实验四果蝇唾腺染色体的观察.docx

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实验四果蝇唾腺染色体的观察

实验四果蝇唾腺染色体的观察

温度：

21-24摄氏度大气压：

80.1-82.42Kpa日期：

2016.4.28

姓名：

郑元跃学号：

20140322225班级：

14级生物二班

一目的

1、观察果蝇唾腺染色体的形态特征；

2、掌握剥离果蝇幼虫唾液腺的技术以及制作唾腺染色体玻片标本的方法；

3、观察果蝇唾液腺染色体的结构特征及了解果蝇唾腺染色体在遗传学研究中的意义；

二原理

双翅目昆虫（摇蚊、果蝇等）幼虫期的唾腺细胞很大，其中的染色体称为唾腺染色体。

这种染色体比普通染色体大得多，宽约5um，长约400um，相当于普通染色体的100—150倍，因而又称为巨大染色体。

唾腺染色体处于体细胞染色体联会配对状态。

并且唾腺染色体经过多次复制而并不分开，每条染色体大约有1000—4000根染色体丝的拷贝，所以又称多线染色体。

多线染色体经染色后，出现深浅不同、密疏各别的横纹，这些横纹的数目和位置往往是恒定的，代表着果蝇等昆虫的种的特征；如染色体有缺失、重复、倒位．易位等，容易在唾腺染色体上观察出来。

观察多线染色体的特征：

巨大；体细胞中同源染色体配对，所以细胞中染色体只可以观测出半数（n）；各染色体的异染色质的着丝粒部分互相靠拢形成染色中心（chromocenter）；横纹有深浅、疏密的不同，各自对应排列，这意味着基因的排列。

果蝇的染色体组成 

由于在唾腺细胞中8条染色体之间以着丝粒相互连结在一起形成染色盘或异染中心和同源染色体之间的假联会，经碱性染料染色后，可以观察到一个染色较深的染色盘和以染色盘为中心向外辐射出的5条染色体臂。

在这些染色体臂上可以看到染色深浅不同，被称为明带和暗带的横纹，这些横纹的位置、宽窄、数目都具有物种的特异性，不同物种，不同染色体的不同部位形态和位置是固定的，因此根据染色体各条臂带纹特征和各条臂端部带纹的特征能准确识别各条染色体。

在染色体臂上还可看到某些带纹通过染色体的界旋、膨大形成的疏松区和巴尔比尼环，其富含转录出来的RNA ，因此不着色，是基因活动的区域。

在个体发育的不同阶段，疏松区或巴尔比尼环在染色体上出现的部位不同，因此可以研究基因的表达，开展各种染色体变异的研究等等。

黒腹果蝇（Drosophilamelanogaster）染色体的组成；

有4对染色体。

其中一对为性染色体（XY或XX），XX染色体为顶端着丝粒染色体，呈杆状，Y染色体为“J”形；第二对、第三对染色体均为中央着丝粒染色体，呈“V”形；第四对染色体短小，为顶端着丝粒染色体，呈点状，附在染色盘边缘。

由于唾腺染色体的假联会，X染色体的一端在异染中心上，另一端游离；而第二对、第三对染色体着丝粒在中央，可以从异染中心呈“V”字形向外伸展出四条臂（2L、2R、3L、3R），Y染色体着丝粒附近的异染色质参与了染色中心的形成，所以理想的片子，不管雌雄果蝇的唾腺细胞在显微镜下均可见五条长臂（X、2L、2R、3L、3R）和一条短臂（第四条染色体臂不易观察）。

雄果蝇唾腺细胞中的X染色体臂比雌果蝇的稍细。

在染色体臂上可观察到许多明暗相间的带。

黒腹果蝇（Drosophilamelanogaster）唾腺染色体特点：

（1）巨大；    

（2）体联会现象决定了染色体只有半数；    （3）各个染色体中异染色质多的着丝粒部分相互靠拢形成染色中心；（4）横纹有深浅、数目、疏密的不同，各自对应排列，这意味着基因的排列，具有种的特异性。

    （5）多线染色体（与中期高度螺旋的染色体相区别）若有缺失、易位、倒位、重复等现象，很容易在唾腺染色体上识别出来。

果蝇唾腺染色体核型图果蝇唾腺染色体模式图

果蝇唾腺染色体图

三材料与方法

材料：

黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）三龄幼虫

用具：

显微镜、放大镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片

试剂：

1%醋酸洋红、HCl、生理盐水

方法：

1.剥离唾腺：

 在一干净的载玻片上滴一滴生理盐水，选择行动迟缓、肥大、爬在瓶壁上即将化蛹的三龄幼虫，或者选择经低温处理的果蝇三龄幼虫置于载玻片上。

每只手各持一个解剖针，在解剖镜下进行操作。

由于果蝇的唾腺位于幼虫体前1/3-1/4处，所以左手持解剖针按压住虫体后端三分之一的部位，固定幼虫，右手持解剖针扎住幼虫头部口器部位，适当用力向右拉唾腺腺体随之而出。

