叶酸靶向化疗.docx
《叶酸靶向化疗.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《叶酸靶向化疗.docx（10页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
叶酸靶向化疗
叶酸介导的大分子抗癌治疗药物的传递
摘要：
叶酸受体是肿瘤特异性药物传递的有效靶点，主要原因是：
（1）它可以调节许多人类癌细胞，包括卵巢、脑、肾、乳腺、髓细胞和肺的恶性肿瘤细胞，
（2）在正常组织中被叶酸受体识别，由于其在极化上皮细胞的顶端（外面）膜的位置，可以严重限制其在正常组织中的表达，（3）叶酸受体密度随着癌症恶化的阶段/分级增加。
因此，最难用经典方法治疗的癌症可能在叶酸靶向治疗中是最容易的。
利用这些叶酸受体表达的特点，叶酸已被链接到两个低分子量和高分子配合物上，用于靶向分子靶向恶性细胞的研究。
叶酸与大分子的结合，在体外几乎所有的情况下都能增强其对叶酸受体表达癌细胞的传递作用。
然而，叶酸介导的分子靶向在体内只产生了混合的结果，很大程度上是因为实体肿瘤分子的渗透问题。
尽管如此，叶酸靶向性显著改善了一种以高分子为基础的治疗的例子也确实存在，这导致在许多情况下，完全治愈了确定的肿瘤细胞。
这篇综述讲述了一个简短的叶酸靶向大分子疗法的机械背景，然后总结了各大技术在应用中的优缺点。
1.介绍
蛋白质、基因治疗载体、脂质体包裹药物、核酸适配体、反义寡核苷酸、药物衍生的生物降解的聚合物对癌症治疗都显示极大的潜力，主要是因为其特异性的改进、作用时间的延长、或更传统的化疗药物效力的增强。
然而，不同于低分子量的药物，大分子药物往往会遇到显着的渗透性障碍，从而限制上述理想的性能的实现。
因此，尽管肿瘤的选择性往往是由于肿瘤的高度差形成的血管和随之而来的被动积累的大分子在恶性肿块{称为增强渗透和滞留（EPR）效应}，但肿瘤细胞膜仍然可以构成一个强大的屏障，这些大分子必须进入他们的靶细胞，从而导致细胞死亡。
如果肿瘤淋巴管引流不发达，瘤内压力的增加也可以限制大分子药物在肿瘤部位深部的药物传递。
为了克服这些限制，许多人采用已经采用癌细胞特异性配体作为靶向部分，在肿瘤组织提高大分子传递和治疗。
这篇综述的目的是总结在开发维生素、叶酸作为配体的选择性靶向和交付的大分子药物进入肿瘤细胞的进展。
在几种代谢途径中，叶酸是一种碳转移反应所需的维生素，因为叶酸在核苷酸的生物合成中是必不可少的，在增殖细胞中消耗大量的维生素。
正常细胞跨膜运输的生理叶酸使用两种膜相关的蛋白质:
还原叶酸载体或叶酸受体（FR）。
研究发现前者在几乎所有细胞中负责生理叶酸摄取的主要途径。
后者主要出现在极化上皮细胞和活化的巨噬细胞中，并且优先结合和内化通过氧化叶酸受体介导的内吞作用。
虽然低浓度的还原叶酸载体可能足以供应大部分正常细胞的叶酸需求，但FR经常在肿瘤细胞中高表达，当供应有限时，使恶性细胞成功地争夺维生素。
尽管FR在许多癌细胞中的过度表达可以很明显地识别受体的一个潜在靶点和抗体介导的癌症的治疗，但FR也可以进一步作为一个合格的肿瘤特异性的靶点，因为它通常只有在恶性转化后，静脉注射才有用。
那是因为FR选择性地表达在某些上皮细胞顶膜的表面（即，膜面体腔），它对血生试剂来说不可用，因此，阻碍了FR-介导的治疗药物在等离子体中的传递。
然而，在上皮细胞转化时，细胞极性丧失，FR成为靶向药物进入循环。
