基于基因密码子扩展的蛋白质标记新方法.docx
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基于基因密码子扩展的蛋白质标记新方法
项目名称：
基于基因密码子扩展的蛋白质标记新方法
首席科学家：
周德敏北京大学
起止年限：
2010年1月-2014年8月
依托部门：
教育部
一、研究内容
1、拟解决的关键科学问题
（1）利用酪氨酸、亮氨酸和吡咯赖氨酸氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对，以及大肠杆菌和酵母筛选系统，在蛋白质中特定位点引入特殊的非天然氨基酸，包括荧光氨基酸、具有生物正交化学反应性能的非天然氨基酸、高效率的光交联氨基酸、较大双光子吸收截面的光转化氨基酸、磷酸化的氨基酸、含有19F或自由基的氨基酸等。
（2）针对已有筛选系统效率不高的问题，发展结构生物学和计算生物学的方法，为筛选体系建立理论指导。
（3）发展和优化以“无铜点击化学”为代表的活体蛋白质特异正交标记技术。
（4）发展和优化氟取代化学反应，以期在蛋白质中引入19F探针，并优化荧光标记基团的性能。
（5）发展蛋白质特异标记方法，揭示哺乳动物细胞和线虫细胞的运动机理。
（6）拓展蛋白质特异标记方法，发现药物新靶标，优化蛋白质药物的靶向性和半寿期。
2、主要研究内容
本项目的主要研究内容是以在蛋白质特定位点插入非天然氨基酸为主要研究手段，结合超高分辨率荧光成像、核磁和顺磁共振技术和结构生物学、蛋白质组学技术，深入研究细胞生物学和医药学研究中所涉及的重要科学问题。
（1）基因编码非天然氨基酸筛选平台的构建
通过人工进化的方法增加编码非天然氨基酸。
首先把无义密码子“UAG”确定为新的遗传密码，进而对天然的转运核糖核酸（tRNA）基因突变,使其含有反密码子“CUA”。
在此基础上从氨酰-tRNA合成酶突变库中，筛选出可专一结合这种tRNA和指定非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶突变体。
然后再将生命体中mRNA上任意一个遗传密码取代为UAG,并在培养基中加入化学合成的非天然氨基酸，从而在蛋白质中的相应位置插入具有特殊物理或化学性质的非天然氨基酸。
其简要技术路线见图1:
图1：
基因编码的非天然氨基酸的总体技术路线及正负循环筛选途径
（2）真核细胞蛋白质翻译起始机制的解析
eIF2α磷酸化作为蛋白质翻译起始的“总开关”，受到多种细胞胁迫信号的控制，与GCN2,PKR,HRI,PERK等因子发生直接作用，发挥尚待确证的复杂的生物功能。
我们将通过在eIF2α的特定位点引入磷酸化的氨基酸，解析eIF2α蛋白质与诸多细胞因子（如PKR）复合物的结构，并从分子机理，特别是磷酸化的角度阐明细胞响应胁迫信号的途径。
我们也将对蛋白翻译起始过程中起重要作用的细胞因子做荧光和光交联标记，以求获得对蛋白起始复合物动态调控机制的全面理解。
（3）细胞运动的分子机理解析
细胞中许多重要的生理活动，如细胞移动、胞吞、细胞浆移动等，都受肌动蛋白（actin）聚合的调控。
Spire是新的actin核化因子，具有非常重要的生理功能。
为了研究它们在胞内actin结构中的精确定位，我们将具有光交联活性的氨基酸插入到Spire蛋白中对它进行标记，发现新的相互作用蛋白并研究它们的动态相互作用，以及对其它核化因子调控的影响。
