重组门冬酰胺酶表达制备纯化方法.docx

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重组门冬酰胺酶表达制备纯化方法

重组门冬酰胺酶Ⅱ的表达纯化与分析

【引言】

左旋门冬酰胺酶（Lasparaginase,LSP）是淋巴系统恶性肿瘤化疗方案中的一个很主要的药物,应用日趋广泛。

然而,LSP可产生多种毒副作用,包括急性胰腺炎、药物性糖尿病、过敏反应、凝血功能障碍、肝功能损害等,在一定程度上限制了LSP的临床应用,尤其对于曾出现上述不良反应的患儿的后续治疗还能不能再用LSP,就成为一个急需解决的问题。

目前国内所有化学治疗中应用的ECII主要是依赖进口,完成表达ECII的基因工程菌株构建,并逐步进行ECII的工业化生产,对于国内ALL的临床化疗有积极意义。

为此,我们克隆了ECII的基因,在大肠杆菌中获得了高效表达,并探讨了其突变复性及后续纯化的简便方法。

国内亦开展了类似的工作。

【目的要求】

1．了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理。

2．掌握以基因工程菌种pANS2为材料进行工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白重组门冬酰胺酶Ⅱ及表达酶蛋白制备和酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理和技术方法。

【实验原理】

L-门冬酰胺酶（L-asparaginase，3.5.1广泛存在于动物的组织、细菌、植物和部分啮齿类动物的血清中，但在人体的各种组织器官中的分布未见报道。

L-门冬酰胺酶活性形式为一同源四聚体，每一亚基由330个氨基酸组成，分子质量为34564u，能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨。

由于某些肿瘤细胞缺乏L-门冬酰胺酶合成酶，细胞的存活需要外源L-门冬酰胺的补充，如果外源门冬酰胺被降解，则由于蛋白质合成过程中氨基酸的缺乏，导致肿瘤细胞的死亡。

因此，L-门冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物，多年来一直是小儿急性成淋巴细胞性白血病（AcuteLumphoblasticLeukaemia,ALL）和淋巴肉瘤（Lymphosarcoma）临床化疗中重要的配伍药物之一。

用微生物，特别是大肠杆菌来生产L-门冬酰胺酶已有广泛深入的研究。

大肠杆菌能产生2种天冬酰胺酶，即L-门冬酰胺酶Ⅰ和L-门冬酰胺酶Ⅱ，分别由其染色体上基因ansA和ansB编码。

只有L-门冬酰胺酶Ⅱ才有抗肿瘤活性。

美、德、日均有L-门冬酰胺酶Ⅱ商品出售。

我国天津生化厂曾于1974年投产，后因菌种退化，产量降低而停产。

国内目前用药全靠进口。

1995年，本院构建了高效分泌表达L-门冬酰胺酶Ⅱ的基因工程菌，重组L-门冬酰胺酶Ⅱ（rL-ASPⅡ）在大肠杆菌细胞中合成后分泌到细胞周质中。

表达的rL-ASPⅡ相对分子质量为138356Da，pI为，紫外最大吸收值在278nm处。

本实验以此工程菌为材料采用蔗糖溶液渗透振扰提取法和酶解法联用提取周质中的rL-ASPⅡ，再用硫酸铵分级沉淀、DEAE-52阴离子纤维素交换层析等步骤提取和纯化，得到较高纯度表达产物rL-ASPⅡ。

并对rL-ASPⅡ进行酶活力分析和12%SDS-PAGE电泳分析。

rL-ASPⅡ酶活性的测定参照Peterson的方法修订。

取1mol/LL-门冬酰胺，1mlmol/L硼酸-硼酸钠缓冲液，ml细胞悬液或酶液于37℃保温15min，速加1ml50%三氯乙酸终止反应，4000r/min离心沉淀细胞。

