最新Menke体外产气法.docx
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最新Menke体外产气法
Menke体外产气法
Menke体外产气法(Syringe系统)——管子
(一)基础知识
体外产气法主要理念
通过体外产气装置模拟瘤胃发酵
体外产气系统组成
体外产气装置:
产气管(相当于独立的瘤胃)、恒温水浴摇床(模拟瘤胃温度和蠕动速度);微生物培养液:
由瘤胃液与人工唾液按1:
2的体积比混合,搅拌均匀而成
影响实验成败的主要因素
实验过程中产气装置的温度,整个操作过程的厌氧状态、微生物活力是影响实验成败的关键
(二)试验前准备
试配产气管①更换注入口处老化的塑胶管;②试配外管和内塞,要求推拉自如又不过松(现已将可匹配的外管和内塞统一编号,依号装配即可)。
称量样品①产气管编号;②用自制的带长柄的称量纸,准确称取待测样品约200mg(DM),置于体外产气管底部,注意不要让样品进入产气管注入口和沾染30ml以上管壁;③样品称取完毕后,管塞上均匀涂抹凡士林,将管塞塞回对映的外管,扣好夹子。
配制原液正式实验前一天,配制好人工唾液中的微量元素溶液(A液)、缓冲液(B液)、常量元素溶液(C液)和刃天青溶液(D液)(可过量配制,常温下存放,配制方法见附表1)。
其它①调试恒温水浴摇床的温度至39±0.5℃,摇动速度5×10转/min,如果使用两个恒温水浴摇床要求两者温度和摇动速度尽量一致,另外还需要将一多联水浴锅温度调至39±0.5℃(以实际量取温度为准);②准备二层、四层、六层纱布各2-4块(纱布可重复使用);③贮备两瓶热水,准备收集瓶(收集和过滤瘤胃液用)、水桶、温度计,以备次日取瘤胃液用。
(三)正式试验
配制人工唾液①将恒温水浴摇床、多联水浴锅打开后;②计算人工唾液需要量:
体外培养时每根产气管内微生物培养液的体积是30ml(10ml瘤胃液和20ml人工唾液),依据试验设计的产气管数计算人工唾液和瘤胃液的需要量(预留20%,以备操作手法不当造成浪费);③配制还原剂(E液,见附表1);④按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后,置入水浴摇床或水浴锅内,通入CO2气体(气流不易过大),使人工唾液由蓝色转变为粉红色,最终为无色。
采集与处理瘤胃液为方便读取12h产气量,瘤胃液最好在7:
30前取回。
所取瘤胃液为早饲前2h瘤胃液。
①到牧场后,将热水倒入水桶,调节水温度至39±0.5℃,用于瘤胃液保温(应经常用热水调节);②用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液,混合,倒入收集瓶(注意盖上瓶盖,以防氧气对微生物的影响);③回到实验室后,将收集瓶置于水浴锅内,四层纱布过滤(应尽量快,以保持微生物的活力),获得的滤液用CO2气体饱和;④用量筒量取所需量的无色人工唾液和瘤胃液混合,不间断地通入CO2气体。
吸取微生物培养液用空的产气管吸取微生物培养液30ml,通过三通管推入已经装有样品的产气管。
记录初始微生物培养液量排气过程:
将注入口处夹子打开的同时,用手下拉管塞,以防样品冲入塑胶管;摇晃产气管使样品与瘤胃液混合后,旋转管塞,排出管内空气;读数:
将产气管竖直,注入口向下,读取刻度。
排气后的产气管应随机置于恒温水浴摇床内培养(摇床在操作过程中处于摇动状态,以免温度上升)。
空白对照和标准对照
实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照(样多时,对照一定要多,尤其是空白对照)。
空白对照不加样品直接加入30ml微生物培养液,标准干草对照以200mg(DM)干草(优质的过80目筛的羊草)为底物,加入30ml微生物培养液。
