细菌室操作手册.docx

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细菌室操作手册

临床细菌检验工作的基本要求和技术

一、对临床细菌检验人员的要求

1．负责鉴定及签发报告的主管技术人员应通晓诊断细菌学的全面知识。

2．一般细菌室工作人员均应具备细菌传染、消毒、灭菌的知识。

3．通晓细菌室守则，并严格遵守。

4．负责人应不断更新知识，了解细菌学检验的新进展。

5．定期或随时与临床医师联系，主动参与临床病例讨论，了解病情及治疗情况，达到细菌检验与临床的密切联系。

6．工作人员应定期进行健康体检及必要的预防接种，增强自身抵抗能力。

二、工作人员守则

在细菌室工作人员应注意，既不要给室内带来污染，也不要被室内的微生物感染。

工作人员必须遵守以下规则：

1．穿专用的工作衣、帽入室；必要时应戴口罩。

2．不允许无关人员进入实验室。

3．室内禁止饮食、吸烟、闲谈等非专业活动。

4．养成在室内手不触及口、脸、头发及躯体的习惯。

5．操作中不可说话，以免口中飞沫污染标本。

6．每次完成工作和离开实验室前，应用肥皂洗手，接触了致病菌类，须用消毒剂消毒手。

7．个人物品不许带入室内。

8．当工作环境被细菌培养物污染，必须用适当的强消毒液泼撒覆盖污染物，并报告主管人员采取必要的措施。

9．工作人员被细菌培养物污染，应用弱或中等消毒剂清洗，必要时应给予药物治疗，并向主管负责人报告，进一步采用特殊措施。

基本染色方法

染色的第一步是制作涂片。

菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布。

菌落涂片时，先取生理盐水1滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。

涂片时必须注意应轻轻操作。

猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。

制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。

将固定后的涂片进行染色。

一、革兰染色

本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。

染色结果将细菌分为革兰阳性（紫色）和革兰阴性（红色）两类。

试剂

1.结晶紫溶液

A液：

结晶紫2g

95％乙醇20ml

B液：

草酸铵0.8g

蒸馏水80ml

需在用前24h将A液、B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。

2．碘液

碘1g

碘化钾2g

蒸馏水300ml

碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解。

最后补足水量。

也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。

3．脱色液：

95％乙醇。

4．复染液

A.贮存液：

沙黄2.5g

95％乙醇100ml

B.应用液：

A液10ml

蒸馏水90ml

染色方法：

1．涂片经火焰固定，加结晶紫液染1min，清水冲去染液。

2．加碘液染lmin，水洗。

3．加脱色液，不时摇动约10～30s，至无紫色脱落为止，水洗。

4．加复染液，染30s，水洗。

5．干后镜检。

二、抗酸染色

抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。

染厚涂片时，须掌握复染色时间。

如果背景过深，影响镜检。

奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象，视野中有些菌细胞阳性，另外一些则阴性；有时同一个菌体上，红色的深浅亦有不同，观察时应予注意。