取上清液1ml，加奈氏试剂2ml和双蒸水7ml，放置15min后，于500nm波长比色。

在上述规定条件下，将每分钟催化L-门冬酰胺水解释放1μg分子氨所需的酶量定义为1个酶活力单位（OD500=时为1U）。

比活力测定方法为：

精称纯化产物10mg，溶解于1mlH2O中，采用Lowry法测定蛋白质含量，并测定酶活力，经以下公式换算即得单位质量的rL-ASPⅡ比活力。

rL-ASPⅡ比活力=酶活力（U）/蛋白含量。

【实验材料】

1．器材

（1）基因工程菌菌种：

pANS2为本实验室保存；

（2）其他同前实验二十三器材。

2．试剂

重组L-门冬酰胺酶Ⅱ制备和酶活力测定：

（1）培养基：

种子培养基（LB液体培养基）；

发酵培养基（玉米浆培养基）：

玉米浆50g/L，牛肉浸膏35g/L，味精10g/L，，高压灭菌。

接种前在无菌条件下加入抗生素氨苄青霉素。

（2）氨苄青霉素（Amp）；

（3）破壁液：

45%蔗糖，10mmol/LEDTA，200mg/L溶菌酶，pH；

（4）奈氏试剂：

称碘化钾5g加入5ml蒸馏水中，边搅拌边滴加25％氯化汞饱和液至稍有红色沉淀出现。

再加40ml50％氢氧化钠溶液，最后用蒸馏水稀释至100ml，混匀入棕色试剂瓶中置暗处保存；

（5）1mol/L氯化锰（MnCl2）；

（6）5mol/L磷酸缓冲液；

（7）硼酸缓冲液：

0.858g硼砂（MW=，0.680g硼酸（MW=，用蒸馏水稀释至100ml；

（8）溶菌酶；

（9）蔗糖；

（10）氯化钠；

（11）三（羟甲基）胺基甲烷（Tris）；

（12）乙醇；

（13）氢氧化钠；

（14）硫酸铵；

（15）谷氨酸钠（或含99%谷氨酸钠的味精）；

（16）四甲基乙二胺（EDTA）；

（17）盐酸；

（18）玉米浆；

（19）低分子量标准蛋白（14.4～94KDa）；

12%SDS-PAGE电泳分析：

同实验九。

【实验方法】

1.表达制备方法：

一：

PCR扩增ANSB基因：

1模板的制备用接种环挑取菌体少许，在裂解液中震散，95摄氏度加热10MIN，吸取处理液用于PCR2扩增条件84℃变形1分钟，60℃复性2分钟，72℃延伸2分钟，循环28次

二：

重组质粒PKK233ANSB的构建扩增后的DNA片段及质粒同时分别用限制酶消化并用琼脂搪凝胶电泳分离和回收质粒大片段将消化后的DNA片段和电泳回收的质粒大片段用T4DNA连接酶连接,连接产物经琼脂糖凝胶电泳回收后转化,筛选获得相应的阳性转化子。

三：

阳性转化子的筛选

将涂布在含氨节青霉素的LB平板上生长出的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜平板上,为每个克隆编号。

平板置37℃温箱中过夜,待菌落形成后,用灭菌牙签逐个挑取少量菌体,移入预先加有L硼酸缓冲液50UL的酶标板反应孔内,待菌体分散后,每孔各加入L天门冬酞胺底物溶液50UL,保温37℃,加奈氏试剂50UL,呈深棕红色孔内对应的单菌落即为阳性转化子。

2.工程菌发酵培养

（1）从平板上挑取菌种接种于新鲜的含氨苄青霉素（终浓度为100μg/ml）的LB液体培养基中，37℃，摇床转速220r/min，培养至OD600为～。

（2）摇瓶培养：

再按2%接种量转接于发酵培养基（三角瓶20%装液量）中，37℃，250r/min，20h，12000r/min离心收集细胞。

（3）批式发酵培养：

20L的发酵罐装入14L发酵培养基,初始pH值为，121℃下灭菌20min，待温度降至37℃时加氨苄青霉素至最终浓度为100μg/ml，接入种子液700ml，37℃培养12～14h，罐压力。

