最新Menke体外产气法.docx
《最新Menke体外产气法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《最新Menke体外产气法.docx（29页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
最新Menke体外产气法
Menke体外产气法
Menke体外产气法（Syringe系统）——管子
（一）基础知识
体外产气法主要理念
通过体外产气装置模拟瘤胃发酵
体外产气系统组成
体外产气装置：
产气管（相当于独立的瘤胃）、恒温水浴摇床（模拟瘤胃温度和蠕动速度）；微生物培养液：
由瘤胃液与人工唾液按1:
2的体积比混合，搅拌均匀而成
影响实验成败的主要因素
实验过程中产气装置的温度，整个操作过程的厌氧状态、微生物活力是影响实验成败的关键
（二）试验前准备
试配产气管①更换注入口处老化的塑胶管；②试配外管和内塞，要求推拉自如又不过松（现已将可匹配的外管和内塞统一编号，依号装配即可）。
称量样品①产气管编号；②用自制的带长柄的称量纸，准确称取待测样品约200mg（DM），置于体外产气管底部，注意不要让样品进入产气管注入口和沾染30ml以上管壁；③样品称取完毕后，管塞上均匀涂抹凡士林，将管塞塞回对映的外管，扣好夹子。
配制原液正式实验前一天，配制好人工唾液中的微量元素溶液（A液）、缓冲液（B液）、常量元素溶液（C液）和刃天青溶液（D液）（可过量配制，常温下存放，配制方法见附表1）。
其它①调试恒温水浴摇床的温度至39±0.5℃，摇动速度5×10转/min，如果使用两个恒温水浴摇床要求两者温度和摇动速度尽量一致，另外还需要将一多联水浴锅温度调至39±0.5℃（以实际量取温度为准）；②准备二层、四层、六层纱布各2-4块（纱布可重复使用）；③贮备两瓶热水，准备收集瓶（收集和过滤瘤胃液用）、水桶、温度计，以备次日取瘤胃液用。
（三）正式试验
配制人工唾液①将恒温水浴摇床、多联水浴锅打开后；②计算人工唾液需要量：
体外培养时每根产气管内微生物培养液的体积是30ml（10ml瘤胃液和20ml人工唾液），依据试验设计的产气管数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；③配制还原剂（E液，见附表1）；④按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后，置入水浴摇床或水浴锅内，通入CO2气体（气流不易过大），使人工唾液由蓝色转变为粉红色，最终为无色。
采集与处理瘤胃液为方便读取12h产气量，瘤胃液最好在7:
30前取回。
所取瘤胃液为早饲前2h瘤胃液。
①到牧场后，将热水倒入水桶，调节水温度至39±0.5℃，用于瘤胃液保温（应经常用热水调节）；②用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶（注意盖上瓶盖，以防氧气对微生物的影响）；③回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，四层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液用CO2气体饱和；④用量筒量取所需量的无色人工唾液和瘤胃液混合，不间断地通入CO2气体。
吸取微生物培养液用空的产气管吸取微生物培养液30ml，通过三通管推入已经装有样品的产气管。
记录初始微生物培养液量排气过程：
将注入口处夹子打开的同时，用手下拉管塞，以防样品冲入塑胶管；摇晃产气管使样品与瘤胃液混合后，旋转管塞，排出管内空气；读数：
将产气管竖直，注入口向下，读取刻度。
排气后的产气管应随机置于恒温水浴摇床内培养（摇床在操作过程中处于摇动状态，以免温度上升）。
空白对照和标准对照
实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照（样多时，对照一定要多，尤其是空白对照）。
空白对照不加样品直接加入30ml微生物培养液，标准干草对照以200mg（DM）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入30ml微生物培养液。
为了消除操作顺序和恒温水浴摇床条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于水浴摇床的不同位置。
整个过程要尽量快，特别是吸培养液和排气，最好不要超过15min
记录产气量培养2、4、6、9、12、24、36、48、72、96h时（试验样品为粗料，一般培养到72h或96h；精料一般培养到24h或48h即可终止培养，若要计算产气常数，一般要72h），记录产气管的刻度读数（读数时轻摇产气管，旋动管塞后读数，读数时，以管塞刻度的中部为准）。