这可能是因为这种双重机制的肿瘤特异性，受体的天然配体、叶酸已成为一种靶向附着药物传递到癌细胞中的有效分子。
叶酸已经因其高亲和力、（KD∼10−10M），免疫原性低、易修改、体积小（分子量：
441.4），在储存过程中稳定性好、兼容多种有机和水性溶剂、成本低、随时可用等优点，吸引力越来越强。
到目前为止，许多化学和生物治疗药物已成功与叶酸连接，其中大部分在体内和体外都表现出显着增强了FR-阳性肿瘤细胞的传递。
在下面的叶酸靶向高分子抗癌药物的总结中，我们不仅讲述大分子靶向识别领域中的成功事例，而且指出了只有超越之前的各种靶向叶酸的应用才可以充分发挥其潜力所存在的缺陷。
2.基本知识
2.1.叶酸受体的结构与功能
人类FR家族（Mr∼38kDa）包括其三个特征的亚型（FR-α、FR-β和γ/γ′），他们的氨基酸序列70–80%相同，但表达模式不同。
FR-α和FR-β由于其附着的糖基磷脂酰肌醇（GPI）膜锚，都是膜相关蛋白。
然而，FR-α区别于FR-β的是其对循环叶酸辅酶、（6S）-5-甲基四氢叶酸（5-CH3H4叶酸）具有高亲和力、也可通过减少叶酸辅酶的相对定向来区分。
FR-α也可以高亲和力（KD∼0.1nm）与叶酸和生理叶酸结合，亲和力明显高于FR-β（KD∼1nm）。
FR-γ和截短形式的蛋白FR-γ′缺乏GPI锚，并且在人类FR可溶性形式中几乎检测不到组成型分泌的数量。
分泌的FR-γ与叶酸的结合亲和力据报道是∼0.4nm。
最近，一个基因编码了一种可能的受体的第四亚型基因（FR-δ），并且在人类基因组的未知区域被鉴定。
然而，FR-δ无论在成人还是胎儿组织中的表达分析表明，并没有可检测的蛋白质水平，这说明有一种可能性的瞬时表达模式，剪接变体或FR假基因。
2.2.在正常和恶性细胞中叶酸受体的表达
各亚型的表达（α，β，γ/γ′）都具有组织特异性和分化依赖性。
随着一些正常组织的异常（肾，胎盘，和脉络丛），FR-α在正常上皮细胞中以低水平存在，但在上皮来源的恶性肿瘤组织中却大大提升，尤其是卵巢、子宫、子宫内膜、脑、肾、头部和颈部、间皮中。
3H-叶酸与粗膜制剂结合后测定（图1），在相同来源的正常和恶性组织中的FR-α的表达差异是相当惊人的，上调水平的差距接近两个数量级。
在诊断为上皮性卵巢癌患者中，FR-α过表达的程度与较高的组织学分级和更高级的癌细胞阶段相关，这表明快速生长的肿瘤细胞可能需要高的叶酸量。
另外一个关于FR表达和抵抗程度之间的标准化疗方案也有报道。
那就是，幸存于标准化学疗法的肿瘤细胞通常具有更高的FR水平。
可以想象，更高阶段、更高级别、和化疗耐药性的癌症，即标准程序最难治疗的肿瘤，就包括最容易被叶酸相关药物靶向的癌症。
FR-β，最初在大鼠胎盘中发现，构成型FR最常用的表达在造血细胞和非上皮细胞，如脾脏和胸腺。
FR-β也在一些非上皮源性的恶性肿瘤中浓度上升，包括髓细胞性白血病和肉瘤。
重要的是，虽然FR-β可以在造血干/祖细胞和髓系细胞分化的细胞中检测到，但是它在这些细胞中是没有活性的，即，一种与叶酸没有亲和力的形态。
事实上，一个功能性的FR-β到目前只能在有活性的（但不是休眠的）巨噬细胞中检测到。
FR-γ和γ′也被认为是与造血组织有特异性，特别是淋巴细胞，并只在非常低的水平表示达。
分泌形式的FR可作为某些造血系统恶性肿瘤的潜在血清标志物。
因为相对高水平的FR可以在肾近端小管和脑脉络丛中测量，所以会出现的问题就是靶向FR治疗药物可能对这两种组织产生毒性。