唾腺是一对透明的棒状腺体，外有白色的脂肪组织（不透明）。

去除幼虫其它组织部分，并把唾腺周围的白色脂肪剥离干净。

    2.解离：

 在唾腺组织上滴一滴1滴HCl，解离1-2min ，以松软组织，利于染色体的分散。

    3.染色：

  吸去 HCl，用水冲洗2-3次后滴加醋酸洋红染液染色10min。

 4.压片：

 染色完成后，盖上干净的盖片，并覆一层滤纸。

将片子放在实验台上，用大拇指用力压住，并横向揉几次。

（注意不要使盖片移动，用力和揉动是一个方向，不能来回揉。

当腺体被染成红色后，用滤纸擦去染液周围一圈的黑色沉淀物，再用蒸馏水冲洗2—3次，然后加上盖玻片，在盖玻片上方再植盖一层滤纸，用镊子在盖玻片，轻轻敲击几下。

再用拇指按住盖玻片用力下压，把腺体细胞压破，把染色体压散开．压片时放载玻片的桌面要干，不要使盖片滑动。

制好的玻片标本用蜡封住盖玻片四周以防干燥。

经低温冷冻处理的材料经解离，染色．加盖片后不必敲击．镜检即可看到分散良好的唾腺染色体

5.镜检：

   再用高倍镜观察。

    流程：

解剖唾腺→转到载玻片上→加1滴 Hcl解离1min →吸去HCl→水洗→醋酸洋红染色10min →盖片、压片→镜检

注意事项；

1.一定加生理盐水，否则唾腺易干。

2.将脂肪组织清除干净。

3.水不可太多，否则幼虫会漂浮而且活跃。

4.染色时间不可过长，否则背景也着色。

5.压片时要揉。

6.染色完以后，将旧的染色液吸去，加新的染色液，再压片。

四结果与分析

X2L

3L3R4

2R

40×显微镜下看到的结果

五讨论与结论

所做出的唾腺染色体能观察到有8条，而且制作的材料都是果蝇的三龄幼虫，制作的步骤为剥离，解离，漂洗，染色，压片。

和前人的做法大致相同，

在制作过程中我们没有考虑外界因素的影响，不同条件下染色体的膨松区的结构也会发生变化；每个人和一个所选的三龄幼虫大小不一样，而导致实验结果有差异。

在实验的过程中，通过用不同大小的三龄幼虫所拉出的唾腺染色体进行压片观察，通过对比观察结果，发现越大的三龄幼虫所观察到的染色体越明显，更好的数出染色体条数。

能更快的做出实验结果。

通过实验中总结与观察，实验中应把握：

（1）位于幼虫体前约三分之一处。

（2）是囊状结构，常附着不透明的带状脂肪。

（3）唾腺细胞较大，轮廓清晰。

（4）要将脂肪组织清除干净，否则影响观察，压片时不能来回揉压。

（5）由于样品难用肉眼观察到，在各步操作过程中（如冲洗、吸水等）要小心谨慎，以免样品丢失。

（6）掌握好染色时间，时间过短则染色效果不明显，时间过长则容易使背景染色，影响观察。

（7）观察唾液腺染色体制片，寻找形态良好、分散适中的图像仔细观察染色中心及各条臂的特点。

由于短小的第Ⅳ染色体不易观察到，所以常看到明显的5条臂。

雄果蝇的Y染色体主要由异染色质组成，几乎包含在染色中心内，因此雄果蝇的X染色体臂比雌果蝇的X染色体臂要细一些。

文献

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（2）：

28-31

作业

1、何谓多线染色体？

答：

多线染色体：

果蝇的唾腺细胞停止在分裂间期（永久间期），染色体核蛋白纤维不断复制，平行排列形成巨大而伸展的多线染色体唾腺染色体经过多次复制而并不分开，每条染色体大约有1000—4000根染色体丝的拷贝，所以又称多线染色体（polytenechromosome）。

核内DNA多次复制产生的子染色体平行排列，且体细胞内同源染色体配对，紧密结合在一起，从而阻止了染色体纤维进一步聚缩，形成体积很大的由多条染色体组成的结构叫多线染色体。

多线化的细胞处于永久间期，体积也相应增大，它存在于双翅目昆虫的幼虫组织内，如唾液腺、气管等。

特点：

多线染色体不是生长到一定程度就进入有丝分裂，而是不断生长，继续复制，而且新的复制体总是沿其全长整齐地与原来的染色体并列着的，因而染色体就生长得极其庞大。

例如，在果蝇唾腺细胞中每一个多线染色体都是经过大约9个循环的复制产生的，所以每条多线染色体至少包含了500-1000条单染色体（DNA纤丝），某些昆虫的多线染色体包含了多达16000条。

经过醋酸洋红或地衣红染色后，在高倍光镜下就可以看到每条多线染色体都是由暗带和明间带直线交替组成的。

同时也已证明，大部分DNA存在于暗区带之内，每条区带都相应于染色体上染色粒的聚合区域，它能被碱性染料染得很深，孚尔根染色呈现阳性，而明间带则几乎不着色。

以后又证明了每条区带都包括几个或几十个基因位点。

2、你如何证明你看到的是唾腺染色体？

答：

（1）由于在唾液腺细胞中8条染色体之间以着丝粒互相连结在一起形成染色盘或异染中心和同源染色体之间的假联会，经碱性染料染色后，可以观察到一个染色较深的染色盘和以染色盘为中心向外辐射出的5条染色体臂。