抗酸染色有两种常用方法：

①碱性复红法又称萋纳（Ziehl—Neelsen）法。

②荧光染料金胺O法（也称金胺O-罗丹明B法）。

（一）碱性复红染色法

试剂

1．萋纳石炭酸复红溶液

碱性复红乙醇饱和溶液10ml

5％石炭酸溶液90ml

2．脱色剂*

浓盐酸3ml

95％乙醇97ml

3．复染液（吕弗勒美蓝液）

美蓝乙醇饱和溶液30ml

10％氢氧化钾0.1ml

蒸馏水100ml

染色方法

1．涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。

染5min（若染色奴卡菌需要加长时间），水洗。

2．加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗。

3．加复染液，染0.5～lmin，水洗。

4．干后镜检。

分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。

*：

奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用2％硫酸水溶液。

（二）金胺O-罗丹明B染色法

染剂

1．罗丹明B液：

罗丹明B0.1g加蒸馏水100ml；

2．0.1％金胺O液：

金胺O0.1g加蒸馏水95ml，再加入纯石炭酸5ml，混匀；

3．3％盐酸酒精；

4．稀释美蓝液：

吕弗勒美蓝液10ml，加蒸馏水90ml，混匀。

方法

1．涂片固定后加第1液30～90s。

2．弃去第1液后加第2液染15min。

3．用第3液脱色1～2min，水洗。

4．滴加第4液染30s，水洗，待干，荧光抗酸菌在暗背景中呈现金黄色荧光。

三、鞭毛染色

用于观察菌体上有无鞭毛、鞭毛在菌体上的位置以及鞭毛的数量。

在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。

鞭毛染色可以直接从平板上挑选菌落，或从斜面上刮菌苔涂片即可，但必须注意动作尽量轻，以免鞭毛从菌体上脱落。

菌落应是

生长在营养较好的琼脂平板（如血平板、营养琼脂）上的过夜培养物。

不可采用有抑制剂的选择性培养基，如中国蓝、麦康凯、SS琼脂等。

观察鞭毛时，应耐心寻找整个涂片上的菌细胞，因为并不是涂片上每个细菌细胞上的鞭毛特性及数量都一样，应以鞭毛数量最多的菌细胞为准。

鞭毛染色（改良Ryu法）

试剂

A液：

5％石炭酸10ml

鞣酸2g

饱和硫酸铝钾液10ml

B液：

结晶紫酒精饱和液

应用液：

A液10份，B液1份，混合，室温存放。

染色方法

1．玻片的处理：

要求用新的载玻片。

用前须在95％酒精中浸泡24小时以上。

用时从酒精中取出，以干净纱布擦干后使用。

2．在玻片上滴蒸馏水两滴。

一张玻片上可同时制2个涂片。

3．用接种环挑取血平板上菌落少许，将细菌点在玻片上的蒸馏水滴的顶部。

一般只需点一下，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。

4．玻片置室温自然干燥。

5．滴加染液于玻片上，染色。

6．约10～15min后，用蒸馏水缓慢冲去染液。

冲洗时应避免使染液表面的金属光泽液膜滞留在玻片上，影响镜检。

7．玻片自然干燥后，镜检时应从涂片的边缘开始，逐渐移向中心。

寻找细菌较少的视野，鞭毛容易观察。

细菌密集的地方，鞭毛被菌体挡住，不易观察。

四、异染颗粒染色

用于白喉棒状杆菌染色，异染颗粒可明显地被显示出来。

标本直接涂片或细菌涂片均可用改良阿伯特（Albert）法染色来观察异染颗粒。

试剂

甲液：

甲苯胺蓝0.15g

孔雀绿0.2g

冰醋酸1ml

95％乙醇2ml

蒸馏水100ml

