重组细小病毒对胶质瘤细胞的生长抑制作用.docx

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重组细小病毒对胶质瘤细胞的生长抑制作用

重组细小病毒对胶质瘤细胞的生长抑制作用

【摘要】　　［目的］研究表达趋化因子MIP-1α/LD78β的重组细小病毒对胶质瘤细胞的生长抑制作用。

［方式］共转染法制备重组病毒。

用重组病毒感染人胶质瘤细胞系U87MG和鼠胶质瘤细胞系GL261，监测细胞生长并用ELISA方式测定细胞培育上清中MIP-1α蛋白每日和积存表达量。

克隆形成实验测定病毒的细胞毒性。

［结果］与未处置的细胞相较，MOI=3RU/cell的重组病毒感染使GL261细胞克隆形成减少。

U87MG和GL261细胞感染重组病毒后都可产生大量MIP-1α蛋白。

日表达量的顶峰别离出此刻感染后第3d和第4d。

2×105的GL261和U87MG细胞在感染（MOI=3）5d后积存蛋白表达量别离为780ng/ml和250ng/ml。

和对照相较，重组病毒感染的GL261细胞生长减慢，但表达MIP-1α或LD78β的重组病毒与不含外源基因的重组病毒感染GL261后，活细胞数量没有明显不同。

U87MG对病毒的灵敏性低于GL261，感染重组病毒的各组细胞生长比对照略缓慢。

［结论］重组细小病毒在体外对U87MG和GL261胶质瘤细胞的生长有抑制作用，但转导外源基因MIP-1α/LD78β在体外对细胞生长无明显阻碍，抑制作用主若是由于病毒的细胞毒性引发。

【关键词】重组细小病毒　胶质瘤细胞　细胞毒性　生长抑制

　　GrowthInhibitionofGliomaCellsafterInfectionwiththeRecombinantPavoviruses

恶性胶质母细胞瘤是中枢神经系统最多见的原发性肿瘤，常规的医治方式远不能达到医治要求。

趋化因子可吸引免疫效应细胞至病灶部位，并激活机体免疫反映，可作为肿瘤基因医治的侯选基因[1]。

巨噬细胞炎症蛋白1α（MIP-1α）属于CC趋化因子家族，其要紧作用是吸引单核细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK）等。

LD78β是MIP-1α的异构体，趋化活性较MIP-1α强[2]。

咱们前期的研究说明人胶质瘤细胞系U87MG和鼠胶质瘤细胞系GL261可作为细小病毒医治胶质母细胞瘤的细胞模型进行深切研究[3]，本研究测定了表达MIP-1α/LD78β的重组细小病毒在体外对U87MG和GL261的细胞毒性和生长抑制作用，并测定了外源蛋白在细胞中的表达量，为下一步在动物体内研究其抗肿瘤作用作预备。

1材料与方式

材料

细胞系：

人胶质瘤细胞系U87MG和鼠胶质瘤细胞系GL261，指示细胞NBE-324K和A9为德国癌症研究中心肿瘤病毒学研究室赠送。

MVM和H1重组病毒质粒hH1/MIP-1α，hH1/LD78β和hH1/Δ800，MVMp/MIP-α，MVMp/LD78β，MVMp/Δ80及包装质粒和野生型病毒：

德国癌症研究中心肿瘤病毒学实验室Dr.Rommelaere赠送。

其他细胞为本室保留。

1．2方法

细胞培育

293T、GL261和U87MG细胞在含10%小牛血清、2mML-谷氨酸和抗生素的DMEM中培育，A9和NBE-324K在10%小牛血清，2mML-谷氨酸和抗生素的MEM中培育。

培育条件为37℃，5%CO2，90%湿度。

重组病毒制备

培育1×108293T细胞，磷酸钙法转染300μgH1（hH1/MIP-1α，hH1/LD78β和hH1/Δ800）和MVM重组病毒质粒，（MVMp/MIP-α，MVMp/LD78β，MVMp/Δ800）及其相应的600μg包装辅助质粒，72h时后收成细胞,冻融法制备病毒粗提物，碘克沙醇（iodixanol）梯度离心纯化，病毒别离感染SV40转化的人胎肾细胞系NBE-324K和鼠成纤维细胞A9，用病毒DNA特异性探针杂交测定H1和MVM重组病毒的感染滴度（replicationunit，RU/ml）。