我们还将使用基因转导方法在线虫活体中引入正交氨酰tRNA合成酶和tRNA的稳定表达系统，使得在线虫活体中可以用TAG停止密码子编码非天然氨基酸。
通过这个技术研究线虫精子运动的活化因子和活化因子的受体蛋白偶联的囊泡运输与胞吐。
（4）GPCR类细胞跨膜蛋白的受体激活和信号转导机理的研究
细胞膜上的受体蛋白如GPCR是一类极为重要的跨膜蛋白，在信号转导过程中发挥着关键作用，也是目前药物研发领域中最为关注的靶点之一。
GPCR是一类典型的膜蛋白，其α螺旋链共七次跨膜，因而只有在活体细胞膜原位上进行研究才有意义。
这其中，如何在活体细胞内观察GPCR的状态、结构变化、偶联程度等都是研究的热点，对GPCR工作原理的动态跟踪更是目前人们最为关心的问题。
由于荧光蛋白的体积过大，对细胞跨膜蛋白的结构和性质所造成的干扰相当严重。
我们希望通过基因编码的非天然氨基酸和生物正交反应对GPCR进行定点特异地小分子荧光标记，从而在对GPCR结构和性质不造成干扰的情况下，特异、高效地使用FRET及单分子荧光等手段对GPCR的受体激活、信号转导机理等关键性问题进行研究，在分子尺度上对GPCR的工作原理及信号转导过程中的结构变化进行精确的观察与捕捉，解决现有研究手段无法涉及的难题。
（5）抗病毒药物靶标的发现
非天然氨基酸可以选择性插入到活体蛋白的任何位置，如果在病毒包膜蛋白上插入了具有光交联活性的非天然氨基酸，在病毒感染细胞的动态过程中，一旦受光照激发，该非天然氨基酸将会与病毒结合的细胞受体或辅助受体共价结合，从而捕捉新的抗病毒药物靶点。
由于光照交联是不可逆的，通过弱的蛋白-蛋白间的相互作用或者呈瞬间方式与病毒结合的蛋白，将会因此而富集起来，从而改善了蛋白免疫共沉淀方法的灵敏度和准确性。
将具有特殊化学、物理甚至生理性质的非天然氨基酸引入到病毒的外膜蛋白上,将有可能整体推动病毒学研究，发现大量的新的药物靶标，为新型抗病毒药物研发奠定基础。
以上几个方向既是国际上生命科学研究的热点，也是我们研究的重点内容。
二、预期目标
1、总体目标
本项目的总体目标是针对蛋白质科学前沿问题，设计和建立新的非天然氨基酸表达体系，将具有特殊物理、化学性质的非天然氨基酸表达到活细胞中目标蛋白质的特定位点，并通过系统优化，推动该方法成为实验室常规技术，使我国在该技术及应用方面跻身于国际前列。
2、五年预期目标
（1）突破性进展
通过本项目的实施，我们将在蛋白质特异标记的技术、理论和方法等方面取得突破性进展：
系统建立在大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞以及线虫活体中具有普适性的引入非天然氨基酸的方法，全面发展荧光、核磁、光交联、光转化和磷酸化等蛋白质特异标记技术。
将蛋白质特异标记技术应用于超高分辨率荧光成像，特别是通过优化蛋白质荧光标记技术，力争使我们的空间分辨率的定位精度达到10nm，并做到实时活体观察。
将蛋白质特异标记技术应用于细胞运动的分子机理研究和药物靶标发现等，为我国在生命科学基础研究领域和药物研发应用领域带来重大突破。
（2）研究成果
通过基因密码的扩展，大力发展蛋白质荧光、核磁、顺磁、光交联、光转化和磷酸化标记技术，并将这些技术结合遗传学操作，应用于超高分辨率荧光成像、蛋白质动态相互作用、蛋白质磷酸化网络调控、细胞运动的分子机理探索。
②在蛋白质翻译机理方面，从结构生物学的角度解析氨酰tRNA合成酶与tRNA和底物氨基酸特异作用的机理，指导基因密码扩展技术的研究。