将各染料先溶于乙醇，然后加入水与冰醋酸的混合液中，充分混匀。

静置24h后过滤备用。

乙液：

碘2g

碘化钾3g

蒸馏水300ml

先将碘化钾加少许蒸馏水（约2m1），充分振摇，待完全溶解，再加入碘，使完全溶解后，加蒸馏水至300ml。

染色方法

1.涂片经火焰固定，加甲液，染3～5min。

水洗。

2．滴加乙液，染lmin。

水洗。

3．干后镜检，菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。

五、墨汁荚膜染色

用于观察菌体有无荚膜结构，借此鉴定某些菌，如新型隐球菌。

传统的方法是用印度墨汁，但目前国内无售。

常规工作可以用墨汁或墨水代替，但应注意颗粒不能太粗，否则影响观察结果。

有人用5％黑色素（nigrosin）水溶液做染料，效果较好。

试剂

印度墨汁或5％黑色素水溶液。

染色方法

将标本与1滴染色液在载玻片上混合，加上盖玻片，轻轻压一下，使标本混合液变薄。

在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞。

找到后，转换高倍镜确认。

葡萄球菌属

一、常规鉴定

葡萄球菌的鉴定：

首先须与其他的革兰阳性球菌鉴别，然后再作属内种的鉴定。

（一）与其他革兰阳性球菌鉴别

临床标本中常见到的革兰阳性球菌，除葡萄球菌属外，还有微球菌属和气球菌属等。

所以，在菌属内菌种鉴定之前，首先与这几属细菌鉴别（见表）。

表葡萄球菌属与其他革兰阳性球菌的鉴别a

菌名

特征b

严格需氧

四联状排列

紧粘琼脂

动力

5%NaCl琼脂

触酶c

氧化酶d

（改良法）

厌氧下葡萄糖产酸e

耐药

杆菌肽f

0.04U/片

呋喃唑酮g

100ug/片

葡萄球菌属

-b

气球菌属

（+）

动性球菌属

口腔球菌属

土

微球菌属

注：

a．葡萄球菌属、动性球菌属、口腔球菌属、微球菌属皆隶于微球菌科。

b．符号：

+，90％以上阳性；土，90％以上弱阳性；一，90％以上阴性；d，1l％一89％阳性；ND，未试验；（）迟缓反应。

c．在某些菌种中出现触酶弱阳性或假阳性反应，是由于在培养中补充血红素，活化某些菌株触酶活性。

d．Faller和Schleifer改良氧化酶试验为检出细胞色素C。

e．标准的氧化—发酵试验。

f．+，耐药或无抑菌环，微球菌、口腔球菌、气球菌敏感，抑菌环10～25mm。

g．十，耐药或抑菌环≤9mm；一，敏感，抑菌环15～35mm。

h．表皮葡萄球菌有些菌株生长时紧固地粘附于琼脂表面，此种特性与细菌产生浓的粘液相关。

1．与链球菌鉴别：

葡萄球菌与链球菌的区别如下：

在镜下，葡萄球菌以单、双、葡萄状排列，菌体呈圆形。

链球菌以成单、双、链状排列，菌体形态为圆形或椭圆形。

葡萄球菌触酶试验阳性，链球菌则阴性。

2．与微球菌的鉴别：

实验室常用的鉴别依据是形态和发酵葡萄糖产酸。

在镜下，葡萄球菌以葡萄状排列为主，菌体较小；微球菌以四联排列为主，且菌体较大。

葡萄球菌发酵葡萄糖产酸试验阳性，微球菌阴性。

此外杆菌肽、呋喃唑酮敏感试验有利区别两属菌种。

（二）临床8种常见葡萄球菌的鉴别

目前葡萄球菌已被命名有27个种。

临床标本中最常见有意义菌种是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、里昂葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌和猪葡萄球菌。

首先用凝固酶试验将其分为凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌（包括中间和猪葡萄球菌）和凝固酶阴性的其他葡萄球菌，然后用新生霉素敏感试验。

