气相色谱法操作规程与注意事项.docx
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气相色谱法操作规程与注意事项
气相色谱法操作规程与注意事项
1.程序
1.1.仪器及性能要求
1.1.1.气路系统：
●通常使用的载气有：
氢气、氮气、氦气、氩气和空气。
这些气体除空气可有空压机提供外，一般都有高压钢瓶提供。
实际工作中要在气源与仪器之间连接气体净化装置。
气体中的杂质主要是一些永久气体、低分子有机化合物和水蒸气，一般采用装有分子筛的过滤器以吸附有机杂质，采用变色硅胶除去水蒸气。
将分子筛置于马弗炉内加热到400~600℃活化4~6h即可再次使用；当硅胶变红时，将其放在烘箱中140℃左右加热2h即可再次使用。
●气相色谱仪的气路形式主要有单柱气路和双柱气路两种，前者简单适于恒温分析，后者适于程序升温，补偿固定液流失，使基线稳定。
1.1.2.进样系统：
●进样口和进样模式：
填充柱进样口；分流/不分流进样口；冷柱头进样；程序升温气化进样；大体积进样；顶空进样技术等。
Ø分流/不分流进样：
最常用的毛细管柱进样口。
分流进样的进样量一般不超过2ul，最好控制在0.5ul以下，常用的分流比为10:
1~200:
1，样品浓度大或进样量大时，分流比可相应增大，反之则减少。
分流进样时要注意分流歧视现象，具体分析中应使色谱柱的初始温度尽可能的高一些，另外，在安装色谱柱时要保证柱入口端超过了分流点，二是要保证柱入口端处于汽化室衬管的中央。
Ø冷柱头进样：
冷柱上进样就是将样品直接注入处于室温或更低温度下的色谱柱内，然后再逐步升高温度使样品组分依次汽化通过色谱柱进行分离，这样就可以避免样品的热分解及汽化室死体积对样品稀释与扩散作用，适用于分析热不稳定化合物。
此操作需要特殊的注射器，而且容易有大量的不挥发样品结在色谱柱进口端造成色谱柱的污染。
Ø顶空进样：
顶空进样技术广发应用于药物中的残留有机溶剂分析。
本化验室采用的是静态顶空法，就是将样品溶液密封在一个容器中，在一定温度下加热一段时间使气液两相达到平衡，然后取气相部分进入气相色谱分析。
⏹气化室：
其目的是为了使样品瞬间气化为蒸汽。
衬管容积是影响分析质量的重要参数，基本要求是衬管容积至少要等于样品中溶剂在设定温度、压力下气化后的体积。
在实际工作中要注意衬管容积与样品的匹配性。
⏹进样密封硅橡胶垫应先加热老化，除去挥发性物质再用，并注意经常更换，另外也要注意经常更换衬管上端的密封硅橡胶圈。
⏹进样：
色谱分离要求再最短时间内，以“塞子”形式打进一定量的试样，通常都是用注射器打针法进样。
气体样品可以用旋转式六通阀进样。
液体样品可用微量注射器进样。
固体样品一般是溶解在液体溶剂中，按液体进样法进样。
1.1.3.柱箱：
柱箱温度的波动会影响色谱分析结果的重现性，因此要求柱箱控温精度应在±1℃，且柱箱温度波动小于0.1℃/h。
温度控制分恒温和程序升温两种，前者用于简单组分分析，后者用于复杂多组分分析。
1.1.4.色谱柱为毛细管柱，材质为玻璃或石英，内径一般为0.25mm、0.32mm、0.53mm，长度一般在5~60m。
柱形有U形、螺旋形。
1.1.5.检测器：
检测器分为氢火焰离子化检验器（FID）、热导检测器（TCD）、电子捕获检测器（ECD）、氮磷检测器（NPD）；红外光谱检测器（IRD）和质谱检测器（MSD）等。
●药化分析中最常用氢火焰离子化检验器（FID）和TCD检测器。
●FID检测器操作条件及注意事项：
Ø气体流速：
FID检测器需用3种不同的气体：
载气、氢气和空气，由于毛细管柱的柱内载气流量太低（常规柱为1-5ml/min），不能满足检测器的最佳操作条件，所以使用毛细管柱时要采用辅助气（尾吹气），即在色谱柱后增加一路载气直接进入检测器，就可保证检测器在高灵敏度状态下工作，尾吹气的另一个重要作用是消除检测器死体积的柱外效应。
一般情况下，氮气（尾吹气+载气）、空气和氢气三者的比例接近或等于1：
10：
1（如：
氮气30~40ml/min，空气300~400ml/min，氢气30~40ml/min）时，FID的灵敏度最高。
Ø检测器温度：
温度对FID检测器的灵敏度和噪声的影响不显著，为防止检测器被污染，检测器温度设置应不低于色谱柱实际工作的最高温度，一般情况下，检测器的温度不低于150℃。