③发展以金属催化引入氟元素的方法学研究，对探索合成新型小分子荧光探针或非天然氨基酸，直接氟代蛋白质等提供化学手段的支撑。
④建立一种通用方法，将非天然基酸引入到活病毒的包膜蛋白上，开辟病毒受体发现的新途径。
⑤取得一批具有国际影响力的原创性成果，在国际重要学术刊物上发表论文50篇以上，并力争在最高影响力的Science或Nature系列期刊上发表论文，发现1-2个在病毒和细菌感染中起重要作用的药物靶点，申请国内外发明专利6项以上。
培养一批有国际影响力的中青年学术带头人和学术骨干，培养博士研究生30名、硕士研究生60名。
系统优化蛋白质特异标记技术，为全国蛋白质研究提供一个全新的独特的研究方法，全面推进细胞生物学、化学生物学和医药学等领域的研究进展。
三、研究方案
1、总体学术思路
本项目总体学术思路是发展基于基因密码子扩展的蛋白质标记的新技术，利用在化学生物学、蛋白质翻译机理、蛋白质进化、以及医药学方面的良好工作基础，针对更多蛋白质科学前沿问题，设计和建立新的非天然氨基酸表达体系，将具有特殊物理、化学性质的非天然氨基酸表达到活细胞中目标蛋白质的特定位点，并通过系统优化，推动该方法成为实验室常规技术。
本项目的研究目标是通过超高分辨率荧光成像、单分子荧光、核磁及顺磁技术提高对蛋白质定位和相互作用检测的精度；利用光交联技术研究具有重要意义的动态蛋白质识别和相互作用；利用具有光化学活性的非天然氨基酸标记实现对蛋白质活性的高时空精度操纵。
2、技术途径
（1）对非天然氨基酸具有特异性的氨酰tRNA合成酶的高通量筛选
首先，修改大肠杆菌或酵母细胞内的遗传密码，使无义的“UAG”密码对应于感兴趣的非天然氨基酸。
然后，筛选对非天然氨基酸具有特异性的氨酰-tRNA合成酶，技术路线如下：
在目标细胞中引入一个外源的氨酰-tRNA合成酶和tRNACUA，使其保持活性且不与内源的氨酰-tRNA合成酶和tRNA反应（生物正交性）。
②改变编码氨酰-tRNA合成酶活性氨基酸的DNA序列，建立氨酰-tRNA合成酶基因突变库。
③对氨酰-tRNA合成酶突变库进行如图1所示的正负循环筛选，得到特异识别目标非天然氨基酸的合成酶变异体，使其只催化tRNACUA与非天然氨基酸间的氨酰化反应。
（2）基于非天然氨基酸标记的超高分辨率荧光成像
普通光学显微镜的分辨率和灵敏度一百多年来一直没有根本性的改善。
2006年美国科学家Betzig首次在Science杂志上提出了光敏定位显微镜（Photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM）的概念，其基本原理是将荧光分子标记在目标蛋白上，结合全内反射显微镜（TIRFM）和单分子定位技术，突破了光学显微镜分辨率的极限，得到细胞内蛋白纳米级分辨率的精确定位。
我们首先用可被特定波长光激活的荧光基团标记蛋白，调节405nm激光器使低能量照射细胞表面，一次激发出少量的荧光分子，其能量被高量子效率的EMCCD采集，通过高斯拟合，特异性地精确定位这些荧光分子。
然后用561nm激光器漂白这些分子，使之免于被下一轮的激光激发出来。
之后再次用405nm和561nm的激光分别激发－漂白其他的荧光分子，进入下一次循环。
该循环经上百次后将得到细胞内所有荧光分子的精确定位，最后再将这些分子的图像合成到一张图上，得到一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术，其定位精度可能突破10nm甚至达1nm的量级。