病毒感染和生长曲线

感染的前一天在6cm细胞培育皿中培育×105细胞，第二天吸除培育液，加入用不含血清的MEM稀释的病毒，病毒剂量为multiplicityofinfection（MOI）=3，置于37℃，5%CO2，90%湿度孵箱，每隔10min轻轻摇动培育皿1次，以确保细胞与病毒的接触。

1h后吸除病毒，加入4ml含10%血清的培育液培育5d，天天掏出2盘细胞用台盼蓝染色计数，绘制生长曲线。

克隆形成实验测定病毒的细胞毒性

在6cm细胞培育皿中培育×105GL261细胞，第二天进行病毒感染，病毒剂量为MOI=3，感染1h后吸除病毒，加入4ml含10%血清的培育液培育4h，用胰酶消化细胞并计数，在新的培育皿中别离加入100、500、1000、2000、4000、10000个细胞/皿，培育2周，吸出培育液，4℃用乙醇/醋酸（3∶1）固定细胞20min，70%乙醇和清水洗涤，加结晶紫染色30min，清水洗涤后计细胞克隆数。

趋化因子表达测定

培育×105U87MG和GL261细胞，别离用MOI=3的重组H1和MVM病毒感染1h，继续培育5d，天天搜集一盘细胞的培育上清，ELISA测定蛋白的积存表达量。

日表达量的测定天天从同一盘细胞中搜集培育液，并改换新培育液。

2结果

病毒制备

搜集感染了病毒3d后的293T细胞，37℃10min，－80℃30min反复冻融3次，离心搜集上清为病毒粗提物，病毒粗提物用碘克沙醇梯度离心进行纯化后，感染A9（MVM病毒）和NBE-324K（H1病毒）细胞，48h后将细胞转移至硝酸纤维素膜上，经变性和中和后，用病毒基因组特异性NS探针杂交，测定病毒感染性滴度，取得感染滴度为9×106RU/ml~1×108RU/ml的重组病毒。

病毒的细胞毒性

由于U87MG细胞不形成克隆，因此仅测定了MVM重组病毒对GL261细胞的毒性。

克隆形成实验结果说明，MOI=3RU/cell的重组MVMp病毒减少GL261细胞克隆形成，MVMp/MIP-1α，MVMp/LD78β，MVMp/Δ800病毒感染细胞的克隆形成率与对照（视为100%）相较别离降至61%、76%和71%。

含趋化因子的重组病毒与不含外源基因（Δ800）的病毒相较，对细胞的毒性没有不同。

病毒感染后细胞生长曲线

和对照相较，MVM重组病毒感染的GL261细胞生长减慢，但转导了外源基因MIP-1α和LD78β的重组病毒与不含外源基因（Δ800）的重组病毒相较，对细胞生长的阻碍无不同（图1），说明细胞生长的抑制主若是由于病毒的细胞毒性引发的，极可能是因为病毒产生毒性很强的NS蛋白造成的。

U87MG对病毒的灵敏性低于GL261，感染重组病毒的各组细胞生长比对照略有减少（图2）。

外源基因在宿主细胞中的表达量

用H1重组病毒感染人胶质瘤细胞系U87MG，用MVM重组病毒感染鼠胶质瘤细胞系GL261，ELISA方式测定细胞培育上清中趋化因子蛋白的含量。

结果显示2×105细胞在感染（MOI=3）5d后GL261和U87MG细胞培育上清蛋白量别离为780ng/ml和250ng/ml。

GL261和U87MG细胞表达外源蛋白的顶峰别离在感染后第4天和第3天。

GL261细胞的表达量明显高于U87MG，而且在两种细胞中LD78β的表达量均比MIP-1α表达量高。

见图3。

3讨论

为了研究趋化因子MIP-1α/LD78β的抗肿瘤作用，咱们利用细小病毒载体转导MIP-1α/LD78β至脑胶质瘤细胞系U87MG和GL261，在体外测定了重组病毒的细胞毒性、对宿主细胞生长的阻碍和外源基因在宿主细胞内的表达。