●TCD操作条件及注意事项：
Ø检测器温度和载气流速的波动影响稳定性，故必须稳定。
检测器温度一般设定与柱温相同或高于柱温。
Ø载气体类对TCD的灵敏度影响较大。
原则上讲，载气与被测物的传热系数之差越大越好，故理想的载气为氦气。
若不需高灵敏度时，也可采用氮。
氢的热导系数大，也可作为分析某些品种的载气，但必须注意通风和安全。
Ø在检测器通电之前，一定要确保载气已经通过了检测器，否则，热丝就有可能被烧断。
同时，关机时一定要先关检测器电源，然后关载气。
任何时候进行有可能切断通过TCD的载气流量的操作，都要先关闭检测器电源。
Ø载气中含有氧气时，会使热丝寿命缩短，所以，用TCD时载气必须彻底去除氧。
而且不要使用聚四氟乙烯作载气输送管，因为它会渗透氧。
●一般检测器种类不得任意改变，但检测器的灵敏度可以适当改变以适应系统适用性的要求。
1.1.6.色谱数据采集处理及仪器控制系统：
由于微电子技术的不断发展，特别是计算机的出现，当今的气相色谱仪一般都采用计算机（工作站软件）进行数据采集和处理，同时也对色谱仪的自动进样器、柱温、检测器、温度、载气流速和压力等色谱参数进行设定和控制，使气相色谱分析自动化。
1.2.系统适用性试验
1.2.1.为了确定最终运行系统的有效性，应当进行系统适用性试验。
整个系统可以用下面指标来评价：
信噪比、理论塔板数，分离度，重复性，拖尾因子，其指标及计算方法应在相关分析方法中予以规定，如果没有专门的规定，按以下方法进行计算：
●信噪比：
用于评价色谱系统检测微量物质的能力，美国药典的计算公式：
S/N=2H/h，H为峰顶到基线的距离，h为基线中噪声峰最大值与最小值的差，该段基线需取≥5倍半峰高宽的距离，如果有可能，目标峰两侧取相等的距离（如图1）。
美国药典规定：
定量限测定时，信噪比S/N≥10；检测限测定时，信噪比S/N≥2或S/N≥3。
中国药典规定：
定量限测定时，信噪比S/N≥10；检测限测定时，信噪比S/N≥3。
图1噪声和色谱峰，物质的信噪比
●理论塔板数：
一般用于评价色谱柱的柱效，美国药典的计算公式：
N=16（tR/W）2，当用电子积分时，可能通过以下公式计算：
N=5.54*（tR/Wh/2）2。
tR为物质保留时间，W、Wh/2分别为物质的峰宽和半高峰宽。
中国药典中两个公式均可用，且中国药典和美国药典均规定：
当测定结果存在争议时，色谱柱的理论塔板数以峰宽的计算结果为准。
●分离度：
用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。
两个相邻色谱峰的分离度，美国药典的计算公式：
R=2*（tR2-tR1）/（W1+W2），当用电子积分时，可能通过以下公式计算：
R=1.18*（tR2-tR1）/（W1，h/2﹢W2，h/2）。
tR1为相邻两色谱中前一峰的保留时间，tR2为相邻两色谱中后一峰的保留时间，tR2＞tR1。
W1，W2和W1，h/2和W2，h/2分别为相邻两物质的峰宽和半高峰宽（如图2）。
中国药典中两个公式均可用，规定：
当测定结果存在争议时，色谱柱分离度以峰宽的计算结果为准。
除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间分离度应大于1.5。
图2保留时间、峰宽和半峰宽
●重复性：
为了充分验证系统的精密度，可以在样品进样之前以及穿插在样品进样中进行标准试液的重复进样。
Ø一般要求
⏹根据USP<621>规定，对用于含量测定的标准溶液或其他标准溶液重复进样分析，比较结果来确认精密度是否符合要求。
连续进样5次，除在方法中已明确规定外，其峰面积测量值RSD≤2.0%。
如果5针的RSD>2.0%，可连续进样6针，其峰面积测量值的RSD≤2.0%。
⏹对于杂质检测，除非另有规定，要求相对标准偏差小于等于10.0%。
ØEP药典关于含量检测相对标准偏差所允许的最大值规定：
表中B%：
规定的限度上限减去100%。
进样次数
3
4
5
6
B%
最大允许的相对标准偏差
2.0
0.41
0.59
0.73
0.85
2.5
0.52
0.74
0.92
1.06
3.0
0.62
0.89
1.10
1.27
●拖尾因子：
描述峰的对称性，完美对称的峰托尾因子是1，拖尾越明显其数值会增大。