为了消除操作顺序和恒温水浴摇床条件的差异,要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期,放置于水浴摇床的不同位置。
整个过程要尽量快,特别是吸培养液和排气,最好不要超过15min
记录产气量培养2、4、6、9、12、24、36、48、72、96h时(试验样品为粗料,一般培养到72h或96h;精料一般培养到24h或48h即可终止培养,若要计算产气常数,一般要72h),记录产气管的刻度读数(读数时轻摇产气管,旋动管塞后读数,读数时,以管塞刻度的中部为准)。
如果产气量过多,下一时间点产气量可能超出刻度范围,则需放气,其操作与排气相同。
产气量计算
(管子)
式中,GPt为样品在t时刻的产气量(ml);Vt为样品发酵t小时后,产气管刻度读数(ml);V0为样品在开始培养时产气管刻度读数(ml);W为样品干物质重(mg);GP空白为空白对照在t时刻的产气量,其计算方式与GPt一致。
重复试验要求体外产气试验至少培养两次,两次标准干草产气量相对偏差小于10%(若标准干草产气量与实验室积累的平均值29.5相差太大,应考虑重作,检查动物状况)。
(四)样品采集
测定项目
取样时间
取样部位
取样量
重复数
处理
保存温度
VFA
实际需要
上清液
1ml
-
加入0.2ml8.2%偏磷酸,20000g离心10min
4℃
NH3-N
24或48h
混合液
5ml
-
-20℃
MCP
24或48h
混合液
24ml
-
-20℃
附表1:
人工唾液原液配制表
A、微量元素溶液:
CaCl2.2H2O13.2g;
MnCl2.4H2O10.0g;
CoCl2.6H2O1.0g;
FeCl3.6H2O8.0g;
加蒸馏水至100ml
B、缓冲液:
NH4HCO34.0g;
NaHCO335.0g;
加蒸馏水至1000ml
C、常量元素溶液:
Na2HPO4.12H2O9.45g
KH2PO46.2g
MgSO4.7H2O0.6g
加蒸馏水至1000ml
D、0.1%刃天青溶液:
100mg刃天青溶解于
100ml蒸馏水
E、还原剂溶液(现用现配):
1MNaOH4.0mlNa2S9.H2O625mg加蒸馏水95ml
附表2:
人工唾液配制表(1000ml)
顺序
原液
体积(ml)
1
蒸馏水
520.2
2
微量元素溶液(A液)
0.1
3
缓冲液(B液)
208.1
4
常量元素溶液(C液)
208.1
5
0.1%刃天青溶液(D液)
1.0
6
还原剂溶液(E液)
62.4
嘌呤法测定体外微生物蛋白产量
(一)操作流程图
(二)试剂配制及具体操作
1、试验试剂
A
0.2M磷酸二氢铵
23g磷酸二氢铵溶解于700ml蒸馏水,定容至1000ml
B
pH=2的蒸馏水
在蒸馏水中加少许硫酸至pH=2
C
0.4M硝酸银
准确称取1.6987g硝酸银,溶解于15ml蒸馏水中,待完全溶解后定容至25ml。
溶液需用棕色瓶存放,避光保存,并外覆不透光的黑纸
D
0.5M盐酸
用蒸馏水稀释10ml盐酸(37%)至240ml
E
28.5mM磷酸二氢铵
用蒸馏水稀释100ml0.2M磷酸二氢铵至700ml
F
85%磷酸
G
0.6M高氯酸
用蒸馏水稀释10ml高氯酸(70%,12M)至200ml
2、测定步骤
A.酵母RNA标准曲线的制作:
①分别称取5、15、25、35、45、55mg酵母RNA于10ml离心管中,并加入2ml0.6MHClO4,于90-95℃水浴1小时,冷却;
②再分别加入6ml28.5mMNH4H2PO4,于90-95℃水浴15min,冷却后在3000g,4℃条件下离心10min;
③取1.6ml上清液,向上清夜中加入6ml0.2MNH4H2PO4溶液,并用85%磷酸调整溶液pH为2–3(一般需85%磷酸25µl);
④取调整pH值后的溶液3.8ml,并向其中加入0.2ml0.4MAgNO3,混合,于5℃条件下避光、过夜;
