植物DNA和RNA提取方法.docx
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植物DNA和RNA提取方法
实验一植物基因组DNA的提取
一、实验目的
掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。
学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。
二、实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类）对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠（sarkosyl）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadyltrimethylammomumbromide，简称为CTAB）、十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate，简称SDS）等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
三、实验材料
水稻幼叶
四、主要试剂配方
2%CTAB抽提缓冲溶液:
CTAB4gNaCl16.364g1MTris-HCl20ml（PH8.0）0.5M
EDTA8ml，先用70mlddH2O溶解,再定容至200ml灭菌,冷却后0.2-1%2-巯基乙醇
（400ul）
氯仿-异戊醇（24：
1）：
先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。
五、实验步骤
1.DNA的提取
（1）2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。
（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；
（3）加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；
（4）将磨碎液分倒入1.5ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；
（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出；
（6）冷却2min后，加入氯仿-异戊醇（24：
1）至满管，剧烈振荡2~3min，使两者混合均匀；
（7）放入离心机中10000rpm离心10min，与此同时，将600µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；
（8）10000rpm离心1min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；
（9）10000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；
（10）60sec后，直立离心管，加入720µl的75%乙醇及80µl5M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；
（11）放置30min，使DNA块状物的不纯物溶解；
（12）10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800µl75%的乙醇，将DNA再洗30min；
（13）10000rpm离心30sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；
（14）加入50µl0.5×TE（含RNase）缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15h，使RNA消解；
（15）置于-20℃保存、备用。
2.DNA质量检测
琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。
六、注意事项
（1）叶片磨得越细越好。
（2）移液器的使用。
（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。
思考题：
1.本实验中所用到的各试剂的作用是什么?
CTAB,氯仿,异丙醇,75%乙醇,EDTA
2．提取基因组DNA的方法有哪些？
各有何优缺点？
实验二多聚酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
一、实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。
二、实验原理
PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。
基本原理及过程如下：
PCR循环过程中有三种不同的事件发生：
（1）模板变性；
（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。
1．变性：
加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2．退火：
在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。
3．延伸：
体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：
DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNATaq聚合酶。
琼脂糖凝胶电泳的原理：
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。
不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。
EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。
用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。
三、实验材料及相关试剂
基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等
四、实验步骤
1．模板DNA的抽提：
实验一所得的水稻基因组DNA。
2．PCR操作（在冰上操作）：
（1）PCR反应混合液的配制：
反应体系25µL,在无菌的0.2mL离心管中按下列操作程序加样：
反应物
加样顺序
体积/µL
终浓度
ddH2O
1
17.3×n
10xBuffer
2
2.5×n
1x
25mmol/LMgCl2
3
1.5×n
1.5mmol/L
10mmol/LdNTP
4
0.5×n
200µmol/L
10µM上游引物
5
1×n
0.4µmol/L
10µM下游引物
6
1×n
0.4µmol/L
DNATaq聚合酶
7
0.2×n
1U
（2）将反应混合液混匀,然后每个PCR管中分装24µL反应混合液，再加1µL模板DNA，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发,然后稍离心。
（3）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：
94℃4min（预变性）94℃30sec,60℃30sec,72℃2min72℃7min
35个循环
（4）注意事项
由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。
a.所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。
b.操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。
c.每加一种反应物，应换新的枪头。
3．PCR产物的检测：
琼脂糖浓度（1.2%）；EB浓度（5µl/100mlTBE）
（1）制胶（以150mL为例）
