植物DNA和RNA提取方法.docx

1、植物DNA和RNA提取方法实验一 植物基因组DNA的提取一、实验目的掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodiu

2、m dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。三、实验材料水稻幼叶四、主要试剂配方2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭

3、菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。五、实验步骤1. DNA的提取（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65水浴中预热。（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；（3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；（4） 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；（5）置于65的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡23 min，使两者混合均匀；（7）放入离心机中10 0

4、00 rpm离心10 min，与此同时，将600 l的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；（8） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；（10）60 sec后，直立离心管，加入720 l的75%乙醇及80 l 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；（12）10000 r

5、pm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 l 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；（14）加入50 l 0.5 TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37恒温箱约15 h，使RNA消解；（15）置于-20保存、备用。2. DNA质量检测 琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。六、 注意事项 （1）叶片磨得越细越好。 （2）移液器的使用。 （3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作

6、应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。思考题：1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么? CTAB, 氯仿, 异丙醇, 75%乙醇, EDTA2提取基因组DNA的方法有哪些？各有何优缺点？实验二 多聚酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR) 基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测一、 实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。二、 实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1

7、）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。1 变性：加热使模板DNA在高温下（94-95）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2 退火：在体系温度降至37-65，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。3 延伸：体系反应温度升至中温72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5到3方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍

8、，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分

9、子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。三、实验材料及相关试剂 基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等四、实验步骤1模板DNA的抽提：实验一所得的水稻基因组DNA。2PCR操作 (在冰上操作)： （1）PCR反应混合液的配制：反应体系25 L, 在无菌的0.2 mL离心管中按下列操作程序加样： 反应物加样顺序体积/L终浓度ddH2O117.3n10 x Buffer 22.

10、5n1 x25 mmol/L MgCl231.5n1.5 mmol/L10 mmol/L dNTP40.5n200 mol/L10 M上游引物51n0.4 mol/L10 M下游引物61n0.4 mol/L DNA Taq聚合酶70.2n1 U（2）将反应混合液混匀, 然后每个PCR管中分装24 L反应混合液，再加1 L模板DNA，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发, 然后稍离心。（3）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：94 4 min (预变性) 94 30 sec, 60 30 sec, 72 2 min 72 7 min 35个循环（4）注意事项由于PCR灵敏度非常高，所以

11、应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。a. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。b. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。c. 每加一种反应物，应换新的枪头。3PCR产物的检测： 琼脂糖浓度（1.2%）；EB浓度（5 l / 100 ml TBE）（1）制胶（以150 mL为例） a. 称取1.8 g 琼脂糖，加入150 ml 的TBE缓冲液（pH 8.0），摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。 b. 电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量; c. 用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50），倒入其中，直至

12、厚度为46 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30 45 min)； d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。 （2）点样 a. 将2.0 l 溴酚蓝加入到PCR产物中，然后稍微离心； b. 每孔点样10.0 l，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。（3）电泳 打开电源开关，调节电压至35 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。（4）染色 将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中, 染色15-20分钟。（5）观察将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该

13、样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。（6）注意事项a. 煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。 b. 煮好的胶应冷却至50左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。c. 倒胶注意厚度（4-6 mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。d. 加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。e. 一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废

14、弃胶应集中处理，勿乱丢。思考题：1PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？2为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？3用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？实验三 植物总RNA的提取一、实验目的 通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法二、实验原理 RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过

15、酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。三、仪器、药品与试剂配方(一)仪器1低温离心机2分光光度计3琼脂糖胶电泳系统，用前先用1% Na OH溶液浸泡过夜,之后再用DEPC水浸泡冲洗。4高压灭菌锅5研钵、剪刀、一次性手套等(二)药品1. 焦碳酸二乙酯(DEPC)2. 吗啉代丙烷磺酸(MOPS)3. 异硫氰酸胍4. 醋酸钠(NaAc)5. 氯仿6. 苯酚7. 甲醛8. 乙醇9. 乙二胺四乙酸(EDTA)10. 琼脂糖11. 异丙醇(三) 试剂配方10.1% DEPC水1.1ml DEPC 加入100 ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。2. 2 mol/L NaAc、0.5 mol/L

