大豆分离蛋白的提取实验讲义.doc

1、实验一 大豆分离蛋白的提取1实验目的学习掌握大豆分离蛋白的碱提酸沉法。2分离原理：大豆分离蛋白的制取方法，按工艺特点主要有三种：第一种是碱提酸沉法；第二种是离子交换法；第三种是超滤法。碱提酸沉法生产大豆分离蛋白的原理，是将脱脂大豆内的蛋白质溶解在稀碱溶液中，分离除去豆粕中的不溶物，然后用酸将大豆蛋白质提取液的pH值调至大豆蛋白的等电点，使大豆蛋白质沉淀析出，再经分离清洗，回调pH，得到粉状大豆分离蛋白。3. 试剂材料：豆粕，5%NaOH，2N HCl（17ml浓盐酸，缓慢用水稀释至100ml）。4. 提取方法：将2g大豆磨碎，得到可通过80目筛的豆粕。用重量10倍于豆粕的蒸馏水与脱脂豆粉混合，

2、用5%NaOH水溶液将豆粉悬浮液的pH调节到8.5，室温或40搅拌1.5h。然后将提取液离心除渣4000rpm15min，得上清液。用2N的HCl将上清液的pH值调到4.5，同时轻度搅拌均匀，可见开始出现沉淀，室温静置30min，然后以4000rpm15min离心，用蒸馏水清洗沉淀2次，将蛋白沉淀物溶于20 ml水中，并调节pH到7.0，考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，计算蛋白提取率。5. 产品测定指标：（1）可溶性蛋白质的浓度：采用考马斯亮蓝法。（2）蛋白质的提取率计算公式：可溶蛋白质的浓度(ug/ml) 稀释度体积(ml) 提取率（%） 100% 原料质量(g) 106（附）考马斯亮蓝结合

3、法测定蛋白质浓度一、实验目的掌握考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度的原理和方法，掌握离心机和移液器的正确使用方法。二、实验原理考马斯亮蓝G-250是一种甲基取代的三苯基甲烷，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质-考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收max的位置发生转移，在595nm处有最大吸收值。在一定范围内(蛋白质浓度范围为01000gmL)，蛋白质-考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，是

4、一种常用的微量蛋白质快速测定方法。三、实验试剂1 标准蛋白液：准确称取100mg牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解并定容至1000ml，制成100g /ml的原液。2 考马斯亮蓝G250试剂：准确称取100mg考马斯亮蓝G250，溶于50ml 9095乙醇中，再加入85%磷酸（m/v）100ml，用蒸馏水定容至1000ml。常温下可放置1个月。四、操作步骤1标准曲线的制备取7支具塞试管，按下表进行编号并加入试剂。以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度(gmL)作为横坐标作图得标准曲线。标准曲线的制备（0100gmL）及样品测定参考表 管号试剂1（空白） 23

5、4567标准蛋白液(ml)00.20.40.60.81.0水(ml)1.00.80.60.40.20样品提取液(ml)1.0考马斯亮蓝试剂(ml)5.05.05.05.05.05.05.0蛋白质浓度(g/m1)020406080100待测充分混匀，室温静置3minA595nm2样品中蛋白质含量的测定根据样品吸光度值，推出样品中蛋白质含量。七、注意事项1样品蛋白质含量应在10100ug为宜。一些阳离子如K+、Na+、Mg2+、（NH4）2SO4、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如TritonX-100、SDS等会严重干扰测定。2蛋白质与考马斯亮蓝G250结合十分迅速，在2min左右即可达到平衡，其结合物在室温下1h内保持稳定，且在5min20min之间颜色稳定性最好。3试管内溶液要充分混合，但应避免不正确的振荡而产生大量的气泡。4染料易吸附在比色杯上（注意尽量不用石英比色杯），比色杯用后可用乙醇洗去蓝色。5由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用r-球蛋白质为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 2