然而，如上所述，免疫组织化学技术和125I-叶酸放射自显影展现了这些正常上皮细胞中FR分布的高度极化模式。
例如，在近端小管中，FR仅在顶端/腔或尿面对肾小管细胞的表面上可以观察到，这里可能有助于尿中叶酸的重吸收。
因此，叶酸靶向大分子应该只有在个人患有蛋白尿或者其他肾功能障碍时才能遇到肾FR。
同样地，FRS在大脑似乎集中在大脑边缘的血脑屏障，在那里他们的功能是保留的维生素在脑脊液中，正如预期的那样，通过免疫组化染色的FR弥漫在整个肿瘤细胞表面，从而使恶性脉络丛肿瘤细胞失去偏振分布模式。
基于这些及相关的观察，目前还没有证据表明FR表达水平升高会损伤正常组织。
2.3.通过受体介导的内吞作用摄取叶酸偶联药物
虽然对叶酸的FR转运到细胞仍然没有确切的机制，但很确定的是叶酸偶联物通过受体介导的内吞作用不被哺乳动物细胞损伤。
然而，也有关于GPI锚定的FR在内化和转运过程中涉及的与这冲突的机制或途径。
因此，早期的研究表明，FR不与网格蛋白-内陷小窝相关，而是在细胞表面组织形成亚微米结构域。
这些研究也表明，GPI锚可能负责介导受体聚类与称为小窝的瓶形膜结构相联系。
并进一步提出FR的内化是通过被称为摄液作用过程的小窝的挤压来完成。
然而，后来的研究表明，GPI锚定的FR大多不发生在小窝，并且受体可能是弥漫性分布在质膜上，直到叶酸屏蔽。
更多最近的研究结果似乎表明，FR是由其GPI锚定在“脂筏”或膜受体丰富的复合物上，并且这些亚结构域（直径<70nm）并没有小窝，而富含鞘脂和胆固醇。
不管进入的路线，很明显地是生理叶酸跨越细胞膜进入细胞质是通过一种FR介导的专门的内吞途径来完成。
与在癌细胞表面的FR结合后，叶酸偶联物，无论大小怎样，都可以内化到细胞内称为内涵体。
内涵体中的叶酸偶联物的PH值在4.3和6.9之间（更多的是在5.0），这一过程称为内涵体酸化。
由于叶酸与其受体结合具有PH依赖性，在PH<5时急剧下降，因此可以预测，一些的叶酸偶联物将与其受体分离并保持在细胞内。
然而，叶酸共轭卸载效率的直接测量表明，只有15%到20%的结合到受体上的叶酸偶联物释放到细胞中，其余的显然循环到FR的细胞表面。
相关研究也表明，叶酸偶联物内化的总数与一个细胞中FR表达的数量成正比，FR表达的癌细胞平均可以吸收叶酸偶联物的速度大约是1-2x105分子/细胞/小时。
2.4.叶酸偶联物在体内肿瘤选择性的研究
在荷瘤小鼠身上使用低分子量的叶酸药物证明了叶酸偶联物在体内的肿瘤选择性。
事实上，事实上，随着对几代以这种叶酸为基础的放射显影剂络合多种放射性核素（125I,67Ga,111In,99mTc）的研究，两种水溶性的结合物，111In--二乙三胺五乙酸（DTPA）-叶酸和99mTc-叶酸偶联物（EC20，细胞内含物，西拉法叶，美国），在人体临床试验中是合格的。
在疑似卵巢癌的妇女身上，静脉注射111In-DTPA–叶酸后发现主要集中在腹部肿块，这些肿块随后被确诊为恶性细胞。
显像剂的准确性和检测灵敏度是非常有效的，因为在良性肿瘤患者中，几乎没有摄取量。
此外，除了恶性肿块，只有在肾脏和一些患者的肝脏中显示有111In-DTPA叶酸显著存在。
在肾脏的摄取量可以很快预测，因为已知的FR表达在近端小管顶膜（低分子显像剂迅速排泄到尿液中，在那里他们可以很容易地靠近肾FR）。
但在一小部分患者中肝脏的摄取预测不到，后来被证明是来自活化巨噬细胞表面的FR（即，枯否细胞），这可能会在应对某些类型的炎症刺激中有活性。
