈搅拌，抑制核酸酶。

DNA分离纯化

真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或盐（1mol/L），但不溶于0.14mol/LNacl中，利用此性质，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。

DNA核蛋白可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。

还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。

RNA的制备（重点介绍mRNA的分离、纯化）

用0.14mol/LNacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。

去蛋白：

盐酸胍、苯酚等

必须防止RNA酶对RNA的破坏。

核酸的凝胶电泳

琼脂糖电泳

1核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比

2凝胶浓度

3DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。

4电流，不大于5V/cm

PAGE电泳

限制性核酸内切酶（1979年发现）

限制修饰系统

图

II型核酸内切酶

核酸内切酶有I、II、III三种类型，其中II型酶在DNA克隆中十分有用。

II型酶的特点：

限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分，辅助因子Mg2+，位点序列旋转对称（反向重复）。

II型酶的切割频率

识别位点444=256

646=4096

848=65536

NotIGCGGCCGC

限制酶的命名：

E.coRI

第一位：

属名E（大写）

第二、三位：

种名的头两个字母小写co

第四位：

菌株R

第五位：

罗马字，从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。

同裂酶：

来源不同的限制酶（名称自然不同），识别同样的核苷酸靶序列，产生同样的切割，形成同样的末端。

BamH：

GGATCC同裂酶BstI

识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。

同尾酶：

来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。

BamHI：

GGATCC

同裂酶：

BstIGGATCC

同尾酶：

BclITGATCABglIIAGATCT

MboIGATCSau3AGATC

星号活力：

在一定条件下（低离子强度，碱性pH，或50%甘油），限制酶的特异性降低。

结果，它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。

例如HindIIIAAGCTT

DNA物理图谱及构建

（限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱）

在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。

建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础，末端标记法构建DNA物