人源杀菌肽.docx

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人源杀菌肽

人源杀菌肽

　　编者按：

本文主要从引言；材料和方法；结果；讨论，对人源杀菌肽进行讲述。

其中，主要包括：

人类惟一的cathelicidingene所编码的蛋白质为hCAP18,LL37是Cthelincidin蛋白hCAP18C端的37个氨基酸片段,为×103的阳离子两性分子α螺旋抗菌肽，其氨基酸残基序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES、材料BL21star菌、pET30a，pMD18T和鼠抗6×HismAb购自ROCHE公司；DH5α菌由本研究所保存；ExTaq，SacⅠ，HindⅢ，Fxa裂解试剂盒购自TaKaRa公司；6×His亲和纯化TALON柱芯及强离子交换柱芯MacroPrepHighS分别购自Clontech公司和BioRad公司；改良杀菌肽LL37的DNA序列为本所构建.、1rLL37多肽融合表达质粒的构建将本所已构建的改良杀菌肽LL37的DNA序列经17g/L凝胶电泳、纯化，以连接试剂盒连接入pMD18T载体并转入感受态DH5a菌中，铺LB板进行蓝白斑筛选，测序正确的单菌落进行扩增、抽质粒，并进行双酶切和凝胶电泳、纯化、临床抗生素的广泛大量使用，导致严重的致病菌耐药性问题.杀菌肽为一类广泛存在于许多生物中的内源性杀菌多肽.其作用特点在于既不容易导致耐药菌株的产生，又具有广谱抗微生物作用，因而具有极高的应用价值，具体材料请详见：

　　【关键词】人源杀菌肽LL

　　【摘要】目的：

将改良LL37多肽以融合肽形式表达、纯化，并初步研究其杀菌活性.方法：

将编码改良的LL37多肽的DNA序列放入载体pET30a，转入工程菌BL21star中，用IPTG诱导表达得到含6×His标记的改良融合蛋白LL37.再以TALON柱芯亲和层析、SDSPAGE和Westernblot鉴定后，用FXa裂解融合肽.将裂解后多肽进一步用强阳离子交换柱MacroPrepHighS纯化、收集各洗脱峰,脱盐、冻干.采用抑菌圈法检测改良LL37的抗菌活性.结果：

改良的LL37多肽于载体pET30a在杆菌BL21star中高效融合表达，用凝胶扫描显示融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的35％.融合蛋白经纯化后用SDSPAGE鉴定在Mr4000处见单一条带.经抑菌圈法检测改良的LL37多肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很好的杀菌力.结论：

改良的人源性LL37多肽以原核细胞进行融合表达是可行的，并具有较强的杀菌活性.

　　【关键词】人源杀菌肽LL37；蛋白质融合表达；杀菌活性

　　0引言

　　人类惟一的cathelicidingene所编码的蛋白质为hCAP18,LL37是Cthelincidin蛋白hCAP18C端的37个氨基酸片段,为×103的阳离子两性分子α螺旋抗菌肽，其氨基酸残基序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES［1-2］.LL37抗菌力较昆虫细胞源性抗菌肽的杀菌力弱.最新分离出恒河猴的同源蛋白RL37与LL37同源性很高,其净正电荷为+8,而LL37为+，RL37的抗菌活性要高于LL37［3-4］.

　　根据SAR研究显示所有α螺旋抗菌肽的抗菌活性和抗菌普与肽链中所带正电荷、疏水性氨基酸数目密切相关，通过分子改造增加LL37肽链中正电荷的氨基酸和碱性氨基酸数目，而不改变其α螺旋构象来提高其抗菌活性是一种较好的途径［5-6］.本实验室对LL37进行改良，将Glu16,Asp26,Glu36分别替换为Gln16，Asn26，Gln36，净电荷由+提高至+9.经PCR获得编码改良LL37的DNA全长基因片段，并且所设计的DNA序列中其引导序列含有凝血因子Xa酶切位点和带负电荷的承载蛋白.我们通过构建适宜的表达载体、采用融合肽形式以大肠杆菌表达rLL37，将其克隆到含有6×His的特异亲和纯化标志序列的表达载体PET30a中，从而在中表达出能被正确切割产生有抗菌活性的融合蛋白［7-8］.