3．重组L-门冬酰胺酶Ⅱ分离纯化制备

（1）蔗糖溶液渗透振扰法和酶解法联用提取酶

将发酵收获的菌体细胞悬浮于5倍体积的破壁液中，在30℃温和振荡70min后搅拌下倾入大量水中，4℃，边搅拌边加入1mol/LMnCl2%，V/V），沉淀核酸和菌体碎片，8000r/min，离心30min，收集上清液即得酶提取液。

采用Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析。

计算收率。

（2）硫酸铵分级沉淀

在酶提取液中加入硫酸铵至55%饱和度，调pH到，冰水浴磁力搅拌60min，4℃静置过夜，12000r/min离心10min除去沉淀。

再在上清液中加入硫酸铵至90%饱和度，调pH至等电点附近（约），搅拌60min，4℃静置过夜，12000r/min离心10min，收集沉淀。

采用Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析。

计算收率。

（3）透析脱盐

上述沉淀物用5mol/L磷酸缓冲液溶解，透析脱盐。

（4）DEAE-52阴离子交换柱层析

DEAE-纤维素柱经5mmol/L磷酸缓冲液平衡后，上样品脱盐酶液，用相同缓冲液洗涤至基线平稳，改用50mmol/L磷酸缓冲液洗脱，分部收集器收集，min,每管收集6ml，测定每管的A280值和酶活性。

绘制洗脱曲线。

收集显示酶活性组分，冷冻干燥后即得高纯度的L-门冬酰胺酶冻干粉。

采用Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析。

计算收率。

4．重组L-门冬酰胺酶Ⅱ酶活性测定　

吸取1ml菌液入Ep管，12000r/min离心5min，收集菌体弃去上清，加入蒸馏水1ml洗涤，混悬，12000r/min离心5min，弃上清。

重复上述操作2～3次，加入硼酸缓冲液1ml混悬。

准备一组（2支）蒸馏水准备管：

取10ml的洁净试管2只，每管加蒸馏水。

另取2支10ml的洁净试管，分别加入mol/L天冬酰胺底物，mol/L硼酸缓冲液各1ml，37℃水浴5min，其中一只加入细胞悬液20μl，另一支为对照管。

反应15min后分别加入50%三氯乙酸1ml终止反应。

再从终止反应管中各支取500μl进蒸馏水准备管，每管分别加入与25%NaOH以1:

1配好的奈氏液1ml显色，500nm处测OD值。

计算：

酶活力（U）=[（OD×1000）/×15x）]×（3+x/1000）

x为取样体积（本实验为20μl）

5．比活力测定方法

精确称取纯化产物10mg，溶解于1mlH2O中，采用Lowry法测定蛋白质含量，并测定酶活力，经以下公式换算即得单位质量的rL-ASPⅡ比活力。

rL-ASPⅡ比活力=酶活力（U）/蛋白含量。

6．12%SDS-PAGE电泳分析样品纯度

电泳方法同实验九。

（1）按常规制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶，浓度12％。

（2）将发酵收获的细胞、酶提取液、硫酸铵分级沉淀和离子交换洗脱液样品处理后，进行电泳分析。

（3）电泳2～3h后，取出凝胶，用%考马斯亮蓝-R250进行染色。

过夜后倾出染液，不断脱色，起初每20min换液1次，1h后每小时换液1次，直到区带明显，画出电泳区带图谱。

7．结果处理

（1）用箭头图表示重组L-门冬酰胺酶Ⅱ制备的操作流程。

（2）绘制洗脱曲线。

（3）重组L-门冬酰胺酶Ⅱ的纯化过程分析

重组L-门冬酰胺酶Ⅱ的纯化过程分析

纯化步骤总蛋白（mg）总活力（U）比活（U/mg）纯化倍数收率（%）

A.粗提酶液

B.硫酸铵沉淀

纤维素柱层析

（4）电泳图谱分析