因为静息巨噬细胞不结合叶酸或叶酸偶联物，并且由于占据叶酸偶联物的激活的巨噬细胞可以被其他静止的巨噬细胞所代替，所以，在激活的巨噬细胞中，叶酸偶联物的传递可能不会构成严重的健康危害。
3.叶酸介导的大分子疗法
如图3所示，叶酸靶向在传递大分子治疗药物到癌细胞的应用可分为两类，因为药物需要细胞内释放出来发挥其细胞毒性/监管职能，FR提供了一种进入癌细胞的胞浆的配体激活的内吞途径。
属于这一类的大分子的例子包括大多数蛋白毒素、药物包封脂质体的寡核苷酸、基因治疗载体和许多其他胶体药物载体。
虽然很少有研究探讨及叶酸偶联高分子的胞内运输机制，但已经证明的是胞内释放可能不遵循游离叶酸的机制，而是取决于在其他细胞器膜分解循环过程中的某种缓慢非特异性逃避。
另一方面，由于药物不需要细胞内卸载，但能够介导细胞毒作用于靶细胞表面，FR可以作为肿瘤标志物，允许药物集中在肿瘤细胞表面。
这一类的治疗药物的例子可能包括前药活化酶和刺激或重定向对癌细胞的免疫系统的免疫治疗剂。
重要的是，细胞表面只有一小部分FR的连续循环允许有待开发的两种靶向策略。
更重要的是，由于叶酸–高分子结合物在内化后不能迅速分解，即使是最敏感的大分子的水解释放系统（例如，蛋白质和基因治疗的载体），也有可能被开发。
3.1.需要细胞内传递的药物
3.1.1.蛋白质毒素
核糖体失活蛋白如植物源性毒素、苦瓜蛋白、和衍生蛋白质、匿名外毒素，是依赖于FR-介导的内吞作用的第一大分子药物中被成功传递到FR阳性肿瘤细胞的蛋白。
由于苦瓜蛋白和匿名外毒素的重组形式缺乏细胞表面的结合结构域，它们本质上是无效的，除非连接到一个可调节其细胞内运输的配体上。
在FR表达细胞的情况下，这两种毒素的IC50从非衍生毒素的>10-5M降低到叶酸修饰毒素的<10-9M，然而，由于细胞缺乏FR，所以他们的衍生物仍然是无害的，事实上，当与FR阴性细胞类型（WI38和hs67细胞）一起培养时，叶酸偶联毒素已经对FR阳性人类癌细胞系（HeLa，KB和Caco-2细胞）表现出高度的定量和肿瘤特异性杀伤力。
叶酸–蛋白结合物的制备可用反应NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）或EDC[1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺]-激活的叶酸在蛋白质的氨基酸侧链上形成一个稳定的酰胺键来完成。
在大多数情况下，每个蛋白质有三个叶酸在不影响蛋白质的生物活性的情况下就可达到良好的FR靶向性。
然而，在某些情况下直接蛋白衍生会导致蛋白失活。
因此，Atkinson等人发现，通过氨基偶联的叶酸白树毒素中的活性减少225倍。
为了克服这种障碍，作者在白树毒素中通过糖基将植物毒素与巯基叶酸连接起来。
这样形成的蛋白产物能保持其99%的天然活性。
然而，在Leamon等人的另一项研究中，比较了二硫酰胺和由酰胺连接的假单胞菌外毒素的叶酸偶联物。
他们确定这两种结构的毒素的IC50大约为10-11，这说明表明附着在半胱氨酸或赖氨酸侧链上保留了蛋白质的全活性。
显然，显然，蛋白质偶联物的的最佳化学性可能取决于单个蛋白的特性。
维生素，叶酸的衍生物的限制条件并不难解决，而连接到原子的蝶呤环或对氨基苯甲酸基团限制了FR的结合，通过α-或γ-羧基连接的叶酸可保持与受体的亲和性。
因为这些羧基随后与蛋白质结合后容易被激活，并且由于化学性在α-或γ-羧基衍生物的区域选择性上作用很大，因此，在特定的区域与叶酸修饰的高功能蛋白质的制备不再是问题。
