校创结题报告1.docx

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校创结题报告1

报告正文

本资助项目的主要研究内容如下：

（一）兴安落叶松MurE基因的克隆：

根据大肠杆菌、蓝藻、拟南芥、地钱、杨树、小立碗藓和水稻MurE基因的氨基酸序列相似性比对的结果，在其保守区域设计了一对兼并引物（degMurE/F:

GGIACIRAYGGIAARACIACIAC,degMurE/R:

TGRTAIKYYTCRTGICCYTTICC），然后利用兼并PCR扩增得到了1131bp的兴安落叶松MurE基因的中间片段；根据所获得的兴安落叶松MurE基因的中间片段设计引物，利用末端克隆的方法获得了该基因的5’末端和3’末端序列；在5’末端和3’末端设计引物扩增得到了该基因的cDNA全长。

图1显示的是兼并PCR、3’RACE-PCR、5’RACE-PCR和全长cDNA序列扩增产物的电泳图。

M为DNAMark，P为兼并PCR产物，P1为嵌套式PCR使用外侧引物获得的产物，P2为使用内侧引物获得的产物，1为LgMurE全长cDNA扩增产物。

箭头指示的条带为目的产物。

图1兴安落叶松（Larixgmelinii）MurE基因（LgMurE）的克隆

（二）兴安落叶松MurE基因序列分析：

所克隆的兴安落叶松LgMurE基因cDNA序列全长为2868bp，编码787个氨基酸（图2）。

兴安落叶松MurE与大肠杆菌、蓝藻、小立碗藓、拟南芥及水稻MurE基因保守区域（不包括N末端）的序列比对结果见图3。

图2LgMurE基因cDNA全长及其所编码的氨基酸序列

小写字母代表非翻译区，大写字母代表开放阅读框（ORF），蓝色字母代表氨基酸

图3LgMurE与大肠杆菌、蓝藻、小立碗藓、拟南芥及水稻MurE序列比对结果

基因相似性调查的结果显示兴安落叶松的MurE基因与小立碗藓、拟南芥、杨树、水稻等植物的MurE基因具有较高的相似性（52-65%），和蓝藻及细菌的MurE基因的相似性较低（37-42%）（见下表）。

使用杨树、拟南芥、水稻、小立碗藓、大肠杆菌和蓝藻的MurE氨基酸序列全长构建系统树，对其进化关系进行了分析，结果显示，该基因在进化上位于苔藓和高等植物之间，和植物的进化历程相对应（图4）。

图4MurE基因的系统进化树

（三）兴安落叶松LgMurE蛋白的亚细胞定位预测：

利用TargetP（http//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）基于蛋白质N末端转运肽信息发展的软件对兴安落叶松LgMurE氨基酸的全长序列进行分析，其N端48aa的区域被预测为向叶绿体移行的转运肽。

本结果结合其与拟南芥、小立碗藓MurE基因的相似性分析的结果，可以初步断定LgMurE蛋白定位于叶绿体。

图5为LgMurE蛋白亚细胞定位预测的结果。

图5LgMurE的亚细胞定位预测

（四）兴安落叶松LgMurE基因表达特性分析：

为了调查兴安落叶松LgMurE基因的表达特性，我们克隆了作为分子内标的肌动蛋白基因（cDNA和基因组DNA）序列，并对其基因结构、系统发育关系进行了分析。

该项研究成果已经写成论文《兴安落叶松肌动蛋白基因的分离与序列分析》，被刊登在2011年7月26日出版的《生物技术通报》杂志上。

另外，我们以肌动蛋白基因作为内参，利用半定量PCR的方法调查了LgMurE基因在兴安落叶松根、茎、叶等各个器官中表达量，结果显示该基因表达在根、茎、叶等各个器官，其在叶中的表达量最高，预示着该基因作用于叶绿体的分裂或发育（图6）。

图6LgMurE在兴安落叶松根、茎、叶中的表达量

（五）小立碗藓遗传转化用载体的构建及遗传转化：

为转化小立碗藓，我们构建了两个遗传转化载体：

pUC18-LgMurETP:

GFP和pTFH22.4-LgMurE-GFP，分别用于LgMurE蛋白的亚细胞定位分析和LgMurE与小立碗藓MurE基因（PpMurE）的功能互补性分析。

pUC18-LgMurETP:

GFP的构建：

如图7所示，以LgMurEcDNA为模板，通过PCR扩增其5’末端包含转运肽的cDNA序列，长度为333bp，将其命名为TP（TransitPeptide）。

用NcoI分别酶切pUC18-GFP载体和TP片段，载体去磷酸化后与TP序列连接，构建pUC18-LgMurETP:

GFP。

图7为该载体的构建策略，图8为所构建pUC18-LgMurETP:

GFP载体的菌落PCR检测的结果。

图7pUC18-LgMurETP:

GFP载体的构建策略  

图8pUC18-LgMurE:

GFP载体的菌落PCR检测

pTFH22.4-LgMurE-GFP的构建：

使用PrimeSTARHS扩增出平滑末端的LgMurEcDNA全长序列，并对其5’端进行磷酸化。

用SmaI酶切质粒pTFH22.4，对酶切后的载体去磷酸化后与磷酸化的LgMurE片段连接，构建成质粒pTFH22.4-LgMurE-GFP。

图9为载体的构建策略，图10为酶切检测的结果。

图9pTFH22.4-LgMurE-GFP的构建策略

图10pTFH22.4-LgMurE-GFP的酶切检测

遗传转化结果：

利用pUC18-LgMurETP:

GFP转化小立碗藓的结果证实兴安落叶松的MurE蛋白定位于叶绿体上，可断定其与叶绿体的发育或分裂相关。

图11兴安落叶松LgMurE基因在小立碗藓中的表达

（六）拟南芥遗传转化用载体的构建及遗传转化：

构建遗传转化载体pBI01-LgMurE，通过农瘤杆菌介导拟南芥的遗传转化，将LgMurE基因转化到拟南芥的AtMurE变异体中，旨在调查兴安落叶松LgMurE基因与拟南芥MurE基因（AtMurE）的功能互补关系。

遗传转化载体的构建：

根据所分离的兴安落叶松MurE基因的cDNA序列设计引物，以其全长cDNA为模板，利用高保真酶TransStartTaqDNApolymerase扩增其ORF区域并在其两端连接XbaI和BamHI的酶切位点（图12），将目的产物通过双酶切后连接到载体pBI101中，构建载体pBI101-LgMurE（图13,14,15），用于转化拟南芥AtMurE变异体。

图12LgMurE基因ORF区域的PCR扩增电泳结果

M：

200bpDNAMarker，1：

PCR结果

图13pBI101-LgMurE载体的构建策略

图14菌落PCR鉴定结果   图15重组质粒的酶切鉴定

拟南芥的遗传转化：

将所构建的质粒pBI101-LgMurE转化的农瘤杆菌，并通过花絮浸染法进行了拟南芥的遗传转化。

其结果证实兴安落叶松的LgMurE基因能够弥补由于拟南芥AtMurE变异所造成的白化缺陷，进而说明兴安落叶松的LgMurE蛋白具有控制叶绿体发育的功能。

图16和图17分别为转化植株的表型调查及表达检测的结果。

图16野生型、纯和MurE突变体、杂合MurE突变体和LgMurE转化体的表型特征

图17拟南芥AtMurE变异体的检测及转化LgMurE基因的表达

WT：

野生型、Hom：

纯合突变体、Het：

杂合突变体、T1：

纯和突变体的LgMurE转化植株、T2-3：

杂合突变体的LgMurE转化植株、T4-5:

野生型的LgMurE转化植株

（七）LgMurE基因在兴安落叶松中的功能分析：

构建正向和反向LgMurE遗传转化载体，通过转化兴安落叶松的方法调查LgMurE基因在裸子植物兴安落叶松中的功能。

遗传转化载体的构建：

我们构建了两种类型的遗传转化载体，pUC18-LgMurE-HPT-GFP（Sense/Antisense）和pTFH22.4-LgMurE（sense/antisensen）用于兴安落叶松的遗传转化。