（3）基于非天然氨基酸标记的蛋白质复合物晶体生长和结构解析
首先我们将运用动态光散射仪，对获得的蛋白质和稳定蛋白质复合物样品的溶液状态进行分析，考察其是否处于均一状态，在不同条件（温度、浓度、pH等）下的稳定形态和凝聚状态；同时运用溶液光谱（包括CD光谱和荧光光谱）方法分析蛋白质在溶液中的构象变化，综合各种因素初步确定适合于结晶实验的条件。
然后摸索晶体生长的条件，尝试大量不同的沉淀剂、蛋白质浓度、pH和缓冲体系、以及不同添加剂等，得到高衍射质量的晶体用于X-射线衍射分析。
一旦获得蛋白晶体，将利用X-射线衍射仪进行初步衍射实验，以帮助进行结晶条件的优化和低温冷冻条件的筛选。
具有高衍射能力的蛋白晶体将运用国内外同步辐射光源进行高分辨率的X-射线衍射数据的收集。
并运用单波长反常散射法、多波长反常散射法、同晶置换法、和分子置换法解析各种蛋白和蛋白复合物的三维晶体结构。
（4）基于非天然氨基酸标记的蛋白质19F核磁共振研究
溶液NMR技术是研究蛋白质-蛋白质相互作用、测定蛋白质复合物三维结构的强大工具。
19F由于具有较强的核磁信号对环境敏感，而大多数生物大分子都不含氟元素，因此用19F标记蛋白可以产生很高的信噪比，在活细胞中获得蛋白质相互作用的动态信息和蛋白质复合物的动力学特征，而且对蛋白质结构和功能的扰动达到最小（19F和氢原子的半径类似）。
我们将选择分子量合适的蛋白质复合物，运用19FNMR信号，在活细胞中或接近生理条件的溶液状态下，研究这些蛋白质复合物，特别是低亲和力、瞬时蛋白质复合物的动态结构和性质、蛋白质之间相互作用的分子机制，探测蛋白质之间是否发生相互作用及其亲和力（Kd）、蛋白质之间的结合界面等。
（5）基于蛋白质特异标记的膜蛋白信号转导过程研究
我们首先将发展一种可遗传性的小分子标记技术（GeneticallyEncodableSmallMoleculeLabeling,GESML），实现对活体细胞蛋白质的定点、特异和低干扰度标记。
侧链上含有化学活性官能团的非天然氨基酸将以“遗传性标签”（Genetictag）的形式嵌入活体蛋白质当中，并随后通过生物正交反应与小分子标记物特异结合。
这一方法有效地融合了现有各种标记手段的优势，在保持高特异性的基础之上，最大限度地模拟目标蛋白质的原有自然状态，为精准和严格的蛋白质标记需求提供一类有效的工具。
含有叠氮基团的非天然氨基酸将作为验证这一方法的切入点。
在此基础上，我们将把GESML技术应用到GPCR等膜蛋白受体的FRET研究当中。
利用该技术尺度小、特异性强、效率高、标记物荧光性能好，标记位点灵活等特色，对GPCR跨膜蛋白上变化最为显著的胞内loop3和loop5同时进行标记，有效提高FRET研究的灵敏度和准确度，并进而开展单分子FRET（smFRET）研究。
相信这些手段能够使我们更加精准、清晰、实时地揭示这类重要受体蛋白的激活机制和信号转导途径。
（6）基于蛋白质特异标记的细胞运动研究
在线虫中进行细胞运动研究，我们将首先使用基因操作的方法，在线虫活体中实现正交氨酰tRNA合成酶和tRNA对的稳定表达，从而使我们在线虫活体中可以用TAG终止密码子编码非天然氨基酸。
随后，我们将利用正向遗传学、反向遗传学和细胞生物学结合生物信息学的方法，筛选与精子发生、精子活化、精子运动及精卵结合中关键缺失突变体（或可根据点突变体表型从CGC获取缺失突变体），克隆其基因，在目标基因中引入TAG终止密码子以编码非天然氨基酸。
