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生科161作业

第3章生物信息的传递（上）-从DNA到RNA

1.什么是编码链?

什么是模板链?

答：

与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链（codingstrand）或称有意义链（sensestrand）；另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链（templatestrand）或称反义链（antisensestrand）。

2.简述RNA的种类及其生物学作用。

答：

1、mRNA（信使RNA）：

蛋白质翻译的模版；2、rRNA（核糖体RNA）：

核糖体的组成成分；3、tRNA（转运RNA）：

转运氨基酸到核糖体合成蛋白质；4、RNA生物学作用：

（1）翻译模板，

（2）催化功能，（3）转录加工和修饰，（4）基因调控，（5）生物进化有关。

3.大肠杆菌RNA聚合酶的组成、结构？

答：

大肠杆菌RNA聚合酶由2个α亚基、一个β亚基、一个β’亚基和一个ω亚基组成，称为核心酶。

加上一个σ亚基后则成为聚合酶全酶（holoenzyme），相对分子质量为4.65×l05。

4.什么是闭合复合物、开链复合物以及三元复合物？

答：

（1）启动子选择阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物（closedcomplex）。

此时DNA链仍处于双链状态。

（2）而伴随着DNA构象上得重大变化，封闭复合物就转变为开放复合物即聚合酶全酶所结合的DNA序列中有一小段解开。

（3）开放复合物与最初的两个NTA相结合并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后转变成包括RNA聚合酶，DNA和新生RNA的三元复合物。

5.简述α因子的作用。

答：

σ因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始，加入σ因子以后，RNA聚合酶全酶识别启动子序列的特异性总共提高了107倍。

6.什么是Pribnow框（box）？

什么是-35序列？

它们的保守序列如何？

答：

绝大部分启动子都存在位于-10bp处的TATA区和-35bp处的TTGACA区。

这两段共同序列是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。

Pribnow区（Pribnowbox）这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为–10区。

TTGACA这个区的中央大约位于起点上游35bp处，所以又称为–35区。

–10位的TATA区和–35位的TTGACA区是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。

7.什么是上升突变？

什么是下降突变？

答：

细胞中常见的突变有上升突变和下降突变两种 ：

（1）上升突变：

细菌中常见的启动自突变之一，突变导致Pribnow区共同序列的同一性增加；

（2）下降突变：

细菌中常见的启动子突变之一，突变导致结构基因的转录水平大大降低，如Pribnow区从TATAAT变成AATAAT。

8.简述真核和原核生物基因mRNA的差异。

答：

（1）原核生物mRNA常以多顺反子的形式存在。

真核生物mRNA一般以单顺反子的形式存在；

（2）原核生物mRNA的转录与翻译一般是偶联的，真核生物转录的mRNA前体则需经转录后加工，加工为成熟的mRNA与蛋白质结合生成信息体后才开始工作；

（3）原核生物mRNA半寿期很短，一般为几分钟，最长只有数小时。

真核生物mRNA的半寿期较长，如胚胎中的mRNA可达数日；

（4）原核与真核生物mRNA的结构特点也不同，原核生物的mRNA的5’端无帽子结构，3’端没有或只有较短的polyA结构。

9.真核和原核生物基因转录的差异？

答:

（1）原核和真核基因转录起始位点上游区的结构存在很大的差别；

（2）原核生物基因的转录与mRNA的翻译偶联，转录与翻译同步进行，因此原核生物不存在mRNA的加工问题；

（3）真核生物基因的转录与mRNA的翻译在空间上是分开的，转录在细胞核中进行。

转录的产物加工后输出到细胞质，由游离在胞质中或内质网上的核糖体将mRNA翻译成蛋白质。

真核生物的转录初级产物要经过许多加工与修饰才能成为成熟的mRNA，未成熟的mRNA不能输出细胞核。

10.大肠杆菌的终止子有哪两大类？

请分别介绍一下它们的结构特点。

答：

大肠杆菌的终止子可以分为由基因序列决定的终止和依赖于ρ因子的终止两大类。

基因序列决定的终止子结构特点：

（1）终止位点上游存在富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA形成发卡式结构；

（2）在终止位点前面有一段由4～8个A组成的序列，所以转录产物的3’端为寡聚U，这种结构特征决定了转录的终止。

依赖于ρ因子的终止子的结构特点：

（1）ρ因子是分子质量为2.0xl05的六聚体蛋白，它是NTP酶，它通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录；

