绿色荧光蛋白的克隆.docx
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绿色荧光蛋白的克隆
绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达
摘要
实验目的在于利用大肠杆菌的快速繁殖来克隆绿色荧光蛋白基因，从而来大量生产绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein），方法:
通过对目的基因的提取，合适质粒的选取，构建基因工程所需的重组体，利用基因工程的方法，PCR技术，大量克隆目的基因，最后利用合适的技术又到基因表达，对产物检测后，确定目的基因是否达到克隆目的。
关键词绿色荧光蛋白大肠杆菌基因工程PCR技术
1前言
绿色萤光蛋白（greenfluorescentprotein），简称GFP，是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。
后来，美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理，并对它进行了大刀阔斧的化学改造，不但大大增强了它的发光效率，还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱，供生物学家们选用。
目前生物实验室普遍使用的荧光蛋白，大部分是钱永健改造的变种。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子（Ca2+）可产生交互作用。
在生物学研究中，科学家们常常利用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体的标记。
将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。
生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明的细胞或细胞器从黑暗的显微镜视场中“纠出来”。
而且在一些方面，如分子标记、药物筛选、融合抗体、生物传感器等方面。
除此之外，绿色荧光蛋白在很多的领域存在着巨大的前景。
本实验拟从含有GFP基因的生物中提取GFP基因，并在工程菌中克隆出该基因。
2实验目的
从含有目的基因的生物中提取出GFP基因，按照基因工程的操作方法对目的基因进行克隆，最后对克隆产物进行鉴定。
3实验原理
3.1目的基因的分离及运载体的选择
3.1.1目的基因的分离
目的基因是指待测或待研究的靶基因，在分子克隆中，通常需要将这些基因从细胞中分离出来，在体外或体内进行一系列的研究。
目的基因通常可以通过多种途径来实现分离，如从基因组内直接分离，人工合成，从基因文库内提取，PCR扩增等方式来实现。
3.1.2质粒的分离和纯化
质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。
质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒DNA用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。
借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。
3.1.3PCR技术
单菌落或提取的质粒DNA也可以通过PCR方法鉴定正确克隆。
聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。
典型的PCR由高温变性、低温退火和适温延伸等三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。
其主要步骤是：
将待扩增的DNA置于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合；DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，沿模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
具体地说，PCR反应系统有寡核苷酸引物，反应缓冲液，热稳定DNA聚合酶（Taq酶），脱氧核苷三磷酸底物和靶序列（即模板）等五部分组成，缺一不可。
PCR技术能在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的某一特定的目的DNA片段扩增106倍以上，而无需经过烦琐的基因克隆程序便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。
5’-GG↓CC-3’
3’-CC↓GG-5’。
3.2酶切及连接
5’-G↓AATTC-3’
3’-CTTAA↓G-5’
II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoRI、HindIII、BamHI和NotI这样在识别序列中进行切割的酶。
这一类酶是构成商业化酶的主要部分。
大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。
一些酶识别连续的序列（如EcoRI识别GAATTC；HindIII识别AAGCTT;BamHI识别G↓GATCC;NotI识别GC↓GGCCGC）；而另一些识别不连续的序列（如BglI识别GCCNNNNNGGC）。
限制性内切酶酶切DNA后形成两种类型的末端：
（i）两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末端，如EcoRI酶切后产生末端；（ii）两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心，产生平末端。
DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团（-P）。
3.3细菌感受态细胞的制备及转化