（2）在这些染色体臂上可以看到染色深浅不同，被称做明带、暗带的横纹，这些横纹的位置，宽窄、数目都具有物种的特异性。

不同物种，不同染色体的不同部位形态位置是固定的。

因此根据染色体各条臂带纹特征和各条臂端部带纹特征能准确识别各条染色体。

（3）在染色体臂上还可看到某些带纹通过染色体的解旋、膨大形成的疏松区和巴尔比尼氏环，其富含转录出来的RNA，因此不着色。

（4）唾液腺细胞处于永久早期，染色体解旋呈伸展状态．在幼虫发育过程中细胞核中的DNA多次复制，但细胞、细胞核不分裂。

复制后的染色单体DNA不分开，从而形成了多线染色体。

（5）每一臂上所有的横纹的大小和位置是恒定的，即具有种的特征。

3.在昆虫学中，二龄幼虫，三龄幼虫有何生物学意义？

生态学意义？

遗传学意义？

答：

果蝇是完全变态发育的生物之一，二龄幼虫，三龄幼虫是其变态发育的重要特点。

从初生卵发育至新羽化的成虫为一个完整的发育周期，在25℃，60％相对湿度条件下，大约为10天。

通过控制养殖的温度，可以加速和减缓果蝇的发育。

果蝇个体很小，幼虫在三龄时达到最大，约2毫米，成年果蝇也仅为2－3毫米。

新羽化的雌性成虫大约8小时之后即可进行交配，交配之后大约40小时开始产卵，第4-5天出现产卵高峰。

性成熟雌性果蝇生殖能力很强，产卵初期每天可达50～70枚，累计产卵可达上千枚。

黑腹果蝇是最普遍应用于遗传学的果蝇，也是奠定经典遗传学基础的重要模式生物之一，对其染色体组成和表型、基因编码和定位的认识，是其它生物无法比拟的。

基于清晰的遗传背景和便捷的遗传操作，果蝇在发育生物学、生物化学、分子生物学等领域也都占据了不可替代的位置。

随着神经科学的兴起，许多遗传操作在该领域不断发展和成熟，为在果蝇中进行神经科学的研究打下了坚实的基础。

总之，果蝇在近一个世纪以来的生物学舞台上占有举足轻重的地位，在各个领域的广泛应用使其成为一种理想的模式生物，不论在已往、现在和将来都将为人类探索生命科学的真谛做出不可磨灭的贡献。

4、试着分别设计一个以动物（果蝇除外）、植物、微生物为材料的“细胞遗传学实验”。

答：

动物的“细胞遗传学实验”：

以小鼠作为实验材料；

方法：

（1）取雄性小鼠，以每克体重4微克注射秋水仙素（约1mL），14-16h后，用断头法处死小鼠，取出睾丸用生理盐水（0.9%NaCl溶液）洗去血污，置于解剖盘中。

（2）将睾丸放入装有1mL0.3%KCl溶液的小烧杯中剪碎（液体呈乳白色）。

（3）用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3%KCl溶液至4mL。

（4）37℃静置30mins，低渗处理。

（5）以800-1000r/min离心8分钟。

（6）弃上清液，加入2mL甲醇·冰醋酸固定液。

用吸管吹气，轻轻打散细胞，固定8mins。

（7）再以800-1000r/min离心8分钟。

（8）弃上清液，加入1mL甲醇·冰醋酸固定液制成细胞悬液，固定5mins。

（9）取去洁净的低温预冷载片，距10-15cm的高度滴下2-3滴细胞悬液，从一边轻轻吹气，并随时轻轻敲打，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。

（10）用滤纸擦去载片上的多余液体，空气干燥或文火干燥，染色30-35mins。

（11）在显微镜下观察。

植物的细胞遗传学实验”：

以豌豆种子为实验材料；

方法：

（1）.取材：

将蚕豆种子培养在培养皿内的湿滤纸上，室温或28°C下发芽，待胚根长达1~2cm时，切取0.5cm长的根尖部分。

（2）预处理：

将切下的根尖浸入0.1%秋水仙素液中，室温下处理3~4h。

（3）水解：

把根尖投入预热的58~60°C1mol/L热HCl中，恒温条件下水解14~15min

（4）染色：

倒去热HCl,滴加卡宝品红少许，染色5~10分钟。

（5）洗涤：

吸去卡宝品红试剂，用蒸馏水换洗2~3次，每次1~2min。

除去残留染色液后加几滴45%醋酸。

（6.）压片：

用吸管从醋酸中吸取材料，置干净载玻片上，材料周围保留半滴45%醋酸，盖上盖玻片，其上放一片吸水纸。

左手指压住吸水纸的左边，右手指从吸水纸的左端向右方轻轻抹去，再用铅笔擦头从盖玻片上轻轻敲打，使细胞均用散开。

（7）镜检：

把压好的片子放在显微镜下进行观察。

微生物则以酵母菌

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