如果产气量过多，下一时间点产气量可能超出刻度范围，则需放气，其操作与排气相同。
产气量计算
（管子）
式中，GPt为样品在t时刻的产气量（ml）；Vt为样品发酵t小时后，产气管刻度读数（ml）；V0为样品在开始培养时产气管刻度读数（ml）；W为样品干物质重（mg）；GP空白为空白对照在t时刻的产气量，其计算方式与GPt一致。
重复试验要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%（若标准干草产气量与实验室积累的平均值29.5相差太大，应考虑重作，检查动物状况）。
（四）样品采集
测定项目
取样时间
取样部位
取样量
重复数
处理
保存温度
VFA
实际需要
上清液
1ml
-
加入0.2ml8.2%偏磷酸，20000g离心10min
4℃
NH3-N
24或48h
混合液
5ml
-
-20℃
MCP
24或48h
混合液
24ml
-
-20℃
附表1：
人工唾液原液配制表
A、微量元素溶液：
CaCl2.2H2O13.2g;
MnCl2.4H2O10.0g;
CoCl2.6H2O1.0g;
FeCl3.6H2O8.0g;
加蒸馏水至100ml
B、缓冲液：
NH4HCO34.0g;
NaHCO335.0g;
加蒸馏水至1000ml
C、常量元素溶液：
Na2HPO4.12H2O9.45g
KH2PO46.2g
MgSO4.7H2O0.6g
加蒸馏水至1000ml
D、0.1%刃天青溶液：
100mg刃天青溶解于
100ml蒸馏水
E、还原剂溶液（现用现配）：
1MNaOH4.0mlNa2S9.H2O625mg加蒸馏水95ml
附表2：
人工唾液配制表（1000ml）
顺序
原液
体积（ml）
1
蒸馏水
520.2
2
微量元素溶液（A液）
0.1
3
缓冲液（B液）
208.1
4
常量元素溶液（C液）
208.1
5
0.1%刃天青溶液（D液）
1.0
6
还原剂溶液（E液）
62.4
嘌呤法测定体外微生物蛋白产量
（一）操作流程图
（二）试剂配制及具体操作
1、试验试剂
A
0.2M磷酸二氢铵
23g磷酸二氢铵溶解于700ml蒸馏水，定容至1000ml
B
pH=2的蒸馏水
在蒸馏水中加少许硫酸至pH=2
C
0.4M硝酸银
准确称取1.6987g硝酸银，溶解于15ml蒸馏水中，待完全溶解后定容至25ml。
溶液需用棕色瓶存放，避光保存，并外覆不透光的黑纸
D
0.5M盐酸
用蒸馏水稀释10ml盐酸（37%）至240ml
E
28.5mM磷酸二氢铵
用蒸馏水稀释100ml0.2M磷酸二氢铵至700ml
F
85%磷酸
G
0.6M高氯酸
用蒸馏水稀释10ml高氯酸（70%，12M）至200ml
2、测定步骤
A．酵母RNA标准曲线的制作:
①分别称取5、15、25、35、45、55mg酵母RNA于10ml离心管中，并加入2ml0.6MHClO4，于90-95℃水浴1小时，冷却；
②再分别加入6ml28.5mMNH4H2PO4，于90-95℃水浴15min，冷却后在3000g，4℃条件下离心10min；
③取1.6ml上清液，向上清夜中加入6ml0.2MNH4H2PO4溶液，并用85%磷酸调整溶液pH为2–3（一般需85%磷酸25µl）；
④取调整pH值后的溶液3.8ml，并向其中加入0.2ml0.4MAgNO3，混合，于5℃条件下避光、过夜；
⑤过夜后于3000g，4℃条件下离心10min，弃上清液；用4.5mlpH=2的蒸馏水冲洗沉淀；再于3000g，4℃条件下离心10min，弃上清液；
⑥向沉淀中加入5ml0.5MHCl溶液，混匀，在90-95℃条件下水浴30min后，以3000g离心10min；
⑦上清液用0.5MHCl稀释40倍后，以0.5MHCl溶液作参比，在260nm下比色，根据光密度值作出标准曲线。
B．培养液中微生物蛋白质的测定:
①取8ml均匀发酵液于3个10ml离心管，在20000g，4℃条件下离心20min；弃上清液后加入2.104ml0.6MHClO4，于90–95℃水浴1小时，冷却；
②按照制作标准曲线的步骤②-⑥操作；
③以0.5MHCl溶液作参比，在260nm下比色，根据光密度值和标准曲线求出RNA测定值；
④根据下面公式计算微生物蛋白氮产量：
其中，RNA含氮量为17.83%，细菌氮中RNA含氮量为10%。
浙江大学奶业科学研究所
比色法测定培养液氨态氮浓度
（一）操作流程图
（二）试剂配制及具体操作
1试验试剂
A
0.2M盐酸溶液
将18ml浓盐酸用蒸馏水稀释到1000ml
B
14%水杨酸钠溶液
称取14g水杨酸钠，用蒸馏水溶解，定容至100ml
C
0.3M氢氧化钠溶液
1.2g氢氧化钠用蒸馏水溶解并定容至100ml
D
D液
称取0.08g亚硝基铁氰化钠溶解于100ml14%水杨酸钠溶液中
E
E液