推断新生霉素耐药为腐生葡萄球菌。

下表列出了关键鉴定试验来区别上述8个菌。

二、试验方法

（一）触酶试验（过氧化氢酶试验）

试剂：

3％H2O2溶液，置棕色瓶内于4℃阴暗处保存。

方法：

先挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，然后滴加3％过氧化氢溶液1～2滴。

静置之，lmin内产生大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性。

表有临床意义的8种葡萄球菌关键性鉴定

菌种

试验

菌落色素

葡萄球菌凝固酶

凝聚因子

耐热D

A酶

碱性磷酸酶

吡咯烷酮酶

鸟氨酸脱羧酶

脲

酶

β半乳糖苷酶

产生V

新生霉素耐药

多粘菌素B耐药

需氧下产气

蕈

糖

甘露醇

甘露糖

松二糖

|木糖

纤维二糖

麦芽糖

蔗糖

金黄色葡萄球菌

表皮葡萄球菌

（d）

（+）

（d）

溶血葡萄球菌

（d）

里昂葡萄球菌

（+）

（d）

施氏葡萄球菌

（+）

腐生葡萄球菌

中间型葡萄球

（d）

猪葡萄球菌菌

注意点：

1．注意过氧化氢为3％，应用30％浓的H2O2，用时稀释10倍。

2．不应在培养基上做试验。

3．每次试验时，应以阳性和阴性菌株做对照。

（二）葡萄球菌凝固酶和凝聚因子试验

葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。

试管法凝固酶试验称为葡萄球菌凝固酶，玻片法为检测凝聚因子。

1．凝聚因子试验：

取1滴蒸馏水于洁净的玻片上，用接种环挑取待检菌一环置于蒸馏水中，制成浓的菌悬液，无自凝现象。

然后加一环家兔血浆混合，10s内观察结果，出现明显细菌凝块为阳性，否则为阴性。

如超过10s可出现假阳性，有10％一15％金黄色葡萄球菌呈假阴性，因此必须用试管法验证凝聚因子试验。

操作过程中的注意点：

（1）10s内观察结果。

（2）必须制备浓厚的均匀菌悬液。

（3）用EDTA抗凝的兔血浆为最好。

（4）加血浆后不要再混搅，以免细菌凝块分散变小。

（5）生长在高盐培养基上的菌落可出现自凝或假阳性。

2．葡萄球菌凝固酶试验：

用生理盐水将血浆4倍稀释，取0.5ml。

然后挑取3～5个菌落于稀释血浆中，成浓菌悬液。

置37℃水浴，3～4h后读取结果，凝固者为阳性。

若阴性，继续观察到24h，不凝固者为阴性。

试验应同时作阳性、阴性对照。

试管法葡萄球菌凝固酶试验阳性者，应见到明显的纤维蛋白凝胶块，出现羊毛状或纤维状沉淀物并非真正凝固，应判为阴性。

中间型葡萄球菌、猪葡萄球菌需要较长时间孵育，才可出现阳性。

凝固酶试验应考虑下述情况：

1某些金黄色葡萄球菌产生溶纤维蛋白酶，溶解纤维蛋白凝块。

2所用血浆缺乏纤维蛋白原。

3试验菌株不纯。

（三）碳水化合物氧化、发酵试验（OF试验）

葡萄球菌的OF试验应使用专用配方，不可与非发酵菌用的OF管混用。

培养基用的指示剂必须用水配制，因为个别菌株能分解乙醇产酸。

培养基：

酵母浸膏0.1g

胰胨1g

牛肉浸液l00ml

0.2％溴甲酚紫溶液lml

校正pH7.0，按常规方法加入1％的碳水化合物，分装，灭菌，备用。

溴甲酚紫的配制：

溴甲酚紫lOOmg，0.01mol的NaOH18.5ml，加水至50ml。

方法：

挑取待检菌落，接种于2支O-F培养基管中，发酵管加灭菌液体石蜡油约lcm深，氧化管不加。

35℃孵育24h后观察，培养基变黄即产酸。

结果判定如下：

代谢型

加石蜡

不加石蜡

发酵

产酸

氧化

不变色

产酸

（四）新生霉素耐药试验

方法：

挑取待检菌菌落数个，制成相当0.5号麦氏管（McFarland）浓度菌液，棉拭子浸透，挤去多余液，均匀涂在M—H平板上，贴上含5ug／片的新生霉素纸片，35℃孵育16～20h，抑菌环直径≤16mm为阳性（耐药）。