a.称取1.8g琼脂糖，加入150ml的TBE缓冲液（pH8.0），摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。
b.电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量;
c.用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃），倒入其中，直至厚度为4～6mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固（约30~45min）；
d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。
（2）点样
a.将2.0µl溴酚蓝加入到PCR产物中，然后稍微离心；
b.每孔点样10.0µl，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。
（3）电泳
打开电源开关，调节电压至3~5V/cm（约100V），可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。
（4）染色
将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中,染色15-20分钟。
（5）观察
将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。
如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。
（6）注意事项
a.煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。
b.煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。
c.倒胶注意厚度（4-6mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。
也可待胶稍凝固后，放入4℃冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。
d.加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。
e.一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。
凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。
思考题：
1．PCR反应液中主要成分是哪些？
在PCR反应过程中各起什么作用？
2．为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？
3．用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？
实验三植物总RNA的提取
一、实验目的
通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法
二、实验原理
RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。
高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。
细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。
三、仪器、药品与试剂配方
（一）仪器
1．低温离心机
2．分光光度计
3．琼脂糖胶电泳系统，用前先用1%NaOH溶液浸泡过夜,之后再用DEPC水浸泡冲洗。
4．高压灭菌锅
5．研钵、剪刀、一次性手套等
（二）药品
1.焦碳酸二乙酯（DEPC）
2.吗啉代丙烷磺酸（MOPS）
3.异硫氰酸胍
4.醋酸钠（NaAc）
5.氯仿
6.苯酚
7.甲醛
8.乙醇
9.乙二胺四乙酸（EDTA）
10.琼脂糖
11.异丙醇
（三）试剂配方
1．0.1%DEPC水
1.1mlDEPC加入100ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。
2.2mol/LNaAc、0.5mol/LEDTA、4mol/L异硫氰酸胍、4mol/LLiCl等均用DEPC水配制。
3.5ΧMOPS电泳缓冲液（pH7.0）
MOPS0.1mol/L
NaAc40mmol/L
EDTA5mmol/L
四、实验步骤
（一）总RNA的提取（方案一）
1.实验前10天左右播种水稻种子，在3-4叶期，剪取1.2g幼叶。
放入研钵，在液氮中研磨成粉末状，移入10mL离心管。
加入
4mol/L异硫氰酸胍4mL
苯酚3mL
2mol/LNaAc（pH4.8）0.3mL
氯仿0.6mL
混匀，冰浴放置30min。
2.4℃，8000r/min，离心13min。
3.弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心管中。
4.加入2倍体积无水乙醇，-70℃，0.5h。
5.4℃，8000r/min，离心13min。
6.弃上清，在沉淀中加入1mL4mol/LLiCl，使其溶解。
7.移入1.5mL离心管中，冰浴2h。
8.4℃，13000r/min，离心15min。
9.弃上清，在沉淀中加入400uLDEPC水，再加入400uL氯仿，混匀。
10.4℃，13000r/min，离心6min。
11.取上清,并加入1/10体积3mol/LNaAc（pH5.0），2倍体积无水乙醇，-20℃放置30min。
12.4℃，13000r/min，离心20min。
13.将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次。
14.将沉淀RNA室温下稍干燥。
15.加30uLDEPC水溶解，-70℃保存。
（二）总RNA的提取（方案二）
利用TRIzol提取液抽提RNA，具体步骤如下：
1.取幼叶约250mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5ml离心管；
2.加入1mlTRIZOL提取液震荡摇匀；
3.室温放置5min后，加入0.5ml的氯仿，剧烈摇动离心管5min；
4.在8℃条件下，12000rpm离心15min；
5.溶液分为两层，下层为酚－氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管，加入0.5ml异丙醇在15~30℃条件下，沉淀10min；
6.然后在,2~8℃条件下，12000rpm离心10min，RNA沉淀管壁和底部；
7.去掉液体部分，加入1ml75%酒精洗2次；
8.风干后，加入25µlDEPC处理过的水溶解RNA，储藏于-80℃冰箱备用。
（三）甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA
1．配制1.2%变性琼脂糖凝胶（40mL）
称取0.48g,加入DEPC水25.2mL,5X电泳缓冲液4mL,加热使溶解，稍冷却加入甲醛3.4mL,混匀，室温凝固0.5-1h.
2.RNA电泳检测样品制备
RNA
2μl
甲醛
2.5μl
甲酰胺
7.5μl
10×MOPS
2μl
RNALoadingBuffer
2μl
灭菌的DEPC水
4μl
混合液轻轻混匀并离心，放于65℃下温育5min后，置于冰上。
3.电泳检测
将1.2%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1×MOPS电泳缓冲液，覆盖凝胶约1mm。
将RNA样品加到凝胶点样孔中，在5V/cm条件下电泳30min，然后在EB中染色15-20min，在紫外灯下观察提取的RNA的质量。
五、注意事项
1．在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。
2．RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手套。
思考题：
1.实验中所用到的各试剂的作用是什么?