（2）依赖于ρ因子的转录终止区DNA序列无共性，ρ因子不能识别这些终止位点。

11.真核生物的初级转录产物必须经过哪些加工才能成为成熟mRNA，以用作蛋白质合成的模板。

答：

加工包括：

（1）5’端连接“帽子”结构；

（2）3’端添加polyA“尾巴”；（3）hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列）转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）转录序列拼接上（真核生物一般为不连续基因）；（4）分子内部的核苷酸甲基化修饰。

12.简述Ⅰ、Ⅱ类自剪接内含子的剪接特点。

答：

Ⅰ类内含子的剪接主要是转酯反应，即剪接反应实际上是发生了两次磷酸二脂键的转移。

I类内含子的切除体系中，在第一个转酯反应由一个游离的鸟苷或者鸟苷酸介导，鸟苷或鸟苷酸的3’-OH作为亲核基团攻击内含子5’端的磷酸二脂键，从上游切开RNA链。

在第二个转酯反应中，上游外显子的自由3’-OH作为亲核基团攻击内含子3’位核苷酸上的磷酸二脂键，使内含子被完全切开，上下游两个外显子通过新的磷酸二脂键相连。

Ⅱ类内含子主要存在于真核生物的线粒体和叶绿体rRNA基因中，在Ⅱ类内含子切除体系中，转酯反应无需游离鸟苷或鸟苷酸，而是由内含子本身的靠近3’端的腺苷酸2’-OH作为亲核基团攻击内含子5’端的磷酸二脂键，从上游切开RNA链后形成套索结构。

再由上游外显子的自由3’-OH作为亲核基团攻击内含子3’位核苷酸上的磷酸二脂键，使得内含子被完全切开，上下游两个内含子通过新的磷酸二脂键相连。

13.什么是套索状结构？

哪些类型RNA的剪接中会形成该结构？

答：

在Ⅱ类内含子切除体系中，内含子本身的某个腺苷酸2'-OH作为亲核基团攻击内含子5'端的磷酸二酯键，从上游切开RNA链后形成套索状结构。

原始转录产物核不均一RNA的剪接过程中会形成该结构。

14.什么是RNA编辑？

其生物学意义是什么？

答：

RNA的编辑（RNAediting）：

是一种较为独特的遗传信息的加工方式，即转录后的mRNA在编码区发生碱基插入、删除或转换的现象，是在RNA分子上的一种修饰。

生物学意义：

（1）校正作用，有些基因在突变过程中丢失的遗传信息可以通过RNA的编辑得以恢复；

（2）调控翻译，通过编辑构建或去除起始密码子和终止密码子；（3）扩充遗传信息，使基因产物获得新的结构和功能，有利于生物的进化。

15.核酶具有哪些结构特点？

根据其催化功能的不同可分为哪两大类？

其生物学意义是什么？

答：

核酶的结构特点：

有RNaseA亚基（M1RNA）、锥头形、发夹型、Ⅰ类内含子、Ⅱ类内含子等结构；

核酶的锤头结构特点是：

三个茎区形成局部的双链结构；其中含13个保守的核苷酸，N代表任何核苷酸。

生物学意义：

（1）突破了酶的概念.是一种自体催化；

（2）揭示了内含子自我剪接的奥秘；促进了RNA的研究；

（3）为生命的起源和分子进化提供了新的依据。

第4章生物信息的传递（下）-从RNA到蛋白质

1.遗传密码是怎样被破译的？

答：

1954年G.Gamov对破译密码首先提出了设想。

蛋白质中的氨基酸序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的。

mRNA中只有4种核苷酸，而蛋白质中有20种氨基酸。

用核苷酸的插入和删除实验证明mRNA模板上每3个核苷酸组成一个密码子。

最后，通过“核酸的人工合成、核糖体结合技术和体外翻译系统的建立”三个突破性的工作，验证了假想，实现了遗传密码的破译。

2.遗传密码有哪些特性？

简述密码兼并性的生物学意义。

答：

（1）密码的连续性，密码之间无间断也没有重叠；

（2）密码的简并性，许多氨基酸都有多个密码子；（3）密码的通用性和特殊性，遗传密码无论在体内还是在体外，无论是对病毒、细菌、动物还是植物而言都是通用的，但是也有少数例外；（4）密码子和反密码子的相互作用。

3.有几种终止密码子？

它们的序列和别名是什么？

答：

3种，UAA、UAG和UGA，别名是无意义密码。

4.tRNA在组成和结构上有哪些特点？

答：

（1）tRNA中含有稀有碱基,除ACGU外还含有双氢尿嘧啶、假尿嘧啶等；

（2）tRNA分子形成茎环节构；（3）tRNA分子末端有氨基酸臂；（4）tRNA分子序列中很有反密码子。

5.简述摆动学说。

答：

1966年，Crick根据立体化学原理提出摆动学说，解释了反密码子中某些稀有成分的配对。

摆动学说认为，在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，因而使某些tRNA可以识别1个以上的密码子。