在这一点上，应该注意的是，γ-羧基连接时蛋白质结合物中具有较高亲和力的一种。
不幸的是，即使可以最佳结合，在体内叶酸介导的蛋白靶向蛋白的效率受被动地穿透肿瘤的蛋白质能力的限制。
一般来说，叶酸–蛋白偶联物在肿瘤组织中的富集超过相同组织被动靶向（EPR效应）的3-12倍。
由于低分子量的叶酸偶联物往往富集在FR表达癌细胞中的数量比非靶向的高100多倍，所以蛋白质靶向的障碍显然不是由于缺乏功能性的FR。
此外，由于叶酸–牛血清白蛋（BSA）–异硫氰酸荧光素（FITC）的偶联物，在卵巢癌患者中新鲜分离的未经修饰的腹水中，可以积极靶向地攻击肿瘤细胞，血清蛋白和其他生理性溶质的存在也不能说明叶酸-蛋白质吸收减少。
因此，我们认为，蛋白靶向性的肿瘤特异性较低可能反映了蛋白质到实体肿瘤的阻碍被动渗透。
在这方面，我们可想而知，第一个蛋白偶联物外渗进入到一个恶性肿块中可能与直接与毛细血管床相邻的癌细胞上的FR结合，从而阻止后续的叶酸–蛋白偶联物跨过这个“蛋白路障”渗透到肿瘤细胞中，不管什么原因，数据表明，简单的蛋白质–叶酸偶联物在一个实体瘤中不能到达每一个活跃的FR中。
虽然这个问题可以设想多个解决方案，但我们总结了一个相对简单成功的解决方案—叶酸靶向免疫疗法（见下文）。
3.1.2.药物包封脂质体
脂质体由于他们具有在单一容器中封装和传递大量未修改药物的能力，所以可作为药物传递工具。
由于前面提到的被动靶向性毛细血管（EPR）效应，静脉注射脂质体药物往往自然堆积在肿瘤组织旁边。
然而，对于主动靶向，不同类型的配体已被用于选择性地递送脂质体抗原或受体阳性的肿瘤细胞，包括抗体、去唾液酸糖蛋白、低聚糖、转铁蛋白、和各种激素类似物。
叶酸将脂质体传递到癌细胞的第一次使用是将磷脂酰乙醇胺（PE）头和叶酸通过共价键连接。
将改变后的磷脂与包封钙黄绿素合并后（∼直径为66nm），发现用叶酸包装的脂质体通过FR介导的内吞作用进入培养的KB细胞。
上述衍生磷脂间隔需求分析表明
最好的方法是用分子量为3350的聚乙二醇（PEG）空间间隔，其扩展的构象可以计算为∼250Å长。
这是假设这种长的间隔在允许叶酸渗透到细胞表明结构搜索空闲的FR是必要的。
Stephenson等人最近已审查了各种类型的叶酸栓脂质体的制备方法，并描述了加载各类药物到脂质体的程序。
通过封装抗癌药物初步证明了叶酸靶向脂质体的治疗潜力，在脂质体中的阿霉素含有0.1摩尔%的叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）、58.3摩尔%的二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）和41.6摩尔%的胆固醇。
KB细胞对叶酸–PEG–脂质体阿霉素的摄取量是45-，比常规脂质体阿霉素和游离阿霉素高1.6倍，尽管相对毒性是86-，比前两者高2.7倍。
后来Goren等人发现这比预期的毒性大很多，是因为当脂质体通过FR介导的内吞作用进入到癌细胞是一个更有效的运输阿霉素进入细胞核的途径。
在靶向和非靶向脂质体阿霉素在FR-阳性（HeLa）和FR-阴性肿瘤细胞（WI38）共培养时，癌细胞对脂质体阿霉素的特异性增强。
因此，在相同药物浓度时，Hela细胞完全被暴露于叶酸–PEG–脂质体阿霉素杀死，而邻近的WI38细胞却毫发无伤地离开。
相比之下，在相同浓度时，非靶向脂质体在很大程度上对细胞系是无效的。
这些结果表明，抗癌药物可以通过封装的叶酸靶向脂质体在不破坏正常细胞的情况下安全地靶向癌细胞。