⑤过夜后于3000g,4℃条件下离心10min,弃上清液;用4.5mlpH=2的蒸馏水冲洗沉淀;再于3000g,4℃条件下离心10min,弃上清液;
⑥向沉淀中加入5ml0.5MHCl溶液,混匀,在90-95℃条件下水浴30min后,以3000g离心10min;
⑦上清液用0.5MHCl稀释40倍后,以0.5MHCl溶液作参比,在260nm下比色,根据光密度值作出标准曲线。
B.培养液中微生物蛋白质的测定:
①取8ml均匀发酵液于3个10ml离心管,在20000g,4℃条件下离心20min;弃上清液后加入2.104ml0.6MHClO4,于90–95℃水浴1小时,冷却;
②按照制作标准曲线的步骤②-⑥操作;
③以0.5MHCl溶液作参比,在260nm下比色,根据光密度值和标准曲线求出RNA测定值;
④根据下面公式计算微生物蛋白氮产量:
其中,RNA含氮量为17.83%,细菌氮中RNA含氮量为10%。
浙江大学奶业科学研究所
比色法测定培养液氨态氮浓度
(一)操作流程图
(二)试剂配制及具体操作
1试验试剂
A
0.2M盐酸溶液
将18ml浓盐酸用蒸馏水稀释到1000ml
B
14%水杨酸钠溶液
称取14g水杨酸钠,用蒸馏水溶解,定容至100ml
C
0.3M氢氧化钠溶液
1.2g氢氧化钠用蒸馏水溶解并定容至100ml
D
D液
称取0.08g亚硝基铁氰化钠溶解于100ml14%水杨酸钠溶液中
E
E液
量取2ml次氯酸钠溶液(商品名安替福明,含活性氯5.2%),混于100ml0.3M氢氧化钠溶液中摇匀
2测定步骤
A、氨氮标准系列溶液制备
①准确称量0.382g氯化铵,用0.2M盐酸溶解,并定容到100ml,作为保存液,在冰箱中可存放数月。
②取保存液10ml,用蒸馏水稀释定容至100ml,为工作液。
含氮量为10mg/100ml。
③取工作液0、1、2、4、6ml置于5个编号的50ml容量瓶内,接着分别加入蒸馏水10、9、8、6、/4ml,使之都成为10ml,再用0.2M盐酸定容。
这就是每100ml中含氮量为0、0.2、0.4、0.8、1.2mg的标准系列溶液。
B、比色与计算
①准确量取标准系列溶液0.4ml分置于5个10ml试管内,各管中再依次加入D液和E液2ml,摇匀,静置10分钟后比色。
波长700nm,0.5cm的比色皿,用不含氮的0号管液作空白对照。
记录各消光值。
②用消光值作自变量,溶液含氮量作从变量导出回归方程式。
③样品处理:
取5ml瘤胃培养液在3500-4000转/分下,离心10分钟,量取2ml上清液(若含氮量较高,可取1ml上清液再加1ml蒸馏水),置于15ml试管内,再加入8ml0.2M盐酸至10ml摇匀(稀释倍数为5或10)。
比色操作同:
准确量取各溶液0.4ml置于10ml试管内,各管内再依次加入D液和E液2ml,摇匀,静置10分钟后比色。
波长700nm,0.5cm的比色皿,用不含氮的0号管液作空白对照。
记录各消光值。
把测得的消光值代入回归公式,计算的结果乘以样品稀释的倍数就是原样中氨氮的含量。
浙江大学奶业科学研究所
体外发酵产物中挥发性脂肪酸浓度的测定
(一)操作流程图
(二)试剂配制及具体操作
1混标制备
按表1或表2中梯度,配制6个梯度的混合标样,用于制作标准曲线。
表1乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制(umol/ml)
1
2
3
4
5
6
乙酸
10
20
40
80
160
320
丙酸
1
2
4
8
16
32
丁酸
1
2
4
8
16
32
表2乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制(ul/ml)
1
2
3
4
5
6
乙酸
0.571
1.143
2.285
4.570