量取2ml次氯酸钠溶液（商品名安替福明，含活性氯5.2%），混于100ml0.3M氢氧化钠溶液中摇匀
2测定步骤
A、氨氮标准系列溶液制备
①准确称量0.382g氯化铵，用0.2M盐酸溶解，并定容到100ml，作为保存液，在冰箱中可存放数月。
②取保存液10ml，用蒸馏水稀释定容至100ml，为工作液。
含氮量为10mg/100ml。
③取工作液0、1、2、4、6ml置于5个编号的50ml容量瓶内，接着分别加入蒸馏水10、9、8、6、/4ml，使之都成为10ml，再用0.2M盐酸定容。
这就是每100ml中含氮量为0、0.2、0.4、0.8、1.2mg的标准系列溶液。
B、比色与计算
①准确量取标准系列溶液0.4ml分置于5个10ml试管内，各管中再依次加入D液和E液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。
波长700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0号管液作空白对照。
记录各消光值。
②用消光值作自变量，溶液含氮量作从变量导出回归方程式。
③样品处理：
取5ml瘤胃培养液在3500-4000转/分下，离心10分钟，量取2ml上清液（若含氮量较高，可取1ml上清液再加1ml蒸馏水），置于15ml试管内，再加入8ml0.2M盐酸至10ml摇匀（稀释倍数为5或10）。
比色操作同：
准确量取各溶液0.4ml置于10ml试管内，各管内再依次加入D液和E液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。
波长700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0号管液作空白对照。
记录各消光值。
把测得的消光值代入回归公式，计算的结果乘以样品稀释的倍数就是原样中氨氮的含量。
浙江大学奶业科学研究所
体外发酵产物中挥发性脂肪酸浓度的测定
（一）操作流程图
（二）试剂配制及具体操作
1混标制备
按表1或表2中梯度，配制6个梯度的混合标样，用于制作标准曲线。
表1乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制（umol/ml）
1
2
3
4
5
6
乙酸
10
20
40
80
160
320
丙酸
1
2
4
8
16
32
丁酸
1
2
4
8
16
32
表2乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制（ul/ml）
1
2
3
4
5
6
乙酸
0.571
1.143
2.285
4.570
9.140
18.280
丙酸
0.075
0.149
0.299
0.598
1.196
2.390
丁酸
0.092
0.184
0.367
0.735
1.470
2.939
2上机测定
色谱柱
HP-INNOWAX（19091N-133）毛细管柱，30m×0.25mm×0.25µm
气化室温度
200℃
检测室温度
220℃
柱温
采用程序升温，80℃持续1min后，以15℃/min升温至170℃后维持1.5min
载气及流速
载气为高纯氮，压力为100kpa，总流量63.8ml/min，柱流量1.19ml/min，分流比50，吹扫流量3ml/min，循环流量30ml/min
检测室气体流速
H2流量40ml/min，空气流量400ml/min
进样量
2µl
浙江大学奶业科学研究所
发酵气体中甲烷含量的测定
（一）标准曲线建立
用10µl的微量注射器分别抽取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0µl的甲烷标准气，上机，根据甲烷的浓度和其峰面积的关系，确定甲烷的标准曲线。
由于在测定发酵气体时取样量是20µl，故设定1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0µl的甲烷标准气的浓度分别为5、10、15、20、25、30%。
（二）上机条件
色谱柱
HP-INNOWAX（19091N-133）毛细管柱，30m×0.25mm×0.25µm
气化室温度
100℃
检测室温度
120℃
柱温
80℃
载气及流速
载气为高纯氮，压力为179.5kpa，总流量46.2ml/min，柱流量2.7ml/min，分流比15，吹扫流量3ml/min，循环流量30ml/min
检测室气体流速
H2流量40ml/min，空气流量400ml/min
进样量
20µl
浙江大学奶业科学研究所
压力读取式体外产气法（RPT系统）——产气瓶
（一）基础知识
体外产气法主要理念
通过体外产气装置模拟瘤胃发酵
体外产气系统组成
体外产气装置：
产气瓶（相当于独立的瘤胃）、恒温培养箱（模拟瘤胃温度）；微生物培养液：