FR介导的脂质体药物传递的关键一步是通过靶细胞内吞作用的封装药物的释放。
通常情况下，在靶细胞内吞作用过程中，脂质体循环稳定性和装卸效率之间有一个不想关的作用。
因此，为了实现脂质体制剂的长时间循环，脂质体制剂必须高度稳定和相对较小（直径≤150nm），这样可以避免血清蛋白的调理作用和被网状内皮系统（RES摄取）清理掉。
为了避免这些障碍的修改包括脂质体表面被高分子化合物保护例如PEG或饱和长链脂质和胆固醇的脂质体的组装。
不幸的是，这种稳定因素也可以阻断受体-配体的相互作用，并且防止封装药物被靶细胞社区后释放掉。
虽然将配体连接到比聚乙二醇涂层长的PEG片层上可能会解决配体识别的问题。
但细胞内释放仍然是很大的问题。
然而，建立了一些好的策略，就是建立PH-引发的释放机制，可以使药物在空间稳定脂质体进入到酸性内体后逃逸。
这样的一个方法是将pH敏感膜融合肽（例如EALA肽）与脂质体结合，在PH很低的情况下催化脂质体与内涵体融合。
另外，建立了pH敏感膜融合脂质来增加脂质体的渗透，在内体酸性的情况下促进内溶物释放。
叶酸靶向脂质体制剂杀灭细胞（大于60倍）的主要改进随着这些pH依赖型释药机制的使用也有报道。
确认了在脂质体药物输送中跨质膜运输只有几个障碍。
到目前为止，还没有叶酸靶向脂质体药物在体内试验。
然而，放射性标记的叶酸衍生物脂质体的分布已经与非靶向的脂质体在小鼠肿瘤模型中进行了比较。
重要的是，在肿瘤中，靶向和非靶向的脂质体制剂都显示摄取量增强，然而，靶向和非靶向的脂质体在肿瘤中的积累没有差距。
推测这种被动靶向是由于EPR效应控制着着两种制剂的生物分布，而且，如果在体内的叶酸靶向有优势，那么将会发现叶酸衍生物的能力调节脂质体和它的内溶物的内化。
正如下面将要讨论的，事实上，这种优势可以在体内的脂质体基因治疗载体表现出来。
3.1.3.基因治疗载体
随着叶酸偶联抗癌药物的开发研究，叶酸靶向基因治疗领域也取得了进步，在这里研究出病毒和非病毒载体（脂质体或以多聚赖氨酸为基础）。
可以想象，当脂质体载体用于基因靶向递送时，他们会遇到同封装脂质体药物一样的障碍，包括肿瘤细胞摄取后的血清稳定性、肿瘤穿透、载体内化、和胞内逃逸问题。
对这些靶向脂质体封装药物来说，这些问题的解决方案是不同的。
第一，封装体积大，带负电荷的多聚核苷酸与低分子量药物相比，需要非常不同的组件和方法。
第二，脂质体包埋基因的释放是伴随着细胞表面的结合和内吞作用，需要形成比那些小分子远远大的孔道。
第三，基因（与许多药物不同的）在治疗前必须获得进入细胞核的通路才能表达。
因此，叶酸靶向脂质体载体还必须包括能使遗传物质从细胞质转移到细胞核中的功能。
而低分子量的药物可以被封装在任何大小的脂质体中，裸DNA包裹小的脂质体时显得太大。
这种尺寸的限制是至关重要的，因为粒子的内吞作用的良好路线的大小可能都限制在100纳米。
因此，DNA的浓缩成为通过受体介导的内吞作用进入细胞的必要条件。
DNA浓缩一般是通过将大分子量的阳离子聚电解质（多聚赖氨酸、聚乙烯、聚酰胺-胺型树枝状聚合物）以一定比例结合，这可以保留静电充电。
例如，研究发现稍过量的正电荷对DNA·聚赖氨酸颗粒和叶酸靶向阴离子脂质体封装很有用。
最终载体复合物的阴离子特性表明可以减少哺乳动物细胞的表面的非特异性结合，从而转基因的表达主要是由FR的分布决定。
内涵体逃逸机制也有助于叶酸靶向基因治疗的效率。