16、EDTA、4 mol/L异硫氰酸胍、4 mol/L LiCl等均用DEPC水 配制。3. 5MOPS 电泳缓冲液(pH 7.0)MOPS 0.1 mol/LNaAc 40 mmol/LEDTA 5 mmol/L四、实验步骤（一）总RNA的提取（方案一）1. 实验前10天左右播种水稻种子，在3-4叶期，剪取1.2 g幼叶。放入研钵，在液氮中研磨成粉末状，移入10 mL离心管。加入4 mol/L异硫氰酸胍 4 mL 苯酚 3 mL 2 mol/L NaAc (pH 4.8) 0.3 mL 氯仿 0.6 mL混匀，冰浴放置30 min。 2. 4，8000 r/min，离心13 min。 3. 弃沉

17、淀，取上清至另一干净无菌离心管中。 4. 加入2倍体积无水乙醇，-70，0.5 h。 5. 4，8000 r/min，离心13 min。 6. 弃上清，在沉淀中加入1 mL 4 mol/L LiCl，使其溶解。 7. 移入1.5 mL离心管中，冰浴2 h。 8. 4，13000 r/min，离心15 min。 9. 弃上清，在沉淀中加入400 uL DEPC水，再加入400 uL氯仿，混匀。 10. 4，13000 r/min，离心6 min。 11. 取上清,并加入1/10体积3 mol/L NaAc（pH 5.0），2倍体积无水乙醇，-20放置30 min。 12. 4，13000 r/m

18、in，离心20 min。 13. 将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次。 14. 将沉淀RNA室温下稍干燥。15. 加30 uL DEPC水溶解，-70保存。（二）总RNA的提取（方案二） 利用TRIzol提取液抽提RNA，具体步骤如下：1. 取幼叶约250 mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5 ml离心管；2. 加入1 ml TRIZOL提取液震荡摇匀；3. 室温放置5 min后，加入0.5 ml的氯仿，剧烈摇动离心管5 min；4. 在8条件下，12000 rpm离心15 min；5. 溶液分为两层，下层为酚氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管， 加入0.5 ml异丙醇在1530条件下

19、，沉淀10 min；6. 然后在, 28条件下，12000 rpm离心10 min，RNA沉淀管壁和底部；7. 去掉液体部分，加入1 ml 75%酒精洗2次；8. 风干后，加入25 l DEPC处理过的水溶解RNA，储藏于-80冰箱备用。（三）甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA 1配制1.2%变性琼脂糖凝胶(40 mL) 称取0.48 g,加入DEPC水25.2 mL,5X电泳缓冲液4 mL, 加热使溶解，稍冷却加入甲醛3.4 mL, 混匀，室温凝固0.5-1 h.2. RNA电泳检测样品制备 RNA2 l甲醛2.5 l甲酰胺7.5 l10MOPS2 lRNA Loading Buffer2

20、l灭菌的DEPC 水4 l混合液轻轻混匀并离心，放于65下温育 5 min后，置于冰上。3. 电泳检测将1.2%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1MOPS电泳缓冲液，覆盖凝胶约1 mm。将RNA样品加到凝胶点样孔中，在5 V/cm条件下电泳30 min，然后在EB中染色15-20 min，在紫外灯下观察提取的RNA的质量。五、注意事项1在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。2RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手套。思考题：1. 实验中所用到的各试剂的作用是什么? 焦碳酸二乙酯(DEPC), 吗啉代丙

21、烷磺酸(MOPS), 异硫氰酸胍, 醋酸钠(NaAc), 氯仿, 苯酚, 甲醛, 乙醇, 乙二胺四乙酸(EDTA), 异丙醇动植物组织mRNA提取实验方法一、材料 水稻叶片或小鼠肝组织。 二、设备 研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。三、试剂 1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 3、1层析柱加样缓冲液；20mmol/L TrisCl(p