通过基因枪或显微注射法，导入由HSP启动子驱动单拷贝编码非天然氨基酸修饰的相关蛋白的DNA，大大加强我们在活体水平研究线虫精子细胞发生及运动的机理的能力。
在哺乳动物细胞中进行细胞运动研究，我们将用非天然氨基酸的方法标记Spire蛋白，在该蛋白中插入非天然氨基酸，实现对该蛋白的荧光标记,而且尽可能减少对目标蛋白的定位和功能的干扰；用光激活和光转化的荧光基团标记特异性地观测局部的actin，实现在活细胞内观察actin的核化以及延伸过程；利用自主研发的超高光学分辨率显微镜系统、PALM和STORM技术，实现细胞运动研究领域的技术突破，观察以前从未观测到的分子影像和行为。
（7）基于蛋白质特异标记的药物靶标发现研究
技术路线如下：
构筑特殊细胞包装系，使非天然氨基酸引入到病毒包膜蛋白上所需的特殊氨酰-tRNA合成酶和tRNA稳定表达。
②重组病毒基因，将非天然氨基酸的特殊编码子UAG置于病毒基因的合适位置。
③转染病毒基因，制备外膜蛋白含有具有光交联活性非天然氨基酸的活病毒。
④在病毒感染宿主细胞的动态过程中，光照激活非天然氨基酸,使病毒与结合的细胞蛋白共价交联。
⑤通过病毒包膜蛋白抗体沉淀和凝胶电泳等方法,分离和回收共价交联蛋白。
通过高分辨质谱和碎片分析技术以及与蛋白组学对照，解析交联蛋白的氨基酸序列和组成。
借助以上方法，我们将寻找HIV、HCV、VSVG等病毒感染细胞所依赖的受体，尤其是呈瞬间方式或结合力弱的辅助受体，为药物靶标发现提供新的研究手段。
3、创新点与特色
（1）构建新颖的“大肠杆菌-哺乳细胞”穿梭体系和分子进化平台，实现在大肠杆菌内高通量，高多样性的定标式分子进化和将筛选结果直接导入哺乳动物细胞，用于高效表达含有非天然氨基酸的哺乳细胞蛋白质。
（2）基因编码具有增强光交联或光转化效率的非天然氨基酸，提高发现与确认蛋白质相互作用的效率，使高时空精确操纵蛋白质磷酸化网络成为可能。
（3）基因编码磷酸化的氨基酸，使研究动态蛋白质复合物的结构成为可能。
（4）将金属催化引入氟元素的反应与蛋白质标记相结合，突破了以往蛋白质标记的方法学局限。
（5）将金属引入到荧光分子染料中用于蛋白质的标记，建立时间分辨荧光分析法（TRFIA），有效地区分背景荧光干扰，突破目前以有机染料为主的小分子荧光探针的固有缺陷。
（6）将含有叠氮基团（适合参与生物正交反应）的非天然氨基酸引入到生物体内，可以作为活性官能团参与各种化学反应，是推动生物正交点击反应这一新领域向前迈进的重要步骤。
（7）光激活的非天然氨基酸选择性地标记局部的Spire1，可以显著提高PALM技术的分辨率，精确解析Spire1在细胞中的定位；通过具有光交联活性的非天然氨基酸标记Spire1，有望发现全新的相互作用蛋白，对于阐明actin核化和组装过程有望取得开创性的进展。
（8）将非天然氨基酸引入到病毒的包膜蛋白上从而发现新的病毒受体，这是一个国际尚未开展的领域，有可能带来病毒学研究的重大突破。
4、可行性分析
（1）近年来将非天然氨基酸引入到大肠杆菌所表达的蛋白质中的技术在国外已日臻成熟，引入到哺乳动物细胞表达的蛋白质中在国际上已开始有相关的报道，同时蛋白质特异标记所面临的问题也越来越具体，聚焦改善非天然氨基酸引入效率的相关研究也有了深入的进展。