9.140
18.280
丙酸
0.075
0.149
0.299
0.598
1.196
2.390
丁酸
0.092
0.184
0.367
0.735
1.470
2.939
2上机测定
色谱柱
HP-INNOWAX(19091N-133)毛细管柱,30m×0.25mm×0.25µm
气化室温度
200℃
检测室温度
220℃
柱温
采用程序升温,80℃持续1min后,以15℃/min升温至170℃后维持1.5min
载气及流速
载气为高纯氮,压力为100kpa,总流量63.8ml/min,柱流量1.19ml/min,分流比50,吹扫流量3ml/min,循环流量30ml/min
检测室气体流速
H2流量40ml/min,空气流量400ml/min
进样量
2µl
浙江大学奶业科学研究所
发酵气体中甲烷含量的测定
(一)标准曲线建立
用10µl的微量注射器分别抽取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0µl的甲烷标准气,上机,根据甲烷的浓度和其峰面积的关系,确定甲烷的标准曲线。
由于在测定发酵气体时取样量是20µl,故设定1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0µl的甲烷标准气的浓度分别为5、10、15、20、25、30%。
(二)上机条件
色谱柱
HP-INNOWAX(19091N-133)毛细管柱,30m×0.25mm×0.25µm
气化室温度
100℃
检测室温度
120℃
柱温
80℃
载气及流速
载气为高纯氮,压力为179.5kpa,总流量46.2ml/min,柱流量2.7ml/min,分流比15,吹扫流量3ml/min,循环流量30ml/min
检测室气体流速
H2流量40ml/min,空气流量400ml/min
进样量
20µl
浙江大学奶业科学研究所
压力读取式体外产气法(RPT系统)——产气瓶
(一)基础知识
体外产气法主要理念
通过体外产气装置模拟瘤胃发酵
体外产气系统组成
体外产气装置:
产气瓶(相当于独立的瘤胃)、恒温培养箱(模拟瘤胃温度);微生物培养液:
1:
9的瘤胃液与人工唾液;压力传感器;PC
影响实验成败的主要因素
实验过程中产气装置的温度,整个操作过程的厌氧状态、微生物活力是影响实验成败的关键
(二)操作流程图
(三)试剂配制及具体操作
1、试验前准备
称量样品①产气瓶编号(因为产气量的计算涉及瓶子体积,所以尽量保留原产气瓶编号,使用新瓶时要量取瓶子体积);②加入磁力棒;③准确称取待测样品一般约750mg(DM,适用0.5-1.5mgDM),置于体外产气瓶底部。
配制人工唾液①计算人工唾液需要量:
体外培养时每个产气瓶内人工唾液的量为90ml,瘤胃液10ml,依据试验设计的产气瓶数计算人工唾液和瘤胃液的需要量(预留20%,以备操作手法不当造成浪费);②配制人工唾液中的微量元素溶液(A液)、缓冲液(B液)、常量元素溶液(C液)、刃天青溶液(D液)(可过量配制,常温下存放)和还原剂(E液,现用现配,见附表1)。
③按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后,置入水浴摇床或水浴锅内,通入CO2气体(气流不易过大),使人工唾液由蓝色转变为粉红色,最终为无色。
分装人工唾液不间断地将CO2通入人工唾液瓶,用100ml注射器或产气管吸取人工唾液90ml,注入称有样品的产气瓶,并用CO2饱和(可通过三通管完成两路CO2的同时输入)。
盖紧橡胶塞后,39±0.5℃恒温培养箱内过夜(对于青贮类等含酸较多的样品,一定要过夜,而且在正式培养前将里面所产气体排空,不计入产气量)。
其它①准备二层、四层、六层纱布各2-4块(纱布可重复使用);②贮备两瓶热水,准备收集瓶(收集和过滤瘤胃液用)、水桶、温度计,以备次日取瘤胃液用。