认为除A-U、G-C配对外，还有非标准配对，I-A、I-C、I-U，并强调密码子的5’端第1、2个碱基严格遵循标准配对，而第3个碱基可以非标准配对，具有一定程度的摆动灵活性。

6.tRNA是如何转运活化的氨基酸至mRNA模板上的？

答：

三叶草型的tRNA具有两个关键部位：

3’端的CCA，能接受氨基酸，形成氨酰-tRNA；位于套索中央的三联反密码子环，作为与mRNA的结合部位。

凭借自身的反密码子与mRNA链上的密码子相识别，把3’端所带的氨基酸放到肽链的一定位置。

7.原核与真核生物的核糖体组成有哪些异同点？

答：

（1）真核细胞中的核糖体数量多于原核；

（2）真核细胞中核糖体RNA占细胞中总RNA的量少于原核；（3）原核生物的核糖体通过与mRNA的相互作用，被固定在核基因组上，真核生物的核糖体则直接或间接的与细胞骨架有关联或者与内质网膜结构相连；（4）原核生物核糖体由约RNA占2/3及1/3的蛋白组成，真核生物核糖体中RNA占3/5，蛋白质占2/5。

8.核糖体有哪些活性中心？

答：

核糖体包括多个活性中心，即

（1）mRNA结合部位，

（2）结合或接受AA-tRNA部位，（3）结合或接受肽酰-tRNA部位，（4）肽基转移部位，（5）形成肽键的部位，（6）还有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。

9.真核生物与原核生物在翻译的起始过程中有哪些区别？

答：

（1）原核生物的起始tRNA是fMet-tRNA，真核生物是Met-tRNAMet。

（2）原核生物中30S小亚基首先与mRNA模版相结合，再与fMet-tRNA结合，最后与50S大亚基结合。

而在真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模版mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80S.mRNA.Met-tRNAMet起始复合物。

10.链霉素为什么能够抑制蛋白质的合成？

答：

链霉素是是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12，可以多种方式抑制原核生物核糖体，能干扰fMet-tRNA与核糖体的结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，也会导致mRNA的错读。

11.哪些抗生素只能特异性地抑制原核生物核糖体？

哪些只能作用于真核生物核糖体？

哪些既能抑制原核生物核糖体又能抑制真核生物核糖体？

答：

（1）氯霉素、四环素、红霉素、青霉素、链霉素和卡那霉素只与原核细胞核糖体发生作用；

（2）白喉霉素、放线菌酮和蓖麻毒素只能作用于真核生物核糖体；（3）潮霉素和嘌呤霉素既能与原核细胞核糖体结合，又能与真核生物核糖体结合。

12.什么是分子伴侣？

有哪些重要功能？

答：

分子伴侣（molecularchaperone）是指一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份。

目前认为分子伴侣至少有两类：

热休克蛋白家族和伴侣素。

13.什么是信号肽？

它在序列组成上有哪些特点？

有什么功能？

答：

绝大部分被运入内质网腔的蛋白质都带有一个信号肽，该序列常常位于蛋白质的氨基端，长度一般都在13-16个残基，有如下三个特征：

（1）一般带有10-15个疏水残基；

（2）在靠近该序列N端常常带有一个或者数个带正电荷的氨基酸；（3）在其C端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸。

功能：

完整的信号肽是保证蛋白质转运的必要条件。

14.简述叶绿体蛋白质的跨膜运转机制（上课没讲，参考）。

答：

（1）活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内；

（2）叶绿体膜能够特异性的与叶绿体蛋白的前体结合；（3）叶绿体蛋白质前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不同而表现出明显的差异；

15.蛋白质有哪些翻译后的加工修饰？

其作用机理和生物学功能是什么？

答：

（1）氨基端和羧基端的修饰；

（2）共价修饰：

磷酸化、糖基化、羟基化、二硫键的形成；（3）亚基的聚合；（4）水解断链，切除新生肽中非功能片段。

16.什么是核定位序列？

其主要功能是什么？

答：

核定位序列：

蛋白质的一个结构域，通常为一短的氨基酸序列，它能与入核载体相互作用，使蛋白能被运进细胞核。

在绝大多数多细胞真核生物中，每当细胞发生分裂时，核膜被破坏，等到细胞分类完成后，核膜被重新建成，分散在细胞内的核蛋白必须被重新运入核内，为了核蛋白的重复定位，这些蛋白质中的信号肽----被称为核定位序列。

v17.什么是信号序列？

其序列组成有哪些特点？

主要功能是什么？

答：

绝大部分被运入内质网腔的蛋白质都带有一个信号肽，该序列常常位于蛋白质的氨基端，长度一般都在13-16个残基，有如下三个特征：

（1）一般带有10-15个疏水残基；

（2）在靠近该序列N端常带有一个或者数个带正电荷的氨基酸；（3）在其C端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸。