焦碳酸二乙酯（DEPC）,吗啉代丙烷磺酸（MOPS）,异硫氰酸胍,醋酸钠（NaAc）,氯仿,
苯酚,甲醛,乙醇,乙二胺四乙酸（EDTA）,异丙醇
动植物组织mRNA提取实验方法
一、材料
水稻叶片或小鼠肝组织。
二、设备
研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。
三、试剂
1、无RNA酶灭菌水：
用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
2、75%乙醇：
用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/LTris·Cl（pH7.6），0.5mol/LNaCl，1mmol/LEDTA（pH8.0），0.1%SDS。
4、洗脱缓冲液：
10mmol/LTris·Cl（pH7.6），1mmol/LEDTA（pH8.0），0.05%SDS。
四、操作步骤
（一）动植物总RNA提取-Trizol法
Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。
用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。
RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly（A）+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。
4、弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。
RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意]1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
（二）mRNA提取
由于mRNA末端含有多poly（A）+，当总RNA流径oligo（dT）纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo（dT）纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。
1、用0.1mol/LNaOH悬浮0.5-1.0goligo（dT）纤维素。
2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。
4、将
（一）中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。
5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。
7、加入1/10体积的3MNaAc（pH5.2），2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。
8、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。
9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。
10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。
[注意]1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
2、oligo（dT）纤维素柱用后可用0.3mol/lNaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3）冰箱保存，重复使用。
每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。
RNA提取流程
RNA（totalRNA）和信使RNA（mRNA）的抽提
RNA的提取
RNA和无RNA酶的环境
原核生物能产生功能上截然不同的三种RNA,信使RNA（mRNA）,核糖体RNA（rRNA）,转运RNA（tRNA）.而真核生物则能产生四种,还有一种为真核生物所持有的小RNA.mRNA是由基因转录而来的,它运送编码蛋白所需的信息.由于mRNA代表了基因表达的水平,因此mRNA的分离,定量和检测极为重要.
应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍.RNA存在于从简单的逆转录病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中.由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA,因此,RNA的分离通常是决定实验结果质量的第一步,也是关键的一步.
提取RNA过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤
RNA分离的实用方法既有简单直接的方法（如分离rRNA和tRNA）,也有困难和涉及复杂步骤的方法（如分离mRNA）.在无细胞体系中克隆基因的体外转录非常有用,它可以产生足量的同源RNA分子用作探针或模板以识别和测定表达基因的量,或用于RNA的生化研究,处理RNA样品时必需仔细小心,其程度取决于样品的用途和来源.由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏,固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要.对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要.
方案:
工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好,特别是那些用于细菌接种,培养基和试剂配制的区域,那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行DNA的制备和操作.通常认为这些区域富含RNA酶.
如有可能,使用标有"无RNA酶"的商品试管,吸头,溶液和水.通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶,
3）双蒸水（ddH2O）和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC（焦碳酸二乙酯）进行处理:
每100mL溶液或水中加入0.1mLDEPC原液,放在摇床上充分混匀并在37℃下作用数小时.然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活.
4）用分子级的试剂和DEPC处理过的水配制的溶液通常没有RNA酶.
5）分离RNA以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300℃烘烤4h以灭活核酶.如有可能,将其他设备也灭菌处理.
从组织中提取RNA则要注意:
动物器官的解剖器械
存放组织块的玻璃器皿
冻存组织块所用的器皿
组织器官的冲洗液
人汗含有RNA酶,故在所有步骤中均应戴手套并经常更换.
记住我们的周围环境含有大量的微生物和气雾,它们来自吸液操作或来自我们自己的呼吸.这些可能造成RNA酶的污染
一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA酶.细菌比哺乳动物细胞中有更多的RNA酶.因此从这些细胞中制备RNA应采取更严格的预防措施.
分离后的RNA通过琼脂糖凝胶电泳再经溴化乙锭染色后便可检查其是否完整.rRNA（18s和28s）条带模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解.
一步法分离RNA
应用
从组织或细胞中分离细胞的总RNA
从液体样品中分离RNA
TRIREAGENT（Tripure）是一种用于RNA分离的商品溶液.该法源于chomc-zynski的RNA分离一步法.它更便于使用并且结果更加可靠.对于来源有限的样品,我们推荐使用这种试剂.这种试剂能从同一样品中同时分离RNA,DNA,蛋白质.
方案.
用lmLTripure/50-100mg（组织）匀浆组织样品.对于细胞,每10cm2面积（贴壁的单层细胞）或每10
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