防晒剂检测方法.docx
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防晒剂检测方法
防晒剂含量检测方法
防晒剂即紫吸收剂。
它能吸收紫外线中可引起人产生急性皮炎（红斑）和皮肤灼伤的波长为280～320nn的中波紫外线（即U.V.B）和（或）可使皮肤变黑的波长32～400nn的长波紫紫外线（即U.V.A）。
化妆品中紫外线吸收剂用量过多对皮肤有不利影响，因此，化妆品卫生标准规定了防晒剂的使用量（见附录1中的表5）
－、对甲氧肉桂酸乙氧乙酯
高效液相色谱法（HPLC）
对甲氧肉桂酸乙氧乙酯：
（4-甲氧肉桂酸-2-乙氧乙酯，C14H18O4，分子量250.29）是淡黄色透明的粘稠性液体,266Pa时沸点为184～187℃；在水中溶解度为0.05%,在甘油中为0.5%,在丙二醇中约5%,能经任意比例与其它醇类、植物油相混合；吸收波长280～320nm，常作紫外吸收剂。
我国化妆品卫生标准规定最大允许浓度为10%。
1应用范围
本方法适用于化妆品中对甲氧肉桂酸乙氧乙酯的测定。
2原理
样品中的对甲氧肉桂酸乙氧乙酯溶解于四氢呋喃等有机溶剂，有机溶剂提取后用高效液相色谱定性、定量。
3试剂
3.1四氦呋喃：
色谱纯。
（1）
3.2乙腈。
3.3对甲氧肉桂酸乙氧乙酯标准溶液:
精确称取对甲氧肉桂酸乙氧酯0.5g,用少量四氢呋喃溶解,移入100.0ml容量瓶中并定容至刻度。
移取10.0ml置于50.0ml容量瓶中,用四氢呋喃定容至刻度。
此溶液1.00ml含1000?
g对甲氧肉桂酸乙氧乙酯。
4仪器
4.1高效液相色谱仪：
具紫外分光光度检测器
4.2超声波仪。
5分析步骤
5.1样品预处理
5.1.l液体、乳液、膏霜
（2）：
称取约0.1～2.0g（3）样品于50m1离心管中，加20m1四氢呋喃。
用超声波充分溶解混匀后加四氢呋喃至50.0ml。
溶液中有不溶物时离心分离。
取上清液用。
（4）
5.1.2指甲油：
称取约1.0g样品（3）于50ml离心管中，加15ml乙腈，搅拌均匀，加水至25.0ml，3000r/min离心10min，或用聚四氟乙烯滤膜过滤，取上清液备用。
（4）（5）
5.2色谱条件
色谱柱：
碳十八结合硅胶（4.0mmid×250mm）。
（6）
流动相：
乙腈+水（6＋4）。
（7）
流速：
1.0m1／min。
检测器波长：
310nm。
5.3测定
5.3.1定性
取标准溶液2.0ml，加四氢呋喃稀释至50.0m1，取5µl注入HPLC，求出保留时间，取样品溶液5?
l同样操作，以保留时间进行比较和定性。
（8）
5.3.2定量
移取标准溶液用四氢呋喃稀释，配制成1ml相当于0.0、20.0、40.0、60.0、80.0?
g的标准系列，依次取5µl注入HPLC，绘制浓度-峰高（或峰面积）标准曲线。
取样品溶液5?
l注入HPIC，记录峰高或峰面积，从标准曲线查出对应的对甲氧肉桂酸乙氧乙酯的含量A（µg/m1）。
6计算
c=A×V/m×1/1000
式中：
c一一对甲氧基肉桂酸乙酸乙酯含量，%；
A一－由标准曲线查出的样液中对甲氧基肉桂酸乙氧乙酯含量，µg／ml；
V－一样品溶液总体积，m1；
m――样品质量，g。
注解：
（1）四氢呋喃中常常加入抗氧化剂，必须采用色谱纯试剂。
（2）乳液、膏霜指防晒油、擦手香酯、夜霜等。
（3）称取的样品量根据对甲氧肉桂酸乙氧乙酯含量来决定，应含1～4mg。
（4）样液中若仍有不溶物，用聚四氟乙烯滤膜（5?