2、正式试验
采集与处理瘤胃液为方便读取12h产气量,瘤胃液最好在7:
30前取回。
所取瘤胃液为早饲前2h瘤胃液。
①到牧场后,将热水倒入水桶,调节水温度至39±0.5℃,用于瘤胃液保温(应时经常热水调节);②用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液,混合,倒入收集瓶,盖好盖子;③回到实验室后,将收集瓶置于水浴锅内,依次用二层、四层和六层纱布过滤(应尽量快,以保持微生物的活力),获得的滤液不间断地通入CO2气体;④将密封的产气瓶从恒温箱中取出,用6.5号针头将产气瓶中多余气体放尽;⑤用20ml注射器吸取瘤胃液10ml,通过另一16号针头注入产气瓶,将两根针头取下,产气瓶置于39±0.5℃恒温箱中培养。
空白对照和标准对照
实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照。
空白对照不加样品只有90ml人工唾液和10ml瘤胃液,标准对照以750mg(DM)干草(优质的过80目筛的羊草)为底物,加入90ml人工唾液和10ml瘤胃液。
为了消除操作顺序和恒温培养箱条件的差异,要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期,放置于培养箱的不同位置。
记录产气量培养2、4、6、9、12、24、36、48h时,如果条件允许可延长培养时间,培养粗料时,至少96h或更长(有人培养一周),用压力传感器读取产气瓶内压力(轻拿、轻放),并放气。
要求:
使用压力传感器前,熟练软件的操作(有模拟程序可供练习)
产气量计算
(瓶子)
式中,GPt为样品在t时间段的产气量(ml);Pt为t时间段读取的压力(mPa);V0为瓶子体积;101.3为标准大气压(mPa);W为样品干物质重。
产气过程的总积累产气量为各时间段产气量之和。
瘤胃发酵样品制备①培养中途取样时,要求取样同时,向产气瓶内通入CO2,并于39℃水浴中操作;②取混合液(发酵液及固体残渣)时要求在控温磁力搅拌机上操作。
重复试验要求体外产气试验至少培养两次,两次标准干草产气量相对偏差小于10%。
附表1:
人工唾液原液配制表
A、微量元素溶液:
CaCl2.2H2O13.2g;
MnCl2.4H2O10.0g;
CoCl2.6H2O1.0g;
FeCl3.6H2O8.0g;
加蒸馏水至100ml
B、缓冲液:
NH4HCO34.0g;
NaHCO335.0g;
加蒸馏水至1000ml
C、常量元素溶液:
Na2HPO4.12H2O9.45g
KH2PO46.2g
MgSO4.7H2O0.6g
加蒸馏水至1000ml
D、0.1%刃天青溶液:
100mg刃天青溶解于
100ml蒸馏水
E、还原剂溶液(现用现配):
CysteineHCl625mg蒸馏水95ml1MNaOH4.0mlNa2S9.H2O625mg
附表2:
人工唾液配制表(1000ml)
顺序
原液
体积(ml)
1
蒸馏水
520.2
2
缓冲液(B液)
208.1
3
常量元素溶液(C液)
208.1
4
微量元素溶液(A液)
0.1
5
0.1%刃天青溶液(D液)
1.0
6
还原剂溶液(E液)
62.4
瘤胃液脂肪酸测定
(一)操作流程图
(二)试剂配制及具体操作
1、样品处理
①.取1ml样品于带盖的水解管,加入0.67ml5MNaOH和一滴饱和甲基橙指示剂后,充满N2;
②.85℃水浴30min,冷却至室温后,加入0.67ml5.1MHCl,使溶液pH低于2(溶液由橙色变为红色),如果不确定,可以用pH计检测;
③.加入1ml2mg/ml的内标C17:
0;
④.加入2.5ml氯仿/甲醇(2:
1,v/v)后,涡旋2min;
⑤.将样品在2000g下离心10min;