22、H7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。4、洗脱缓冲液：10mmol/L TrisCl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。四、操作步骤 （一）动植物总RNA提取-Trizol法 Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml

23、Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。 3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。 4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4下7500g离心5分钟。5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55-60水溶 10分钟。RN

24、A可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70。注意 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。 2、加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4保存一周，-20保存一年。（二）mRNA提取 由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。 1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。 2、将悬浮液装入灭菌

25、的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。 3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。4、将（一）中提取的RNA液于65温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。 6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。 7、加入1/10体积的3M

26、NaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -2030分钟。 8、4下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4下12000g离心5分钟。9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。 10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70）。 注意 1、mRNA在70%乙醇中-70可保存一年以上。 2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。RNA

27、提取流程RNA（total RNA）和信使RNA(mRNA)的抽提RNA的提取 RNA和无RNA酶的环境原核生物能产生功能上截然不同的三种RNA, 信使RNA(mRNA),核糖体RNA (rRNA),转运RNA(tRNA).而真核生物则能产生四种,还有一种为真核生物所持有的小RNA.mRNA是由基因转录而来的,它运送编码蛋白所需的信息. 由于mRNA代表了基因表达的水平,因此mRNA的分离,定量和检测极为重要. 应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍.RNA存在于从简单的逆转录病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中.由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA,因此,RNA的分离通常

28、是决定实验结果质量的第一步,也是关键的一步.提取RNA 过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤RNA分离的实用方法既有简单直接的方法(如分离rRNA和tRNA),也有困难和涉及复杂步骤的方法(如分离mRNA).在无细胞体系中克隆基因的体外转录非常有用,它可以产生足量的同源RNA分子用作探针或模板以识别和测定表达基因的量,或用于RNA的生化研究,处理RNA样品时必需仔细小心,其程度取决于样品的用途和来源.由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏,固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要.对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要.方案:工作区域应与进行普通微生物实

29、验的区域分离好,特别是那些用于细菌接种,培养基和试剂配制的区域,那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行DNA的制备和操作.通常认为这些区域富含RNA酶.如有可能,使用标有无RNA酶的商品试管,吸头,溶液和水.通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶,3)双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC(焦碳酸二乙酯)进行处理:每100mL溶液或水中加入0.1mL DEPC原液,放在摇床上充分混匀并在37下作用数小时.然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活.4)用分子级的试剂和DEPC处理过的水配制的溶液通常没有RNA酶.5)分离RNA以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在30

30、0 烘烤4h以灭活核酶.如有可能,将其他设备也灭菌处理. 从组织中提取RNA则要注意:动物器官的解剖器械 存放组织块的玻璃器皿 冻存组织块所用的器皿组织器官的冲洗液人汗含有RNA酶,故在所有步骤中均应戴手套并经常更换. 记住我们的周围环境含有大量的微生物和气雾,它们来自吸液操作或来自我们自己的呼吸.这些可能造成RNA酶的污染一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA酶.细菌比哺乳动物细胞中有更多的RNA酶.因此从这些细胞中制备RNA应采取更严格的预防措施.分离后的RNA通过琼脂糖凝胶电泳再经溴化乙锭染色后便可检查其是否完整.rRNA(18s和28s) 条带模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解.一步法分离RNA应用从组织或细胞中分离细胞的总RNA 从液体样品中分离RNA TRI REAGENT (Tripure) 是一种用于RNA 分离的商品溶液.该法源于chomc- zynski 的RNA分离一步法.它更便于使用并且结果更加可靠.对于来源有限的样品,我们推荐使用这种试剂.这种试剂能从同一样品中同时分离RNA, DNA,蛋白质. 方案 .用l mL Tripure/50-100mg (组织)匀浆组织样品.对于细胞,每10cm2面积(贴壁的单层细胞)或每10