1:
9的瘤胃液与人工唾液；压力传感器；PC
影响实验成败的主要因素
实验过程中产气装置的温度，整个操作过程的厌氧状态、微生物活力是影响实验成败的关键
（二）操作流程图
（三）试剂配制及具体操作
1、试验前准备
称量样品①产气瓶编号（因为产气量的计算涉及瓶子体积，所以尽量保留原产气瓶编号，使用新瓶时要量取瓶子体积）；②加入磁力棒；③准确称取待测样品一般约750mg（DM，适用0.5-1.5mgDM），置于体外产气瓶底部。
配制人工唾液①计算人工唾液需要量：
体外培养时每个产气瓶内人工唾液的量为90ml，瘤胃液10ml，依据试验设计的产气瓶数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；②配制人工唾液中的微量元素溶液（A液）、缓冲液（B液）、常量元素溶液（C液）、刃天青溶液（D液）（可过量配制，常温下存放）和还原剂（E液，现用现配，见附表1）。
③按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后，置入水浴摇床或水浴锅内，通入CO2气体（气流不易过大），使人工唾液由蓝色转变为粉红色，最终为无色。
分装人工唾液不间断地将CO2通入人工唾液瓶，用100ml注射器或产气管吸取人工唾液90ml，注入称有样品的产气瓶，并用CO2饱和（可通过三通管完成两路CO2的同时输入）。
盖紧橡胶塞后，39±0.5℃恒温培养箱内过夜（对于青贮类等含酸较多的样品，一定要过夜，而且在正式培养前将里面所产气体排空，不计入产气量）。
其它①准备二层、四层、六层纱布各2-4块（纱布可重复使用）；②贮备两瓶热水，准备收集瓶（收集和过滤瘤胃液用）、水桶、温度计，以备次日取瘤胃液用。
2、正式试验
采集与处理瘤胃液为方便读取12h产气量，瘤胃液最好在7:
30前取回。
所取瘤胃液为早饲前2h瘤胃液。
①到牧场后，将热水倒入水桶，调节水温度至39±0.5℃，用于瘤胃液保温（应时经常热水调节）；②用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶，盖好盖子；③回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，依次用二层、四层和六层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液不间断地通入CO2气体；④将密封的产气瓶从恒温箱中取出，用6.5号针头将产气瓶中多余气体放尽；⑤用20ml注射器吸取瘤胃液10ml，通过另一16号针头注入产气瓶，将两根针头取下，产气瓶置于39±0.5℃恒温箱中培养。
空白对照和标准对照
实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照。
空白对照不加样品只有90ml人工唾液和10ml瘤胃液，标准对照以750mg（DM）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入90ml人工唾液和10ml瘤胃液。
为了消除操作顺序和恒温培养箱条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于培养箱的不同位置。
记录产气量培养2、4、6、9、12、24、36、48h时，如果条件允许可延长培养时间，培养粗料时，至少96h或更长（有人培养一周），用压力传感器读取产气瓶内压力（轻拿、轻放），并放气。
要求：
使用压力传感器前，熟练软件的操作（有模拟程序可供练习）
产气量计算
（瓶子）
式中，GPt为样品在t时间段的产气量（ml）；Pt为t时间段读取的压力（mPa）；V0为瓶子体积；101.3为标准大气压（mPa）；W为样品干物质重。
产气过程的总积累产气量为各时间段产气量之和。
瘤胃发酵样品制备①培养中途取样时，要求取样同时，向产气瓶内通入CO2，并于39℃水浴中操作;②取混合液（发酵液及固体残渣）时要求在控温磁力搅拌机上操作。
重复试验要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%。
附表1：
人工唾液原液配制表
A、微量元素溶液：
CaCl2.2H2O13.2g;
MnCl2.4H2O10.0g;
CoCl2.6H2O1.0g;
FeCl3.6H2O8.0g;
加蒸馏水至100ml
B、缓冲液：
NH4HCO34.0g;
NaHCO335.0g;
加蒸馏水至1000ml
C、常量元素溶液：
Na2HPO4.12H2O9.45g
KH2PO46.2g
MgSO4.7H2O0.6g
加蒸馏水至1000ml
D、0.1%刃天青溶液：
100mg刃天青溶解于
100ml蒸馏水
E、还原剂溶液（现用现配）：