GL261细胞克隆形成实验结果说明重组病毒在体外对细胞有毒性，和对照相较，病毒感染组的细胞克隆形成均减少。

但含MIP-1α、LD78β的病毒和不含外源基因的病毒相较，三者的克隆形成率没有不同，提示病毒的细胞毒性与转导的外源基因没有关系。

从细胞感染病毒以后的生长曲线也能够得出一样的结论。

咱们明白，细小病毒的非结构蛋白NS1是一个多功能的蛋白，具有解旋酶、核酸内切酶、ATP酶、DNA-nicking和序列特异性DNA结合活性，既可操纵病毒DNA的复制和表达，还具有细胞毒性作用[4]。

Geletneky等[5]报告细小病毒对恶性胶质瘤的毒性作用与病毒的复制和感染性病毒颗粒产生有关。

Cornelis[6]的研究说明，病毒不通过完整的病毒复制周期也可产生细胞毒性作用，证明细小病毒的抑癌作用不仅能够通过病毒在肿瘤细胞中的大量复制溶解肿瘤，还能够通过产生毒性NS1蛋白发挥作用。

而咱们所用的重组病毒在细胞内不能复制，因此能够以为重组病毒对U87MG和GL261细胞生长的抑制主若是由于病毒产生毒性很强的NS1蛋白造成的。

尽管细小病毒的宿主普遍，但不同细胞对病毒的灵敏性有不同。

咱们的结果说明，U87MG对病毒的灵敏性低于GL261，细胞感染病毒后生长比对照略有减少，这与咱们以前的野生型病毒感染结果相似[3]。

Cornelis等[7]的研究说明，成纤维细胞和上皮细胞对细小病毒H1感染的灵敏性是不同的，其灵敏性的不同是与病毒结构和非结构蛋白的转录水平相关，而与病毒的摄入、基因产物在细胞内的定位、病毒mRNA的稳固性、非结构蛋白NS1的磷酸化都没有关系。

咱们在实验中也发觉U87MG和GL261中病毒NS基因在mRNA水平也有必然不同（结果未显示）。

咱们用H1重组病毒感染人胶质瘤细胞系U87MG，用MVM重组病毒感染鼠胶质瘤细胞系GL261，ELISA方式测定细胞培育上清中趋化因子蛋白的含量。

结果显示GL261细胞表达外源基因的效率高于U87MG。

而且外源基因在两种细胞中LD78β的表达量均比MIP-1α表达量高。

咱们用半定量PCR方式检测了两个基因在mRNA水平的表达量，取得一样的结果（未发表结果），提示表达量的不同有可能是两个基因在转录水平上细微不同造成的。

本文的研究结果说明，重组细小病毒（MOI=3）感染2×105GL261和U87MG细胞5d后，细胞培育上清积存外源蛋白量可别离达到780ng/ml和250ng/ml，GL261和U87MG细胞表达外源蛋白的顶峰别离在感染后第4d和第3d，提示作为基因医治载体可在局部产生高浓度的趋化因子蛋白发挥作用，加上细小病毒又具有亲瘤特性，因此可吸引免疫细胞至感染的肿瘤局部发挥作用。

结合细小病毒对细胞的毒性作用，含趋化因子MIP-1α/LD78β的重组细小病毒有望在动物体内发挥抗肿瘤作用。

【参考文献】

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[3]李方,王字玲.脑胶质瘤细胞系对细小病毒MVM和H1易感性的研究[J].中国肿瘤,2006,15（7）：

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[4]RommelaereJ,CornelisJJ.AutonomousParvoviruses[A].HernáizDrieverP,RabkinSD,eds.Replication-CompetentVirusesforCancerTherapy.MonographsinVirology[M].Basel:

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[5]GeletnekyK,HerreroYCalleM,RommelaereJ,etal.Oncolyticpotentialofrodentparvovirusesforcancertherapyinhumans:

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[7]CornelisJJ,ChenYQ,SpruytN,etal.SusceptibilityofhumancellstokillingbytheparvovirusesH-1andminutevirusofmicecorrelateswithviraltranscription[J].JVirol,1990,64（6）:

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