在某些情况下，托尾因子小于1。
峰的不对称增加，积分及精确度都会变差。
美国药典中的计算公式：
As=W0.05%/2f，W0.05%为5%峰高处的峰宽，f为峰顶在5%峰高处横坐标平行线的投影点至峰前沿与此平行线交点的距离（如图3）。
中国药典中也用此公式且规定：
以峰高作定量参数时，除另有规定外，测定的T应在0.95~1.05之间。
以峰面积作定量参数时，一般的峰拖尾或前伸不会影响峰面积积分，但严重拖尾会影响基线和色谱峰起止的判断和峰面积积分的准确性，此时应在品种正文项下对拖尾因子作出规定。
图3拖尾峰
1.2.2.可调整的色谱条件：
●柱长：
±70%的可调范围。
●柱内径：
±50%。
●毛细管GC膜厚度：
-50%到100%。
●GC粒径：
倘若色谱满足系统适用性的要求且粒径比率保持不变，GC的载体粒径可以由大换小或者由小换大，粒径比率由最大颗粒的直径除以最小颗粒的直径而来。
●流速：
±50%。
●进样体积：
检测器和重复性较好时可做适当调整。
●GC柱温：
±10%。
●程序升温（GC）：
温度的调整如上述所允许。
指定时间来维持温度或者温度从一个值变化到另一个值。
调整的极值为±20%。
1.3.测定方法
1.3.1.内标法：
按各品种项下的规定，精密称取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。
取一定量注入仪器，记录色谱图。
测量对照品和内标物质的峰面积，按下式计算校正因子：
校正因子（f）=（AS/CS）/（AR/CR）
式中AS为内标物质的峰面积，AR为对照品的峰面积，CS为内标物质的浓度，AR为对照品的浓度。
再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测组分和内标物质的峰面积，按下式计算含量：
含量（Cx）=f*Ax/（A’s/C’s）
式中，Ax为供试品峰面积，Cx为供试品的浓度，A’s为内标物质的峰面积，C’s为内标物质的浓度，f为校正因子。
采用内标法，可避免因样品前处理或进样体积误差对测定结果的影响。
1.3.2.外标法：
按各品种项下的规定，精密称取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积，按下式计算含量：
Cx=CR*Ax/AR
Cx——试样中待测成分的浓度
CR——对照品溶液中待测成分的浓度
Ax——试样中待测成分的峰面积
AR——对照品溶液中待测成分的峰面积
1.3.3.面积归一法：
按各品种项下的规定，配制成供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。
测量各峰面积和色图谱上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积站总峰面积的百分率。
归一法是常用的一种简便的定量方法，本法通常只用于粗略考察供试品中的杂质含量。
除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。
1.3.4.标准溶液加入法：
按各品种项下的规定，精密称（量）取某个杂质或待测成分对照品适量，配制成适当浓度的的对照品溶液，取一定量，精密加入到供试品溶液中，根据外标法或内标法测定杂质或主成分含量，再扣除加入的对照品溶液含量，即得供试品溶液中某个杂质和主成分含量。
也可以按下述公式进行计算，加入对照品溶液前后校正因子应相同，则按下式计算待测组分的浓度Cx：
Cx——供试品中组分x的浓度
Ax——供试品中组分x的色谱峰面积
Δx——所加入的已知浓度的待测组分对照品的浓度
Ais——加入对照品后组分x的色谱峰面积
1.4.样品分析程序及评价
除另有规定外，按以下进样原则进行分析。
进样过程可根据各品种项下的规定进行适当的调整。
1.4.1.杂质测定：
●原辅料的杂质分析
编号
溶液名称
进样次数
1
空白溶液
≥1
2
对照品溶液
1
3
供试品溶液
1
●中间体、中控物料的杂质分析
编号
溶液名称
进样次数
1
空白溶液
≥1
2
供试品溶液
1
1.4.2.成品中残留溶剂、含量的测定：
除个论下另有规定，每当3批样品进样完成时需插入一针系统适用性溶液，整个系统最后一批样品完成时需再次进一针系统适用性溶液。