试验时应以金黄色葡萄球菌ATCC25923做阴性（敏感）对照，以确认纸片是否有效。

（五）氧化酶（改良法）试验

试剂：

四甲基对苯二胺（TMPD）（Tetramethylphenylenediamine）6.0g

二甲基亚砜（DMSO）（Dimethysulfoxide）100.0ml

溶解TMPD于DMSO中，置于避光玻塞瓶中，可在室温中保留几个星期。

方法：

被检菌株移种于7％羊血琼脂上，30℃需氧条件下孵育15～18h，刮取菌落涂布于无色滤纸片上，加1滴上述试剂，阳性者在2min内呈深蓝色。

若被测菌株移种在蛋白胨酵母浸出液琼脂上，至少孵育3天以上，才可检测，阳性反应5～10min出现。

链球菌属

一、常规鉴定

（一）属间鉴别

临床标本检到革兰阳性球菌、触酶阴性，除链球菌属外，尚有6个菌属，是：

肠球菌属Enterococcus

乳球菌属Lactococcus

无色藻菌属Leuconostoc

平面球菌属Pediococcus

孪生球菌属Gemella

气球菌属Aerococcus

在鉴别上述菌属时，关键是：

①革兰染色。

上述菌属的革兰染色特性相似，若从琼脂平板上涂片染色，无色藻菌属中某些菌种的形态呈现球杆形、杆形，容易与乳杆菌属菌种相混淆，后者触酶亦阴性。

若生长在盐肉汤涂片，最容易出现不一致性。

②触酶试验。

目的是与葡萄球菌属和口腔球菌属鉴别。

属间鉴别参见下表。

表触酶阴性或弱阳性的革兰阳性球菌的鉴别特征

菌属

试验a

形态

万古霉素

30ug/片

葡萄糖产气

PYR

LAP

6.5％NaCl

45℃生长

10℃生长

链状

成对

四联

成簇

链球菌属

-b

肠球菌属

乳球菌属

-b

气球菌属

孪生球菌属

平面球菌属

无色藻菌属

注：

a．S，敏感；R，耐药；+，阳性反应；一，阴性反应；V，反应不定（有些菌株+，另外菌株-）

b．化脓链球菌和L-garviae可阳性。

c．偶尔例外。

（二）属内鉴别

链球菌属内鉴别，首先观察在血液琼脂平板上的溶血环，是β溶血型，或非β溶血型，参照这二类溶血型菌种的鉴别。

1．β溶血链球菌的鉴定：

β溶血型链球菌的鉴定都是检测特异多糖抗原称为链球菌群多糖抗原来分群，可采用商业性试剂盒，当前血清学诊断方法尚未普及之前，传统的对β溶血链球菌的鉴别仍是需要的。

A、B、D、G群细菌，一般可用杆菌肽、CAMP、胆汁七叶苷及PYR、VP等试验区别（见表）。

表β溶血链球菌的鉴别特征

血清学分群

种名

吡咯烷酮酶

CAMP

七叶苷

杆菌肽敏感

蕈糖

黄色素

山梨醇

化脓链球菌

无乳链球菌

马链球菌

似马链球菌

兽疫链球菌

LancefieedG群

A,C,F,G或未分群

咽峡炎链球菌

注：

a．+，阳性；一，阴性；d，不同菌株。

b．有人认为咽峡炎链球菌与米勒链球菌是同义词。

2．非β溶血链球菌鉴别

肺炎链球菌的鉴定：

生长在血琼脂平板上的菌落细小，圆形，表面光滑、灰白色、边缘整齐，半透明，开始扁平以后中心塌陷，呈脐窝状。

菌体呈矛头状成双排列。

该菌对Optochin敏感和胆汁溶菌试验阳性。

3．牛链球菌的鉴定：

具有D群多糖抗原，6.5％NaCl不生长，PYR阴性，胆汁七叶苷阳性，与其他草绿色链球菌鉴别见下表。

表非β溶血型链球菌的鉴别

菌种／群

试验

Optochin敏感

胆汁溶菌

胆汁

七叶苷

6.5％NaCl肉汤

吡咯烷酮酶

卫星现象

CAMP

血清群

肺炎链球菌

牛链球菌

无乳链球菌

草绿色链球菌

-b

营养变异链球菌

注：

a.+，阳性反应；-，阴性反应；土，有些菌株阳性，另外菌株阴性。

b.偶见例外。

营养变异链球菌是草绿色链球菌的营养变种，在普通肉汤或琼脂平板上生长不良（通常发现在血液培养瓶中）。

若培养基中加入吡哆醛或做“卫星现象”试验容易被发现，有二个种，即缺陷链球菌S．defectivus，毗邻链球菌S.adjacens。

草绿色链球菌的鉴定：

革兰阳性球菌，触酶阴性，非β溶血、胆汁溶菌阴性，Optochin阴性，不存在B、D群抗原，6.5％NaCl肉汤不生长，PYR阴性，10℃，45℃不生长，胆汁七叶苷阴性，万古霉素敏感。

该类链球菌种较多，目前临床仅鉴定到群，参见下表。

表草绿色链球菌的鉴定

种群

试验a

甘露醇

山梨醇

精氨酸

七叶苷

脲酶

变异链球菌群c

唾液链球菌群

土

血液链球菌群

-b

缓症链球菌群

咽峡炎链球菌群

-b

注：

a．+，阳性反应；一，阴性反应；土，有些菌株阳性而另外菌株阴性。

b．偶见例外。

c．变异链球菌群包括：

仓鼠、道尼、野鼠，猕猴、鼠亲缘链球菌，唾液链球菌群包括：

肠、前腔链球菌，血液链球菌群包括：

戈登、H．W群链球菌，缓症链球菌群包括：

温和、口腔、血链球菌生物'型链球菌，咽峡炎链球菌群包括：

中间、星座、米勒链球菌。

咽峡炎链球菌是未分群的链球菌，被认为是“米勒链球菌”的同义词，有β溶血的菌种，属于A、C、F、G群，也有非β溶血菌种，在A、C、G群链球菌中有小菌落型菌株。

非β溶血，带有相同的Lancefield抗原，属于草绿色链球菌（“米勒”群）细菌，有3个种；米勒链球菌、中间链球菌、星座链球菌。

（三）与链球菌属相关菌属的描述

1．乳球菌属：

原链球菌属中乳链球菌现成为乳球菌属。

乳球菌和乳脂乳球菌在制酪和粮食工业生产中使用。

临床标本中也常见到。

该属菌种与肠球菌相似，唯一不同点是45℃不生长。

2．孪生球菌属：

原麻疹链球菌现转入孪生球菌属，另一种是溶血孪生球菌。

该属菌种曾从临床标本中检到，见于临床感染如心内膜炎。

其特点是生长缓慢，可能被误认为营养缺陷链球菌，应用“卫星现象”试验区别开来。

菌种鉴定，参照下表所示。

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