功能：

完整的信号肽是保证蛋白质转运的必要条件。

生科161第五章作业

1.试述基因克隆载体应具备的条件，并举例说明质粒载体的发展过程。

答：

作为克隆载体最基本的要求：

①具有自主复制的能力；②携带易于筛选的选择标记；③含有多种限制酶的单一识别序列，以供外源基因插入；④除保留必要序列外，载体应尽可能小，便于导入细胞和进行繁殖；⑤使用安全。

构建载体时，通常需选择适当质粒、病毒或染色体复制子作为基础序列，删除其中非必需序列，然后插入或融合选择标记序列。

保留一些限制酶的切点作为外源DNA插入位点。

比如pBR322具有抗氨苄青霉素和四环素的功能，经过改造的pUC系列的质粒载体集中了当时载体的诸多优点。

包括4个部分：

①来自pBR322的复制起点（ori）；②氨苄青霉素抗性基因（ampr）；③大肠杆菌乳糖操纵子的调节基因（laci）启动子（Plac）和β半乳糖苷酶的α-肽（lacZ）；④位于lacZ基因中靠近5′端的一段多接头，或称为多克隆位点（MCS）。

2.说出基因组DNA文库和cDNA文库的主要区别？

答：

基因组DNA是把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物细胞形成克隆。

应用：

主要用于基因组作图、测序和克隆序列的对比。

cDNA文库是以mRNA为模版反转录而成的序列，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增。

应用：

筛选目的基因、大规模测序、基因芯片杂交等功能基因组学的研究。

3.cDNA合成时的方向性是如何实现的?

答：

cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。

第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA，有反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是oligodT。

第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。

4.说说用polyATtract分离mRNA的主要过程。

答：

mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。

利用mRNA的PolyA结构，试剂盒提供一种生物素化寡聚dT引物，与PolyA杂交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的杂交体，然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用以链抗生物素-顺磁颗粒（SA-PMPs）结合杂交体，形成生物素化寡聚dT-mRNA-SA-PMPs复合物，再利用磁性吸附作用以磁性条吸附复合物中的SA-PMPs颗粒，最后利用高严紧度盐溶液中分子杂交体磁性减弱，杂交体中生物素化寡聚dT引物与mRNA分离，从而纯化得到mRNA。

5.说说cDNA差示分析法的原理和主要实验流程。

答：

cDNA差示分析法（representationaldifferenceanalysis,RDA）充分发挥了PCR能以指数形式扩增双链DNA模板，仅以线形形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片断。

主要包括以下几个步骤：

（1）cDNA模板制备；

（2）用DPnII和Sau3A分别消化两组的cDNA，再接上接头R（adaptorR），经补平末端后作为下一步PCR扩增的模板；（3）加入根据adaptorR序列设计的一对引物，利用PCR技术使两组的cDNA片段得以富集后，再用DpnII或Sau3A去除cDNA两端的adaptorR，完成下一步杂交反应的driver的cDNA样品已制备完成；（4）消减杂交；（5）利用PCR反应使tester的特异基因得以富集；（6）PCR反应产物中加入大豆核酸酶以特异性去除单链DNA；（7）DPI经DpnII消化后再接上另一接头N后，按照1:

800的比例与第三步所得drivercDNA混合，进行充分的杂交反应；重复步骤4~6，便可得到DPII，按照类似的方法可获得DPIII；（8）纯化回收DPIII，克隆入puc19载体，利用蓝白斑进行阳性克隆筛选，再结合菌落斑点杂交技术，剔除含相同插入片段的重组子。

6.说说Gateway大规模克隆技术原理及基本操作流程。

答：

Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的位点特异性的重组整合与切出反应。

整合反应是由Int（integrase）和IHF（IntegrationHostFactor）催化的。

attB和attP之间的重组整合的噬菌体基因组DNA的5’和3’端含有attL和attR位点。

切出的重组反应需要IHF,Int和Xis蛋白的参与。

在插入E.coli基因组DNA的噬菌体基因组DNA的5’和3’端的attL和attR位点发生位点特异性的重组，重新再形成lambdaDNA的attP位点和E.coli基因组DNA的attB位点。