　　1材料和方法

　　材料BL21star菌、pET30a，pMD18T和鼠抗6×HismAb购自ROCHE公司；DH5α菌由本研究所保存；ExTaq，SacⅠ，HindⅢ，Fxa裂解试剂盒购自TaKaRa公司；6×His亲和纯化TALON柱芯及强离子交换柱芯MacroPrepHighS分别购自Clontech公司和BioRad公司；改良杀菌肽LL37的DNA序列为本所构建.

　　方法

　　多肽融合表达质粒的构建将本所已构建的改良杀菌肽LL37的DNA序列经17g/L凝胶电泳、纯化，以连接试剂盒连接入pMD18T载体并转入感受态DH5a菌中，铺LB板进行蓝白斑筛选，测序正确的单菌落进行扩增、抽质粒，并进行双酶切和凝胶电泳、纯化.纯化后的目的片段与同样处理的载体pET30a+连接，转入DH5a菌，铺LB板进行抗性筛选，将单菌落进行扩增后抽提质粒、PCR鉴定及测序鉴定.

　　表达条件及产物的亲和纯化将鉴定正确的融合蛋白表达质粒PET30a电转化入工程表达菌BL21star，挑取Kan抗性菌落，扩大培养于含30mg/LKan的LB培养基中,37℃振荡培养至A600nm为～时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导表达8h，14000g离心5min收集菌体，超声破碎细胞包涵体，21000g离心20min.离心后上清可溶性蛋白经TALON柱芯亲合纯化，沉淀包涵体蛋白经6mol/L的盐酸胍溶解后经TALON柱芯亲合纯化，将可溶性蛋白及溶解后的包涵体分别以5mmol/L的咪唑洗涤杂蛋白，然后用150,300,500mmol/L的咪唑梯度洗脱目的蛋白，少量多次纯化,收集主峰，脱盐、冷冻干燥后得融合蛋白.

　　、染色按分子克隆第三版进行，用蛋白质银染液染色.

　　分析以抗6×His单克隆抗体为一抗、HRP羊抗鼠IgG单抗为二抗，并以DAB显色.

　　溶合蛋白的FXa裂解参考文献［7］的方法，将融合蛋白溶于FXa裂解缓冲液中，加入FXa，28℃保温10h.

　　多肽的离子交换纯化、分子量测定将FXa裂解后的蛋白以强离子交换柱芯MacroPrepHighS进行梯度纯化，条件为：

平衡液10mmol/LNaCl,洗脱ABCD液分别为220，350，500及1000mmol/LNaCl，收集各洗脱峰，脱盐、低温低压冻干.以Folin酚法测定蛋白质含量，并进行SDSPAGE初步鉴定rLL37的纯度，依靠蛋白质在电泳中的移动距离与其分子量的对数成反比的关系，测定蛋白质Marker的各个条带的距离，与其分子量的对数建立一元线性方程，通过测定rLL37的电泳移动距离，计算出rLL37的相对分子量.

　　用抑菌圈试验测定rLL37多肽杀菌活性参照文献［4-5］的方法,将15g/L的底层营养琼脂培养基融化后取10mL倒入无菌平皿中，凝固后取7g/L的温度为45℃的琼脂培养基12mL，加入对数生长期的细菌旋涡振荡［终浓度×105］，快速覆盖在底层胶上，凝固后在上层琼脂上打孔，把一定浓度的rLL37多肽10μL滴入孔中,37℃孵育过夜.抑菌活力以抑菌圈直径表示.同时取生理盐水及Amp，左氧氟沙星等作对照.

　　2结果

　　多肽融合表达质粒的构建改良杀菌肽LL37的DNA序列成功转入表达载体pET30中.抽质粒及PCR鉴定目的片段分子量大小正确，目的DNA序列经公司测序鉴定,证实rLL37基因正确地接入pET30a质粒.