m）过滤。
（5）指甲油的预处理方法除用乙腈外，还可用下法：
即取苯或醚10ml，水20ml与样品充分混合，离心分离（3000r/min）10min，或静置分层后，取苯或醚层，将有机相挥干，用乙腈稀释至一定体积备用。
（6）常用的色谱柱还有TSK凝胶柱LS4l0及等效物。
（7）流动相乙腈和水的比例范围在7＋3～l＋1之间都可得到良好的分离。
（8）用本法测定时，对甲氧肉桂酸乙氧乙酯的保留时间是10min，能与其同分异构体完全分离。
以对甲氧肉桂酸乙氧乙酯的相对保留时间作为1.00时，2-乙基己基-对2-甲基胺基苯甲酸酯（ESOALOL507）是8.47，2-乙基己基对甲氧肉桂酸酯是8.94，同时和其它紫外吸收剂也能完全分离。
二、羟苯甲酮
高效液相色谱法（HPLC）
羟苯甲酮即2-羟-4甲氧二苯甲酮。
（oxybenzone，2-hydroxy-4-methoxybenzophenoneC14H12O3,228.25）是微黄色结晶粉末，熔点66℃（MerekIndex），60～66℃（化妆品原料标准Ⅱ）在100g不同溶媒中溶解的克数分别为：
水0.O，95％乙醇5.85，正己烷4.36，苯56.2，二甲苯44.3，二硫化碳30.0，四氯化碳34.5。
羟苯甲酮的最大吸收波长（0.001％乙醇溶液）为242±4nm，288±4nm，325±14nm,在化妆品中用作紫外线吸收剂。
我国化妆品卫生标准规定的最大允许浓度为10％。
1应用范围
本方法适用于不同类型化妆品中羟苯甲酮的测定。
2原理
用有机溶剂提取化妆品中的羟苯甲酮，用高效液相色谱进行测定，以保留时间定性，以标准峰高（或峰面积）进行定量。
3试剂
3.1四氢呋喃：
色谱纯。
（1）
3.2羟苯甲酮标准溶液：
精确称取羟苯甲酮0.25g，加少量四氢呋喃溶解，移置于100ml容量瓶中。
加四氢呋喃定容至刻度。
移取5.0ml置于50.0ml容量瓶中，用四氢呋喃定容至刻度。
此液1.0ml含250?
g羟苯甲酮。
4仪器
4.1高效液相色谱仪：
具紫外分光检测器。
4.2超声波仪。
5分析步骤
5.1样品预处理
5.1.1液体、乳状样品：
准确称取约0.1～2.5g
（2）样品于50m1离心管中，加四氢呋喃40.0ml，用超声波仪分散或溶解，加四氢呋喃至50ml，如样液混浊离心分离，取上清液备用。
5.1.2指甲油：
称取约1.0g（3）样品，置于离心管中，加四氢呋喃5.0ml经超声波仪超声提取后，加氯仿至20ml，3000r／min离心10min，取上清液备用。
5.2色谱条件
色谱柱：
不锈钢填充柱（4.6mmid×25Onm）填充C8（5?
m）。
（4）
流动相：
甲醇+四氢呋喃+水+60％过氯酸（50＋20＋30＋0.15）。
（5）
流速，1.0m1／min。
检测器：
紫外吸收检测器，波长288nm。
5.3测定
5.3.1定性
吸取6.0ml标准溶液置于50.0ml容量瓶中,加四氢呋喃定容至刻度，取5µl注入HPLC，求出保留时间。
取5µl样品待测溶液注入HPLC，求出保留时间，与标准保留时间,与标准保留时间比较进行定性。
（6,7）
5.3.2定量
配制每毫升含羟甲氧基苯酮0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0?
g的标准系列，分别取5µl注入HPLC。
绘制峰高（或峰面积）-浓度标准曲线，取样品待测溶液5µl注入HPLC，以标准曲线查出样品溶液中的羟苯甲酮含量（?