大肠杆菌转化试验的技术关键就是制备感受态细胞，即应用一些特殊的方法（如电击法，CaCl2、RbCl（KCl）化学试剂法）处理后，使细菌细胞膜通透性发生暂时性的改变，处于能允许外源DNA分子进入的状态，即为感受态细胞。
CaCl2转化法的基本原理是细菌在低温、低渗（0℃，0.1mol/LCaCl2）的溶液中，菌体细胞膨胀成球形，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，外来的DNA可形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短暂热冲击处理，促进DNA复合物进入细胞，从而实现外源基因的转化。
3.4重组体的筛选和鉴定
由于实验中基因的转移方法的效率不高，真正摄入的重组DNA的受体不多，因此需要从中筛选出含有重组DNA的细胞，并鉴定其正确性和基因表达的情况。
重组质粒DNA是利用限制性内切酶（如BamHI和NotI）分别酶切基因片段和质粒后，利用基因片段和质粒DNA一端带有相同的粘性末端连接起来的重组质粒，如果再利用相同的限制性内切酶识别重组基因片段两侧的酶切位点，通过酶切下的重组片段的大小与连接的基因片段大小是否相同判断质粒DNA是否为重组质粒。
3.5GFP基因的诱导表达
IPTG（异丙基硫代β-L半乳糖苷）是一种常见的诱导基因表达的诱导剂，结构类似乳糖。
GFP基因连接到pET-28a的多克隆位点（MCS），GFP基因的表达受其上游T7启动子和操纵基因O位点以及结合到这些顺式作用元件的蛋白因子的控制。
LacI基因编码调节蛋白，可以四聚体的形式结合到操纵基因O位点上，关闭GFP基因的表达。
IPTG可与四聚体调节蛋白结合，从而改变调节蛋白的构象，使调节蛋白不再与O位点结合。
接着BL21编码的T7RNA聚合酶结合到T7启动子位点，从而启动GFP基因的表达。
4.实验设备
恒温培养箱，超净台，恒温摇床，台式高速离心机，小型混合器，超低温冰箱，1.5mlEP管，高压灭菌锅，振荡培养箱，紫外分光光度计，UVette比色皿，水浴锅，电泳槽，电泳仪，振荡器，蓝盾可见光透射仪，凝胶成像仪，PCR仪，1.5ml离心管，移液器及吸头，手持式紫外灯,锋利刀片
5.实验材料及配制
5.1试剂
灭菌的去离子水，PMD18-T（运载体）,pEGFP-N1（目的基因），EcoRI,HindⅢ，DH5α（克隆菌），bufferK，BL21，XhoI（10U/μL）（TaKaRa公司），T4DNA连接酶缓冲液，琼脂，氯化镁，Taq酶，T4连接酶，氯化钙，卡那霉素，X-Gal，Amp（100mg/ml），IPTG
5.2试剂的配制
LB培养基的配制（见表1）
表1LB培养基的配制
组成
液体
固体
蛋白胨（Trypton）
10g
10g
酵母提取物（YeastExtract）
5g
5g
NaCl
10g
10g
琼脂（Agar）
15g
蒸馏水
定容至1000ml
定容至1000ml
T4DNA连接酶缓冲液：
50mmol/LKCL；10~25mmolTris-HCL（pH8.4~9.0）;1.5mmol/L氯化镁；明胶。
6实验步骤
6.1目的基因的提取酶切连接及PCR扩增
6.1.1双切酶法
双酶切鉴定体系（见表2）
表2双切酶体系
反应物（μl）
pEGFP-N1
PMD18-T
质粒DNA
2
2
EcoRⅠ
0.5
0.5
HindⅢ
0.5
0.5
10×bufferK
1
1
ddH2O/μl
6
6
B按照上述酶切体系酶切2.5-3h，再配制1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶20ml。
向酶切样品中加入5µl溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀。
在1×TBEBuffer，80V（3-4V/cm）下电泳30min。
6.1.2回收酶切产物
先配30mL1％进口琼脂糖凝胶，尽量长一些（用粗梳子），对酶切产物进行电泳分离；首先将酶切产物全部加入加样孔中，跑胶，观察结果，并且拍照。
第二步用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取重量。
以0.1g凝胶对应300μL的体积加入PN。
然后50℃水浴放置10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全融解。
将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，13000rpm离心60s，弃掉废液。
再加入800μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。
加入500μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。
将离心吸附柱放回收集管，13000rpm离心2min。
离心后，取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB30μL，洗脱缓冲液先在65℃水浴预热，室温放置2min，13000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，13000rpm离心1min。
最后置于－20℃保存。
6.1.3PCR扩增
取一只10ml的灭菌离心管，用加样枪分别加入下列试剂（见表4），配制2x预混合液
表4预混合液
试剂
体积/μL
无菌去离子水
5840
10×缓冲液
2000
4×dNTP
400
氯化镁
1600
Taq酶
160
将上述的溶液混匀按需分装，于-20℃保存，然后准备PCR溶液，取0.2mlPCR反应管一只，用加样枪加入下述试剂（见表5）：
表5PCR扩增体系
试剂
体积/μL
灭菌离子水
19
2×Premix
25
引物
2
质粒DNA
2
按照PCR仪的参数先设置好实验的参数，具体参数是：
94℃5min，94℃5min，50℃30s，72℃60s，72℃5min，再4℃。
其中2，3，4步需循环3次。
然后先预热，待温度升置至94℃时，暂停仪器，迅速将PCR管插入模版，上盖，启动仪器。