　　图1构建rLL37多肽融合表达质粒流程图

　　2．2rLL37多肽的融合表达重组的表达质粒电转化入工程表达菌BL21star中，挑选抗Kan的阳性转化子经IPTG诱导8h，经浓缩胶40g/L,分离胶150g/LSDSPAGE，蛋白质银染染色，在蛋白质Mr约15×103处可见一条明显条带.用凝胶扫描显示重组融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的35％.重组融合蛋白主要以包涵体蛋白形式存在，少量以可溶性蛋白形式存在.将可溶性蛋白和溶解后包涵体蛋白过6×His亲和纯化TALON柱心，经150mmol/L的咪唑洗下一个宽大的B峰，在300mmol/L的咪唑洗下一个较小的C峰.

　　图2含目的片段质粒pET30a的鉴定

　　图3rLL37在大肠杆菌中融合表达SDSPAGE分析

　　将6×HisTALON亲和纯化收集的B，C峰蛋白脱盐、冻干后进行免疫印迹鉴定，B峰在Mr约15×103处可见一条染浅棕色条带，可证实B峰含有目的LL37片段.

　　2．4rLL37多肽的离子交换纯化将6×HisTALON亲和纯化收集的B峰用FXa裂解后，经MacroPrepHighS强阳离子柱纯化，在350mmol/LNaCl洗脱峰经SDSPAGE，约在Mr约4000处可见单一的蛋白条带，与rLL37多肽的理论相符.共获得约，其制备率约为/L.

　　多肽的杀菌活性检测用抑菌圈法证实rLL37肽抗生素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很好的抑菌力.测得rLL37对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径18mm，Amp对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径8mm，rLL37对金黄色葡萄球菌的抑菌作用明显优于Amp；rLL37对粪肠球菌的抑菌作用也较左氧氟沙星好.

　　图4蛋白质免疫印记

　　图5FXa裂解、纯化后重组rLL37的SDSPAGE分析

　　3讨论

　　临床抗生素的广泛大量使用，导致严重的致病菌耐药性问题.杀菌肽为一类广泛存在于许多生物中的内源性杀菌多肽.其作用特点在于既不容易导致耐药菌株的产生，又具有广谱抗微生物作用，因而具有极高的应用价值.在肽抗生素的开发研究中,显然人体基因编码的肽抗生素具有更大的优越性.人体基因编码的肽抗生素为人体正常物质,他的杀菌机制不同于抗生素,产生抵抗性的可能性较小,而且他不含半胱氨酸合成较容易.目前国内外学者一方面研究人体内LL37多肽的分布范围及其与感染的关系，如皮肤、气管、肠道、鼻泪管等处的LL37含量与感染程度的关系，充分揭示了LL37对人体的保护作用，除了抗菌、拮抗内毒素作用外,通过激活细胞因子趋化免疫相关细胞等方式来增强机体获得性免疫；另一方面运用氨基酸合成仪制备杀菌肽，并将肽链中的部分氨基酸残基进行替换，以增强LL37多肽的杀菌力和拮抗内毒素的能力［5，9］.

　　图6rLL37对金黄色葡萄球菌株杀菌实验

　　现在有许多载体用来在细菌中快速而有效地表达重组蛋白，我们采用含有6×His的特异亲和纯化标志序列的PET融合表达载体，将rLL37基因与6×His融合，并用蛋白质等电点分析软件比较我们的rLL37基因融合表达载体与PET系列，如PET28a，PET30a等重组后的等电点，结果与PET30a重组后的静电荷最小，有利于亲和纯化.具有抗菌活性的肽抗生素在中直接表达时面临两个难题:

一是肽抗生素对原核细胞具有抑杀作用,不易于用原核表达系统直接表达,其二,肽抗生素为小分子,表达产物不稳定,产量不高［8］.rLL37采用融合肽形式以大肠杆菌表达，在设计的引导序列中含有凝血因子Xa酶切位点，融合有引导序列的rLL37对大肠杆菌无害，细菌能正常生长和表达目的蛋白质，当以Fxa酶切除N端的引导序列，则rLL37的N端碱性多肽区暴露，恢复杀菌力；同时在rLL37多肽的N端加上一个负电荷的多肽，使得整个融合肽的电荷由下的降到，利于TALON柱芯亲和纯化，进一步降低rLL37多肽对BL21star表达菌的损害，提高rLL37多肽表达的产量，其中融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的35％.从而使得rLL37以基因工程制备成为可能，为LL37多肽进一步深入研究奠定基础.

　　【参考文献】

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