将我们之前用于转化兴安落叶松的质粒pUC18GGH用内切酶SmaI和SacI切除Gus基因后进行平滑化及去磷酸化处理。

将用高保真酶扩增的LgMurEORF的片段进行平滑化和磷酸化后和以上平滑化处理的载体连接，构建pUC18-LgMurE-HPT-GFP（Sense/Antisense）（图18）。

图18pUC18-LgMurE-HPT-GFP（Sense/Antisense）载体的构建策略

使用PrimeSTARHSDNApolymerase扩增出平滑末端的LgMurEcDNA全长序列，并对其进行磷酸化处理。

用SmaI酶切质粒pTFH22.4，产生平末端。

对酶切后的载体去磷酸化后与磷酸化处理的LgMurE连接（图19），构建成质粒pTFH22.4-LgMurE（sense/antisense）。

图19pTFH22.4-LgMurEsense\antisensen的构建策略

兴安落叶松的遗传转化：

利用申请者在以前的研究中建立的使用基因枪技术进行兴安落叶松遗传转化的方法进行了转化实验，目前正处于转化体的筛选和表型检测阶段。

另外，我们利用所构建的载体中含有GFP基因这一特点，使用PEG-法介导兴安落叶松原生质体的遗传转化，但由于原生质体分离过程中的产量较低，未能取得较好的实验效果。

（八）国际交流：

我们按计划于2010年6月邀请了日本国立熊本大学的高野博嘉教授来我校进行了为期一周的学术交流，高野教授为我们介绍了他们对于叶绿体分裂相关基因研究的最新成果，并对今后在本研究领域的合作计划进行了探讨；项目负责人与2012年2月访问了日本国立熊本大学高野博嘉教授的研究室，并进行了为期一个月的合作实验。

（九）学术会议及研究生培养：

我们按计划参加了2次在国内举办的国际学术会议（2011年在兰州举办的第二届国际整合生物学研讨会；2012年在苏州举办的第31届国际生物科学及生物产业大会），发表学术会议摘要5篇。

本基金资助下我们培养硕士研究生6人（毕业1人，在读5人），名单如下：

朱雯雯（2008级）、王丽（2010级）、李宁宁（2011级）、李倩（2011级）、马钰琨（2012级）、陈凌（2012级）。

完成标注基金资助已被录用的学术论文2篇。

附.发表的学术论文及国际学术会议摘要

1．朱雯雯、林晓飞（通讯作者）、张文波、许月英、高野博嘉，兴安落叶松肌动蛋白基因的分离与序列分析，生物技术通报，（2011）7:

95-100.

2.王丽，黎妃凤，张文波，陈贵林，林晓飞（通讯作者）西伯利亚白刺肌动蛋白基因的分离与特性分析，草业学报，（2012）21（4）:

151-158.

3.CloningandCharacterizationofLarixgmeliniiMurEGene.2ndInternationalSymposiumonIntegrativePlantBiology,Lanzhou,2011,p108.

4.MolecularCloningandCharacterizationofVacuolarNa+/H+AntiporterfromNitrariasibiricaPall.2ndInternationalSymposiumonIntegrativePlantBiology,Lanzhou,2011,p77.

5.CharacterizationandfunctionalidentificationofVacuolarNa+/H+AntiporterfromNitrariasibiricaPall.31stIUBSGAandConferenceofBiologicalScienceandBioindustry,Suzhou,2012,P97.

6.IsolationandcharacterizationoftheLarixgmeliniiUGDHgene.31stIUBSGAandConferenceofBiologicalScienceandBioindustry,Suzhou,2012,P107.

7.CloningandCharacterizationofLarixgmeliniiMurEGene.31stIUBSGAandConferenceofBiologicalScienceandBioindustry,Suzhou,2012,P99