当样品批次少于3批时，可根据实际情况进行调整。
编号
溶液名称
进样次数
1
空白溶液
≥1
2
分离度溶液
1
3
标准溶液
6
4
样品溶液
2
5
标准溶液
1
1.5.仪器的维护保养
1.5.1.进样垫的维护及检修：
●有如下情况须进行进样垫检修和维护：
Ø注入次数大于100次时，进行定期更换；
Ø保留时间、面积的重现性变差时，进行定期更换；
Ø检查出现鬼峰；
●更换更换进样垫时，柱流量会中断，由于没有载气而柱温很高时，柱可能会被破坏，所以开始更换进样垫前应先将炉温冷却到室温。
1.5.2.O形环更换：
定期检查O形环，O形环材料中有使其增加柔韧性的增塑剂，在高温下增塑剂会讲解使O形环变硬而导致漏气。
1.5.3.玻璃衬管的维护与检修：
●有如下情况须进行玻璃衬管的检修和维护
Ø在一系列分析开始前；
Ø保留时间，面积重现性出现变差时；
Ø检测出鬼峰；
●检修点：
Ø玻璃衬管的形状：
形状异常无法进行正常分析；
Ø玻璃衬管的破损：
破损是出现重现性差的原因；
Ø玻璃衬管内的石英棉：
石英棉填充不当是产生重现性差的原因；
Ø玻璃衬管的内壁污染或进样垫碎渣：
这些污染是产生重现性差，鬼峰的原因；
●玻璃衬管的清洗：
将石英棉用细棒捅出，清除附着在玻璃衬管上的内壁污垢，用蘸溶剂（丙酮等）的纱布擦洗内壁，若衬管内壁污垢严重时，将玻璃衬管浸入丙酮数时，然后用蘸丙酮的纱布擦洗内壁，放入烘箱，在80℃左右条件下烘烤半小时后取出，重新安装。
1.5.4.分流平板清洗：
分流平板最为理想的清洗方法是在溶剂中超声处理，烘干后使用。
也可以选择合适的有机溶剂清洗：
从进样口取出分流平板后,首先采用甲苯等惰性溶剂清洗，再用甲醇等醇类溶剂进行清洗，烘干后使用。
1.5.5.色谱柱老化：
●有如下情况需要对色谱柱进行老化：
Ø新柱子应老化除去残留的溶剂；
Ø色谱柱中残留杂质；
Ø长期不用的色谱柱应老化去除存放过程中变性的固定相；
●老化温度：
Ø可以参考将进行的分析条件，在方法的最高温度基础上加20℃（但不得超过色谱柱的恒温温度上限）进行老化。
Ø如果尚无分析方法，可在色谱柱的恒温温度上减20℃进行老化。
老化时将炉温逐渐升至（升温速率没有具体限制，可以参考将进行的分析条件，建议使用比具体实验条件更快的升温速率）老化温度，然后在老化温度下持续老化，也可运行循环的程序升温来老化。
●老化时间：
Ø老化时间主要取决于应用分析对灵敏度要求以及操作者可接受的流失程度。
Ø对WCOT色谱柱，通常推荐的老化时间为2-3个小时。
当方法对灵敏度的要求较高、固定相的极性较强或膜厚较厚时，老化时间需要适当延长。
1.5.6.气体管线检漏：
使用电子检漏计查明漏气的部位，建议不要使用检漏液，以免造成污染。
1.5.7.清洗FID喷嘴和收集极：
用一个极细的金属丝穿过去，来回摩擦，使碳化在喷嘴内表面的毛细管等杂物脱落，重新通透。
或者把喷嘴和收集极拿下来放在丙酮或无水乙醇中超声15分钟，烘干后重新安装。
1.5.8.清洗缓冲管（分流）：
首先取下缓冲管，用注射器抽取丙酮，从缓冲管的一端注入丙酮，让其从另一端自由流出，重复注射丙酮10次及以上（或者将缓冲管浸泡在丙酮中超声清洗）之后，从另一端注入丙酮10次及以上，然后用注射器往缓冲管中吹空气，直到没有丙酮流出，放入烘箱，在80℃左右条件下烘烤两小时后取出，重新安装。
2.附录
2.1.附录一：
气相色谱仪维护保养记录
NO.:
气相色谱仪维护保养记录
仪器型号：
仪器编号：
项目
结果＊
维护人及日期
备注
接线、开关、旋钮、指示灯等是否正常
仪器外表清洁
初始化检查及自检是否正常
气体管线检漏
钢瓶压力（必要时换新瓶）
检测器热烘烤
色谱柱老化
进样口热烘烤
更换进样垫
更换O型环
更换衬管
更换玻璃棉
清洗衬管
清洗分流平板
更换分流平板
更换分流出口捕集阱
数据拷贝
清洗收集极
清洗FID喷嘴
清洗缓冲管（分流）
注：
●若有未提及的维护项目，可提出再另行增加。
●结果＊：
“√”表示正常，“×”表示异常，“Y”表示已做，“N”表示未做
●气相色谱仪维护和保养可以根据仪器使用频率而定。
●若出现异常情况应报告QC负责人，并采取相应措施使其恢复正常。
●每月维护一次，同时做好维护记录。
复核人：
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