g/ml）。
6计算
c%=A×V/m×1/10000
式中：
c－一羟苯甲酮含量，%；
A――以标准曲线查出的样品溶液中羟苯甲酮含量，µg/m1；
V一－样品溶液稀释的总体积，m1；
m一一样品质量，g。
注解：
（1）一般在四氢呋喃中加入了微量的抗氧化剂，故要使用色谱纯的四氢呋喃。
（2）进行样品预处理时，称取的样品质量应含0.5～2.5mg羟苯甲酮。
（3）称取指甲油时，由于样品中的溶媒易挥发，称取操作应敏捷。
（4）可用LichrosorhRP-18色谱柱（E.Merck公司制品）或NueleosilC18色谱柱（MachereyNagel公司制品）。
（5）如用乙腈+水（7+3）作流动相，不能将ESCALOL506紫外吸收剂与羟甲氧基苯酮分离。
（6）本方法选择的仪器条件，羟苯甲酮与其它异构体分离良好，羟苯甲酮的相对保留时间为1.00时，其它异构体的相对保留时间如下：
2-羟基-4甲氧基二苯甲酚-5磺酸是0.48，2-羟基二苯甲酮是0.72，2，2′羟基二苯甲酮是0.75，2，2′，4，4′-四羟基二苯甲酮是0.56，2，2′羟基4，4′甲氧苯酮是0.89。
三、水杨酸高盖酯等14种防晒剂
反相高效液相色谱法
防晒化妆品的组分含有紫外线吸收剂。
常用的紫外线吸收剂为水杨酸、对氨基苯甲酸、肉桂酸、二苯甲酮等的衍生物。
此外，为了完全防止紫外线，防晒化妆品中还加有能使紫外线散乱起到遮蔽作用的无机覆盖剂，如氧化锌、氧化钛、滑石粉、高岭土等，我国化妆品卫生标准GB7916一87对紫外线吸收剂的使用量做了限制。
本法使用高效液相色谱，一次进样同时测定2，4-二羟基二苯甲酮等14种紫外吸收剂，分离效果好。
本法简单、快速、灵敏、实用。
1应用范围
本法适用于防晒化妆品中紫外线吸收剂的检测，可检测14种紫外线吸收剂，其最低检测量见表2-3-27。
表2-3-27紫外吸收剂及化妆品卫生标准（GB9716-87）中规定的化妆品中最大允许浓度
序号
代号
物质名称
英文名称
本法检出限（?
g/g）
最大允许浓度（%）
供应商
保留时间（min）
?
m
（nm）
5-11
SALA9
水杨酸高（）（此字由艹和孟组成）脂
Homomenthylsalicylate
25
10
QuestIn-ternational（NL）
43.22
250.61
5-20
SALA9
水杨酸-4-异丙基苄酯
4-Isopropylbenzylsalicylate
4
Vebvy（Ⅰ）
39.59
240.75
5-3
PABA8
对-二甲按基苯甲酸-2-乙酸已酯
2-ehylhexyl4-dime-thylaminobenzoate
2.5
8
VanDyk（NL）
42.35
304.20
BENZ1
2,4-二羟基二苯甲酮
2,4-Dithydroxyben-zophenone
5.0
-
Sigma（Ⅰ）
27.05
284.75
BENZ2
2,2′-二羟基-4-甲氧基二苯甲酮
2,2′-Dihydroxy-4-methoxyben-zophenone
7.5
-
Saipo（Ⅰ）
29.85
284.39
BENZ3
2,2′-二羟基-4,4′-二甲氧基二苯甲酮-5-磺酸（钠盐）
2,2′-Dehydroxy-4,4′-dimethoxyben-zophenone-5-sulfon-icacid（sodiumsalt）
10.0
-
Saipo（Ⅰ）
3.27
263.06
BENZ4
2,2′,4,4′-甲羟基二苯甲酮
2,2′,4,4′-Tetrahy-droxybenzophenone
5
-
Saipo（Ⅰ）
17.05
292.07
5-32
BENZ5
2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮
2-Hydroxy-4-methoxyeben-zophenon
5
10
Sigma（Ⅰ）
33.84
284.00
5-33
BENZ6
2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸（钠盐）
2-Hydroxy-4-methoxy-benzophe-none-5-sulfonicacid（sodiumsalt）
7.5
5（酸）
Sigma（Ⅰ）
9.91
266.82
5-17
CAMP4
3-（4-甲基亚苄基茨烷-2-酮）
3-（4-Methylbenzy-lidene）-bornan-2-one
2.5
6
Merck（D）
38.61
294.02
5-27
SSCR1
2-苯基苯咪唑-5-磺酸
2-Phenylbenz-imidazole-5-sulphnicacid
2.5
8（酸）
Saipo（Ⅰ）
6.89
278.29
5-14
CINA7
对-甲氧基肉桂酸二乙酸铵
Diethanolammonium4-methoxycinnamate
2.5
3（酸）
Saipo（Ⅰ）
18.49
292.24
5-18
CINA10
对-甲氧基肉桂酸异戊酯
Isoamyl4-methoxycinnamate
1.3
10
Haarman&Reimer（NL）
37.73
294.94
5-5
CINA11
对-甲氧基肉酸-2-乙酸已酯
2-Ethylhexyl4-methoxy-cinnamate
10
Givaudan（CH）
42.29
292.78
*此序号为化妆品卫生标准（GB7916-87）中表5的序号,5-11即表5中的序号11。
2原理
化妆品中各种紫外吸收化合物由于其结构上的差异可被反相高效液相色谱分离。
根据其保留时间及其紫外可见吸收光谱进行定性；峰面积进行定量。
3试剂
3.1甲醇:
色谱级。
3.1乙腈:
色谱级。
3.3紫外吸收剂贮备液:
取表2-3-27紫外线吸收化合物各0.1000g,用甲醇溶解并定容至100.0ml。
浓度为1.00mg/ml。
紫外吸收剂标准溶液：
取上述紫外吸收贮备液10.0ml,用甲醇定容至100ml,浓度为0.10mg/ml。
3.4高氯酸:
分析纯。
3.5高氯酸钠:
分析纯。
3.6硫酸:
分析纯。
3.7水、去离子水及二次重蒸水。
所有溶剂和溶液在进行HPLC分析前都经0.45?