国内北京大学和中科院生物物理所在该领域也已有了几年的积累，并从国外引进数位开拓这一研究领域的学术骨干（均为本项目学术带头人），为进一步开展蛋白质特异标记技术研究，提供了宝贵的基础，蕴含着取得重大突破的良机。
（2）本项目的课题设置是沿着发展蛋白质特异标记技术的主线，以解决细胞生物学和医药学中的重要科学问题和需求为目标，结合了国际上蛋白质研究的最新需求，总结了物理、化学和生物学等多学科研究最新进展的基础之上提炼出来的。
课题组一和课题组二在将非天然氨基酸插入到细菌和哺乳动物细胞所表达的蛋白中，已经取得了丰富的成果，具有了深厚的积累，表明本项目的研究方案和技术路线是可行的，为本项目取得突破奠定了基础。
课题组三和课题组四在细胞运动和病毒学研究领域，也取得了骄人的成绩，为课题组一和题组二的研究成果在生命科学研究领域深入展开提供了保证。
（3）本项目研究队伍以富有经验的院士和原973首席科学家为指导，以30-45岁的青年科学家为骨干，更重要的是组成这支队伍的大部分研究人员具有在国外著名大学5至10年甚至更长的研究经历，分别在化学生物学、分子生物学、结构生物学、细胞生物学、医药学等方面具有深厚的研究功底，在各自领域取得了国际领先的成绩。
同时他们之间有长时间的合作基础、优势互补，已经形成了紧密的合作关系，这对于合作研究和攻关技术难度高、科学意义重大的课题有不可取代的优势，为本项目的实施和完成奠定了良好基础。
（4）本项目以北京大学和中科院生物物理所为依托，特别是生物物理所生物大分子国家重点实验室、北京大学分子动态与稳态结构国家重点实验室、稀土材料化学及应用国家重点实验室、天然药物及仿生药物国家重点实验室，以及正在筹建的蛋白质国家实验室、分子科学国家实验室和北京大学综合性药物研究大平台等，为本项目实施提供了重要的组织保障和技术支撑，具备了优越的研究条件。
5、组织方式
（1）在组织上强调体系化，瞄准总体目标，追求可持续发展。
组织管理和运作体制分项目和课题两个层次。
项目设首席科学家1人，负责整个项目的实施。
首席科学家聘任若干专家组成项目专家组，参与项目的组织、运行、领导和管理，协助首席科学家，审核和确定项目的学术思想、技术路线及研究计划，指导协调各课题的工作，督促并考核各课题的进展情况。
项目专家组由各学科领域成就卓著的专家组成，承担单位之外的专家将占较大比例。
（2）在技术方面，本项目将实施整体性运作方案。
在充分发挥项目各承担单位的学科优势和关键技术研究实力的基础上，强调优势力量的整合和协同攻关，切实克服“各自为战”的做法，形成功能配套、布局合理、机制灵活的创新体系。
（3）在项目实施过程中，充分体现技术平台共享，资源共享，人才队伍共享。
针对蛋白质特异标记技术重大科学问题，本项目课题的设置包括蛋白质特异标记技术的分子生物学方法（课题一）；蛋白质特异标记技术的化学方法（课题二）；基于蛋白质特异标记的活细胞高时空精度监控新方法（课题三）；基于蛋白质特异标记的药物靶标发现新方法（课题四）。
本项目的课题设置是沿着发展蛋白质特异标记技术的主线，以解决细胞生物学和医药学中的重要科学问题和需求为目标，有的放矢地将化学和分子生物学方法紧密结合起来，以求获得蛋白质特异标记方法和应用两个方面的重大突破。
课题一到四之间紧密相关、相互依托互补。
如课题二发展的新的氟代合成方法将有助于合成各种氟代的氨基酸，以进行课题一氟代氨基酸的基因编码研究。