不像阳离子脂质体和脂质体，可与大部分质膜融合并释放内溶物到细胞质中，FR靶向载体进入核内体必须通过转染发生。
为此，DOPE和胆固醇琥珀酸酯的混合物（CHEMS）已经证明使脂质体在中性或碱性pH值时稳定很有用，但在酸性/胞内pH值时发生膜融合。
由这些膜融合成分组成的叶酸靶向脂质体载体的比由成分相似的非融合性脂质效果好。
同样的，使用一个“笼”pH敏感脂质C-DOPE在胞内pH值时释放其头部成为一个融合的DOPE，并增加叶酸介导的基因表达。
由于叶酸靶向基因治疗的改进同样可以在pH依赖性的融合肽进入脂质体载体后观察到。
可以得出结论，一些pH触发的胞内释放机制必须有提高叶酸靶向基因治疗的效率的作用。
最后，一个核定位序列和封装核苷酸的结合也可以适度增加FR定向载体转染活性，这表明促进从细胞质到细胞核的遗传物质的运输也有助于靶向基因治疗的效率。
虽然配体靶向脂质体比常规脂质体没有大量累积，但叶酸靶向基因治疗载体可促进更高水平的肿瘤特异性基因的表达。
据推测，如上所述，叶酸衍生物增强了载体的内化，而不显着影响大分子在肿瘤中的累积。
因此，Xu等人观察到在肿瘤静脉注射叶酸靶向脂质体载体后β-半乳糖苷酶基因表达明显增加（直径60–70nm）。
转基因表达不仅限于恶性组织，而且在每个肿瘤的大多数细胞中也能观察到表达的基因。
此外，一种叶酸靶向p53基因治疗载体的系统输送大大提高了常规化疗和放疗药物对FR阳性的人类肿瘤异种移植物的疗效，得到彻底治愈的乳腺、前列腺、皮下肿瘤和化疗和放射性治疗剂单独施加作用不大的头部和颈部。
正如其他阳离子脂质体研究所预期的，与上述的脂质体制剂相关的主要缺点是在储存过程中的稳定性较低、分辨率高、RES高吸收、血浆清除率高。
为了避免这些问题，Leamon等人提出了一种叶酸-聚乙二醇涂层方法，预浓缩的阳离子脂质结构会受到一层聚乙二醇的保护，末端的叶酸可以促进肿瘤细胞的靶向性。
同时也观察到随着连有PEG-叶酸的脂质体载体的衍生作用，显着提高了肿瘤特异性基因的表达。
不仅肿瘤的表达大大提高，而且，有一个特定载体的组合物在其他组织中的基因表达很低或不存在。
尽管在随后的研究中，对许多变量进行了检查，载体的大小和电荷成为优化叶酸介导的基因表达的最关键的参数。
在基因表达领域，病毒载体肿瘤特异性的缺乏也是工作者面临的挑战。
试图在病毒包膜蛋白上克隆细胞靶向序列的结果并不理想，大部分是因为非靶向细胞对转化的病毒颗粒的非特异性摄取。
然而，我们观察到，叶酸衍生物允许FR-阳性KB细胞对两亲嗜性逆转录病毒和腺病毒的疯狂结合。
然而，研究发现细胞相关病毒在细胞表面几乎完全保留，可能是因为对于FR介导的内吞作用，它们的尺寸过大（>120nm），结果是，并没有基因表达。
有趣的是，叶酸结合衍生的腺病毒载体靶细胞的FR的结合确实可以防止正常病毒转染到相同细胞中，也就是说，因为病毒转染可通过阻断FR与过量的游离叶酸的结合而还原，可以认为叶酸连接的腺病毒活性很好，但不能通过正常途径感染细胞，因为它被迫停留在高亲和力的FR上，而不是它的普通受体上，
最后，小的反义寡脱氧核苷酸（ODN）也通过包装在卵磷脂/胆固醇/叶酸-PEG-PE脂质体中无损害地导入到培养的KB细胞中。
此外，反义ODN甚至裸质粒DNA也通过与直接与叶酸偶联或与叶酸形成复合物或形成叶酸-PEG阳离子络合物有效地传递到肿瘤细胞中，对于后者，聚阳离子和叶酸之间适当大小（分子量大约3400）的PEG间隔不仅提供对阳离子核酸酶消化DNA凝聚的障碍，而且大大提高颗粒与癌细胞FR的结合（类似叶酸
升级会员 