m的微孔滤膜过滤及真空脱气。
4仪器
4.1高效液相色谱仪：
Varian5000型（Z?
g，Switzerland）。
4.2检测器：
Varianpolychrom9060型二极管珍列阵检测器。
4.3积分仪：
Varian4290型。
4.4微量进样器：
10?
l。
5分析步骤
（1）
5.1称取1g防晒化妆品于离心管中，加0.25ml2mol/L硫酸和10ml甲醇,30℃恒温超声水浴30min，然后以900r/min离心10min，提取上清液；残留物按上述方法重新萃取一次，合并二次萃取液，用甲醇定容至25ml。
5.2色谱条件
5.2.1色谱柱：
LichrosorbRP-18柱（250mm×4.6mmid.，10?
m，Merck，Darmstadt，F.R.G.）。
5.2.2流动相
流动相A：
10-3mol／L的高氯酸和5×10-2mol／L高氯酸钠的乙腈-水溶液（5+95，V／V）；
流动相B：
1×10-3mo1／L高氯酸和5×10-2mo1／L高氯酸钠的乙腈-水溶液[35＋65，V／V］。
流动相C：
1×10-3mo1／L的高氯酸和5×10-2mo1／L高氯酸钠的乙腈-水溶液（80＋20，V／V）。
起始为流动相A，在20min内线性梯度变换到流动相B：
保持流动相B5min，然后在40min内梯度变换到流动相C。
5.2.3流速：
2.5ml/min。
5.2.4柱温：
30℃。
5.2.5进样体积：
10?
l。
5.2.6检测波长：
3l1nm。
5.2.7检测器灵敏度：
0.32a.u.f.s.。
5.2.8纸速：
0.5cm／min。
5.3测定
5.3.1定性
取10?
l样品处理液（5.l），注入高效液相色谱仪。
根据其保留时间（参照表2-3-27）及紫外可见吸收光谱定性。
5.3.2定量
5.3.2.1标准曲线
移取0、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.0ml紫外吸收剂标准液于10ml具塞刻度管中，用甲醇稀释至刻度。
取10?
l进行高效液相色谱分析，记录各峰面积，用峰面积与对应的紫外吸收剂浓度作图获得标准曲线。
5.3.2.2取5.1制备的样品处理液，进行高效液相色谱分析，记录其各峰面积。
在标准曲线上查得相应的紫外吸收剂浓度。
6计算
按下式计算防晒吸收剂含量：
c=A×25/（m×10000）
式中：
c一一样品中紫外吸收剂的浓度，%；
A－一从标准曲线上查得的紫外吸收剂浓度，?
g/m1；
m－一样品质量，g。
7方法的准确度、精密度
样品加标加回收率为97～100％，平均变异系数不大于2％（n=5）。
注解：
（1）由于PABA8和CINAII在所用色谱条件下不能分离（如图2-3-36），在进行分析之前确定样品中是否同时存在这两种物质是必要的。
可用薄层层析对其进行快速扫描。
（2）若样品中PABA8及CINA11共存，为了分离这两种防晒剂，样品经10ml甲醇离心后，减压蒸馏此甲醇溶液，残渣用5ml2mo1／L硫酸萃取两次，合并上层酸萃取液。
此萃取液含有PABA8（溶液A）；萃取残渣用10ml甲醇溶解，该液（溶液B）含有CINA11。
溶液A、溶液B分别进行HPLC分析。
此时标准溶液也需配两组：
标准溶液A，含有BENZ4，BENZ8，SSCR1，PABA8，用2mo1／L的硫酸作溶剂；标准溶液B，含有其余的10种紫外吸收化合物，用甲醇作溶剂。
图2-3-37为标准溶液A和标准溶液B的色谱图。
（3）保留时间在实验条件下重现性良好，平均变异系数小于3％。
图2-3-37标准溶液A和标准溶液B的高效液相色谱图
图2-3-36IlENZ1等14种紫外吸收剂的高效液相色谱图
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