相对酶切构建载体来说，该技术具有需时短、操作简单、易于各实验室交流的特点，即只需通过简单、高效的BP和LR反应就可实现把PCR产物定向转入克隆质粒和表达质粒，实现PCR产物在各种质粒间的转移。

7.说说基因图位克隆的原理和过程。

答：

基因图位克隆也称染色体步移（Chromosomewalking）是用以鉴定已经克隆的特定DNA片段（已知序列）侧翼顺序的方法。

从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠顺序和染色体的其他顺序。

从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段，等于在染色体上移了一步，故称之为染色体步移（ChromosomeWalking）。

8.说出基因组与蛋白质组的主要差别。

答：

基因组DNA非常庞大，高等生物虽然拥有3-5万多个基因，而且含有大量重复序列，无论用电泳分离技术还是杂交方法都难以直接分离到靶基因片段。

蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。

基因组恒定，蛋白质组可变。

9.说出蛋白质质谱技术的主要原理。

答：

质谱方法（MassSpectroscope,MS）是通过正确测定蛋白质分子的质量而进行蛋白质分子鉴定、蛋白质分子的修饰和蛋白质分子相互作用的研究。

其基本原理包括：

（1）.将不同形态的样品（汽、液、固相）导入质谱仪；

（2）样品分子在离子源内游离（ionization）成气相的离子形式；（3）.根据质荷比（m/z:

masstochargeratio）不同分离各个样品离子；（4）各样品离子到达侦测器被侦测出来；（5）.在资料处理系统中，离子侦测信号被转化为可读或图谱方式呈现出来。

10.说说蓝白斑筛选的分子机制。

答：

蓝白斑筛选就是利用α-互补（alphacomplementation）：

pUC质粒带有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的一个片段LacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶的一个片段，而宿主细胞能编码与这个片段互补的β-半乳糖苷酶的另一部分，实现互补，形成完整的β-半乳糖苷酶，此酶能分解发色底物X-gal，形成蓝色菌落。

当外源基因插入后，LacZ基因被破坏，不能合成完整的β-半乳糖苷酶，因此不能分解底物X-gal，菌落成白色。

11.已知一个cDNA3’端的部分序列,请设计实验流程得到该基因的全长cDNA。

答：

RACE（rapid-amplificationofcDNAends）技术是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端的方法。

已知一个cDNA3’端的部分序列，可以根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。

可以举一个具体例子阐述。

12.简述Southern杂交的原理，并举例说明应用。

答：

Southern印迹法（Southernblotting）:

DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交，被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。

以DNA-DNA杂交为例，主要包括：

（1）DNA样品经限制性内切酶降解；

（2）琼脂糖凝胶电泳进行分离；（3）凝胶浸泡在碱（NaOH）溶液中使DNA分子变性；（4）把变性的DNA转移到硝酸纤维素膜上（硝酸纤维素膜只吸附变性DNA）；（5）80℃烘烤4～6h，使DNA牢固地吸附在硝酸纤维素膜上。

（6）与放射性同位素标记的变性后的DNA探针（probe）进行杂交（杂交须在较高的盐浓度及适当的温度（一般68℃）下进行数小时或十余个小时）；（7）洗涤除去未杂交上的标记物；（8）硝酸纤维素膜烘干后进行放射自显影。

13.简述DNA双脱氧法测序的原理。

答：

1977年Sanger建立了双脱氧测序法（dideoxymethod），又称酶法（enzymemethod），其原理是利用2′，3′-双脱氧三磷酸核苷（2′，3′-ddNTP）来终止DNA的复制反应。

大肠杆菌DNA聚合酶I（或K1enow片段）在DNA复制中催化多核苷酸链的延伸，单核苷酸是接在延伸链的3′-OH上。

1977年Sanger建立了双脱氧测序法（dideoxymethod），又称酶法（enzymemethod），其原理是利用2′，3′-双脱氧三磷酸核苷（2′，3′-ddNTP）来终止DNA的复制反应。

大肠杆菌DNA聚合酶I（或K1enow片段）在DNA复制中催化多核苷酸链的延伸，单核苷酸是接在延伸链的3′-OH上。

反应后，在加入2′，3′-ddATP的反应中，凡需要dATP时，如果掺入的不是dATP，而是2′3′-ddATP时，链延伸反应即停止。

用变性测序凝胶电泳分析这四组反应的产物，即可从放射自显影片上直