6.1.4PCR产物T4连接
将上述的PCR产物和pMD18-T结合，连接体系（见表6）：
表6连接体系
试剂
体积
双蒸水
X/μL
10×T4DNA连接酶缓冲液
2.5/μL
DNA片段
0.3pmol
pMD18-T
0.03pmol
T4DNA连接酶
1/μL
摇匀后，16℃过夜反应，第二天，直接取5~10μL用于转化。
6.2感受态细胞的制备和转化
6.2.1制备
从LB板上挑一个新活化的DH5a单菌落，接种于3mlLB液体培养基中，37℃180rpm振荡培养过夜。
往100ml新鲜的LB液体培养基加入1ml的过夜菌，37℃振荡培养1-2个小时至A600=0.5左右。
将昨夜摇出来的DH5α培养液转入离心管中,冰上放置10min,然后于4℃下5000rpm离心10min，弃上清液。
用预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液10mL轻轻悬浮细胞,冰上放置10min,4℃下5000rpm离心10min，弃上清液。
加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置5min,即成感受态细胞悬液。
6.2.2转化
取1个无菌离心管加入100μLDH5α感受态细胞悬液，在冰浴中加入重组的DNA10μl
轻轻摇匀,冰上放置30min。
42℃水浴中热激90s（无摇动，无超时）,激后迅速置于冰
冷却2min。
向管中加入1000μLLB液体培养基,混匀后在37℃振荡培至菌液肉能观察到
微混浊。
从管中取100μL涂布于含氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）的平板上。
正面向放置约30分钟待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养12-16小时。
6.3重组质粒DNA的鉴定
首先把IPTG配制成24mg/ml（100mM）的水溶液，并进行过滤除菌后保存。
然 后在100ml的琼脂培养基中，加入100μl的上述溶液、200μl的X-Gal（20mg/ml的二甲基甲酰胺（DMF）溶液）和100μl的Amp（100mg/ml），制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。
当DNA片段插入至PUC系列载体（或其他带有lacZ、Amp基因载体），然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体（白色为具有DNA插入片段的基因重组体）。
6.4绿色荧光蛋白的表达和鉴定
取上步挑选出的基因重组体，在含有Kan的固体培养基上，37℃培养20h；挑取单菌落，37℃振荡培养过夜；取4支无菌带盖试管，加入新鲜LB液体培养基（含有Kan）5ml，按1：
20稀释比例加入过夜菌，37℃培养至生长期,约2-3小时。
加入IPTG（1：
1000）至终浓度1mmol/L，分别诱导0h，1h，2h，4h。
分别取1.5ml，10000rpm离心5min，去除上清，收集沉淀，再重复一次收集沉淀。
分别取IPTG诱导培养液20μl涂布在含Kan＋的固体培养基上，37℃培养20小时。
观察蛋白表达，用紫外线照射菌体沉淀及培养平板，可以看到绿色荧光。
分别对均匀涂布的平板以及表达蛋白的样品管照相，保存照片。
7结果与计算
7.1可见光透射仪观察结果
7.2菌体鉴定的结果
7.3双酶切法鉴定结果
7.4GFP诱导反应产物荧光反应产物
7.5蓝白斑鉴定结果
8注意事项
8.1防止杂菌的污染
在整个操作过程中必须要在冰浴低温和无菌的条件下操作，所有器皿均要测底消毒，并在高温灭菌处理后使用，所有的试剂也要灭菌，且要注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
8.2菌液涂板
在涂布平板的时候，应该避免反复来回涂，该时期感受态细胞的细胞壁有了变化，过多的机械挤压会使细胞壁破裂，影响转化率。
8.3配制要求
本实验所涉及的各物质的含量精确，所用的试剂应该要用高纯度的，并用高纯度配制，最好分装保存在干燥阴暗处。
8.4实验操作要轻柔
特别是在处理较大片段的DNA时应防止机械剪切作用对DNA的破坏，如吸取液体，转动离心管等操作均应缓慢，轻柔。
8.5PCR试剂配置应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
8.6PCR所用试剂都应该以大体积配置，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
8.7PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
9经费预算
10可行性分析
10.1具备一定的理论基础
本试验的设计上准循基因克隆的一般流程，通过对文献的查询，本实验的方法都可以实施。
且原理正确有理论的支持。
10.2本实验在设计上合理
本试验的设计上准循基因克隆的一般流程，从目的基因的选取，质粒DNA的选取再到连接，导入，筛选，诱导表达都符合基因工程原理。
10.3实验小组成员知识储备充足，有一定的操作能力
本小组成员都具备有一定的实践操作能力，且在生化知识方面储备充足，已经熟悉本实验的全部流程，对实验仪器也有一定的认识，了解大部分仪器的使用方法。
10.4实验材料简单
本实验所用的菌种为大肠杆菌菌株，为实验室常用细菌，且试验的试剂在实验室也比较好寻找。
参考文献
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质粒DNA提纯方法的研究《中华医药杂志》2007年7月3号
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重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达《中国生物工程杂志》2004年第4期
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