⑥.移去上层甲醇/水层,轻轻拨开中间杂质层,将下层溶液无损失转移;
⑦.通过含硫酸钠的干燥柱将下层氯仿滤入另一玻璃容量管;
⑧.用氮气将样品吹干;
⑨.用1.0ml正己烷悬浮后,简单涡旋;
⑩.2000rpm下离心10min,样品-20℃冷冻保存。
2、上机条件
色谱柱
HP-INNOWAX(19091N-133)毛细管柱,30m×0.25mm×0.25µm
气化室温度
260℃
检测室温度
270℃
柱温
采用程序升温,140℃持续5min后,以4℃/min升温至240℃后维持20min
载气及流速
载气为高纯氮,压力为100kpa,总流量87.9ml/min,柱流量0.84ml/min,线速度:
25.6cm/sec,分流比100,吹扫流量3ml/min,循环流量30ml/min
检测室气体流速
H2流量40ml/min,空气流量400ml/min
进样量
产气管,2µl;产气瓶4µl
浙江大学奶业科学研究所
Real-timePCR测定瘤胃微生物数量
一、样品采集
Invitro实验终止时,若分析混合微生物,可取1ml混合培养液于1.5ml灭菌离心管(也可直接用灭菌过的含0.3g0.1mm和0.1g0.5mm锆珠的2ml螺口管)-80度保存待用。
若要分别分析固、液相微生物时,将混合培养液过40um尼龙袋,滤液于4度500⨯g离心10,上清用于液体微生物DNA提取。
尼龙袋于39度灭菌水中冲洗至澄清用吸水纸吸干水份,-80度保存用于固相微生物DNA的提取。
InSacco方法与此相似。
二、总DNA的提取
1试验材料:
1.5mLEP管、螺口管、锆珠、1mL、200uL、20ul枪头(均需灭菌)、涡旋器、高速离心机等。
2所需试剂:
NaOH、Tris碱、EDTA二钠、NaCl、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、冷乙醇。
3.溶液配制方法:
试剂
方法
A
10MNaOH
称取40gNaOH,加到100mL水中。
无需除菌。
B
5MNaCl
称取29.22gNaCl,加水溶解定容至100mL。
C
1M,pH8.0Tris-HCl
称取12.114gTris碱,加80mL水,用浓盐酸调pH至8.0,加水定容至100mL。
D
0.5M,pH8.0EDTA
将18.61gEDTA-Na.加入80mL水中,在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
用10N的NaOH调节溶液的pH值至8.0,加水定容至100mL。
E
TE缓冲液(10mMTris-HCl,1mMEDTA,
pH8.0)
吸取1mL1M的Tris-HCl和0.2mL0.5M的EDTA,加水定容至100mL。
F
TN150(10mMTris-HCl;
150mMNaCl,pH8.0)
1ml1M的Tris-HCl和3ml5MNaCl,加水定容至100ml。
G
Tris饱和酚(pH8.0)
购买
H
24:
1的氯仿∕异戊醇
240mL氯仿+10mL异戊醇
I
无水乙醇
-20度保存。
J
70%乙醇
70mL无水乙醇加30mL水-20度保存。
4提取步骤:
⑴液相微生物:
冰上解冻样品后于4度20000g离心5min,弃上清液。
加入1mLTN150悬浮沉淀,再加150µL的Tris饱和酚,Bead-beater匀浆(4600g,2min),冰上两分钟冷却,重复三次。
固相微生物:
称取0.35g固体培养物于2ml螺口管,再称0.3g0.1mm和0.1g0.5mm灭菌过的锆珠。
加入1mLTN150,150µL的Tris饱和酚,Bead-beater匀浆(4600g,2min),冰上冷却两分钟,重复三次。
以下步骤相同
(2)加入150µL氯仿∕异戊醇,涡旋混匀。
20000g离心5min,上清液转至已1.5mLEP管中。
(3)加入150