CysteineHCl625mg蒸馏水95ml1MNaOH4.0mlNa2S9.H2O625mg
附表2：
人工唾液配制表（1000ml）
顺序
原液
体积（ml）
1
蒸馏水
520.2
2
缓冲液（B液）
208.1
3
常量元素溶液（C液）
208.1
4
微量元素溶液（A液）
0.1
5
0.1%刃天青溶液（D液）
1.0
6
还原剂溶液（E液）
62.4
瘤胃液脂肪酸测定
（一）操作流程图
（二）试剂配制及具体操作
1、样品处理
①.取1ml样品于带盖的水解管，加入0.67ml5MNaOH和一滴饱和甲基橙指示剂后，充满N2；
②.85℃水浴30min，冷却至室温后，加入0.67ml5.1MHCl,使溶液pH低于2（溶液由橙色变为红色），如果不确定，可以用pH计检测；
③.加入1ml2mg/ml的内标C17：
0；
④.加入2.5ml氯仿/甲醇（2:
1,v/v）后，涡旋2min；
⑤.将样品在2000g下离心10min；
⑥.移去上层甲醇/水层，轻轻拨开中间杂质层，将下层溶液无损失转移；
⑦.通过含硫酸钠的干燥柱将下层氯仿滤入另一玻璃容量管；
⑧.用氮气将样品吹干；
⑨.用1.0ml正己烷悬浮后，简单涡旋；
⑩.2000rpm下离心10min，样品-20℃冷冻保存。
2、上机条件
色谱柱
HP-INNOWAX（19091N-133）毛细管柱，30m×0.25mm×0.25µm
气化室温度
260℃
检测室温度
270℃
柱温
采用程序升温，140℃持续5min后，以4℃/min升温至240℃后维持20min
载气及流速
载气为高纯氮，压力为100kpa，总流量87.9ml/min，柱流量0.84ml/min，线速度：
25.6cm/sec，分流比100，吹扫流量3ml/min，循环流量30ml/min
检测室气体流速
H2流量40ml/min，空气流量400ml/min
进样量
产气管，2µl；产气瓶4µl
浙江大学奶业科学研究所
Real-timePCR测定瘤胃微生物数量
一、样品采集
Invitro实验终止时，若分析混合微生物，可取1ml混合培养液于1.5ml灭菌离心管（也可直接用灭菌过的含0.3g0.1mm和0.1g0.5mm锆珠的2ml螺口管）-80度保存待用。
若要分别分析固、液相微生物时，将混合培养液过40um尼龙袋，滤液于4度500⨯g离心10，上清用于液体微生物DNA提取。
尼龙袋于39度灭菌水中冲洗至澄清用吸水纸吸干水份，-80度保存用于固相微生物DNA的提取。
InSacco方法与此相似。
二、总DNA的提取
1试验材料：
1.5mLEP管、螺口管、锆珠、1mL、200uL、20ul枪头（均需灭菌）、涡旋器、高速离心机等。
2所需试剂：
NaOH、Tris碱、EDTA二钠、NaCl、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、冷乙醇。
3.溶液配制方法：
试剂
方法
A
10MNaOH
称取40gNaOH，加到100mL水中。
无需除菌。
B
5MNaCl
称取29.22gNaCl，加水溶解定容至100mL。
C
1M，pH8.0Tris-HCl
称取12.114gTris碱，加80mL水，用浓盐酸调pH至8.0，加水定容至100mL。
D
0.5M，pH8.0EDTA
将18.61gEDTA-Na.加入80mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
用10N的NaOH调节溶液的pH值至8.0，加水定容至100mL。
E
TE缓冲液（10mMTris-HCl，1mMEDTA，
pH8.0）
吸取1mL1M的Tris-HCl和0.2mL0.5M的EDTA，加水定容至100mL。
F
TN150（10mMTris-HCl;
150mMNaCl，pH8.0）
1ml1M的Tris-HCl和3ml5MNaCl,加水定容至100ml。
G
Tris饱和酚（pH8.0）
购买
H
24：
1的氯仿∕异戊醇
240mL氯仿+10mL异戊醇
I
无水乙醇
-20度保存。
J
70%乙醇
70mL无水乙醇加30mL水-20度保存。
4提取步骤：
⑴液相微生物：
冰上解冻样品后于4度20000g离心5min，弃上清液。
加入1mLTN150悬浮沉淀，再加150µL的Tris饱和酚，Bead-beater匀浆（4600g，2min），冰上两分钟冷却，重复三次。
固相微生物：
称取0.35g固体培养物于2ml螺口管，再称0.3g0.1mm和0.1g0.5mm灭菌过的锆珠。
加入1mLTN150，150µL的Tris饱和酚，Bead-beater匀浆（4600g，2min），冰上冷却两分钟，重复三次。
以下步骤相同
（2）加入150µL氯仿∕异戊醇，涡旋混匀。
20000g离心5min，上清液转至已1.5mLEP管中。
（3）加入150
升级会员 