课题一和课题二是课题三和课题四发展的基础，如课题二发展的氟代卟啉具有改进的荧光性能，将有利于课题三超高分辨率荧光成像的研究和课题四病毒感染细胞生物过程的追踪，课题一发展的基因编码荧光氨基酸和光交联氨基酸的技术，将有利于课题四药物靶标的发现。
课题三和课题四的需求和研究成果也将直接推动课题一和课题二的发展并彰显其重要价值。
课题三和课题四之间可以互相借鉴，推动整个生命科学的发展。
总之本项目的四个课题相对独立，但又有着天然的有机联系，相互之间的合作将极大地提高本项目的整体研究水平。
具体的课题设置见下：
课题一、蛋白质特异标记技术的分子生物学方法
主要研究内容：
（1）高通量筛选平台的建立
基因编码非天然氨基酸的关键是获得转运特定非天然氨基酸的特异氨酰tRNA合成酶，其步骤简述如下：
首先对多样性达109以上的氨酰tRNA合成酶突变库进行正筛选，目的是从中富集能够识别氨基酸的蛋白质合成酶突变体子集。
当该突变库和与其对应的tRNA正筛选载体一同转入大肠杆菌中,在非天然氨基酸存在的情况下进行氯霉素筛选。
由于正筛选载体上含有琥珀终止子（UAG）的氯霉素抗性基因，当氨酰tRNA合成酶能够识别某种氨基酸并将其附加在tRNA上，转运读过（readthrough）含有UAG的氯霉素抗性基因时，大肠杆菌母体才能存活，而没有活性的变异体将被氯霉素杀死。
图2：
（A）高通量筛选平台的建立；（B）代表性非天然氨基酸。
②正筛选后所得的合成酶变异体子集再经过一个负筛选，目的是将其中识别天然氨基酸的变异体排除。
当变异库子集和与其对应tRNA的负筛选载体一同转入大肠杆菌中,在不存在非天然氨基酸的情况下进行毒性基因（Barnase）压力筛选。
由于负筛选载体上含有琥珀终止子（UAG）的Barnase毒性基因，当变异体识别天然氨基酸并将其附加在tRNA上，转运读过含有UAG的毒性基因时，产生的毒性蛋白将大肠杆菌母体杀死，而没有活性的变异体随其母体的存活而存在下来。
经过正负双筛选，只有仅识别非天然氨基酸的变异体得到了富集。
③经过上述正负筛选2至3轮的交替进行，原本多样性极高的分子进化变异库，能够朝向某种特定的非天然氨基酸逐步富集，最终得到特异识别指定非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶。
（2）基因编码非天然氨基酸实现体内磷酸化网络的光学调控。
蛋白质磷酸化/去磷酸化是信号转导最重要的途径之一。
哺乳动物细胞中有数百种蛋白激酶和磷酸化酶，他们在细胞分化、细胞周期、胁迫信号的应答、及癌症和糖尿病的发生中具有其重要作用。
利用RNAi或基因敲除技术研究它们的功能，往往会由于目标基因的下调使与其功能相似的基因迅速上调而补偿其缺失，从而影响基因功能的解析，这是目前研究激酶和磷酸化酶的最大障碍。
另外由于每个蛋白激酶和磷酸化酶常有好几个结构功能高度类似的同源基因，很难得到对某一激酶具有特异性的小分子拟制物。
本子课题以在乳腺癌和糖尿病中具有重要意义的PTP1B为切入点，发展利用光学手段特异调控蛋白功能的方法。
由于PTP1B的催化需要Asp181的参与，通过扩展基因密码技术，将Asp181突变为光保护的天冬氨酸，这种突变体将失去酶活性。
在用720nM的双光子激发后，非天然氨基酸脱保护而形成天冬氨酸，从而生成有活力的PTP1B。
由于采用了双光子激发，这种方法具有高度的时空可控性。
在上调PTP1B酶活后，我们将用蛋白质组学的方法分析蛋白质
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