禽流感编制说明.docx
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禽流感编制说明
《禽流感病毒分型基因芯片检测操作规程》编制说明
一、任务来源
本标准由国家认证认可监督管理委员会《2007年国家标准制定和修订项目》下达任务，项目序号20072034-T-326，编写单位为中国检验检疫科学研究院。
二、制定本标准的目的和意义
1.禽流感的危害
禽流感是国际兽疫局（OIE）确定的A类动物疫病，并被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。
禽流感的爆发一直是困扰全球养禽业的一个难题，尤其是高致病性禽流感可导致高达100％的发病率和死亡率，并可感染人并致人死亡。
从1959年第一次报道H5亚型的高致病性禽流感暴发以来，高致病性禽流感共有24次较大的流行，其中19次是在家禽中爆发，且每次都带来重大经济损失。
禽流感的暴发几乎波及世界各地。
多个国家先后爆发禽间高致病性禽流感疫情，并且出现人间禽流感疫情，全球共有近400多人感染禽流感，病死率达51.7%。
禽流感的爆发不仅给世界各国的畜牧生产和国际贸易带来了巨大的经济损失，而且严重威胁着人类健康。
截至2008年2月26日，全国有新疆、辽宁、四川、广东、广西、江西、湖南、湖北、浙江、安徽、江苏等省市和地区发生人感染禽流感病事件，导致18人死亡。
对此,各种新闻媒体进行了连篇累牍的报道，香港、澳门等地区高度关注，部分贸易国和地区也采取了相应的限制措施。
禽流感（AvianInfluenza，AI）是由流感病毒属的A型流感病毒（InfluenzavirusA）引起的禽类感染和疾病的总称。
禽流感病毒为正黏病毒科（Orthomyxoviridae）的A型流感病毒，A型流感病毒血清型众多，有16个HA（hemagglutinin）亚型和9个NA（neuraminidase）亚型，其核酸有8个基因组片断，可随机互相交换，因此，抗原变异性强，不断发生抗原飘移和抗原转变，不同亚型、不同分离株病毒的差异很大，低致病性的也有可能转变为高致病性的，宿主范围又广范，各亚型间几乎没有交叉保护性，使得禽流感难以控制和频繁暴发。
目前在全世界各种家禽和野生禽类中，已分离到上千株禽流感病毒。
2.制定禽流感病毒分型基因芯片检测方法标准的背景和要求
禽流感疫情的发生，使各个贸易国家及国际组织极其关注，对我国经济和社会发展造成了重大影响，国家有关领导对禽流感疫情高度重视，在调查了疫情以后，立即采取了相关应急措施，并将此次疫情的发生情况及采取的应急措施向有关贸易国进行了通报，要求加强对禽流感快速检测技术的研究，增加对禽流感的检疫检测，并尽快制订相关的标准，防止禽流感的传入传出。
目前在禽流感检测技术方面的研究已经非常广泛而深入，作为国家标准的诊断技术与检测方法就有13项之多。
但由于禽流感病毒有16个血凝素亚型和9个神经氨酸酶（NA）亚型，现有的标准都只能确定部分血凝素亚型（H5、H7、H9），而无法确定和区分禽流感病毒25个亚型，缺乏更加全面系统的监控禽流感的检测技术。
禽流感病毒分型基因芯片检测技术可同时检测25个亚型，并能较早发现新的流行亚型，起到有效监控禽流感疫情的作用。
目前国内外还没有禽流感病毒的基因芯片检测技术的相关行业标准与国家标准公布，因此，尽快制定禽流感病毒的基因芯片检测技术相关国家标准，规范禽流感病毒快速分型基因芯片检测方法，不仅有助于满足检疫需要，防止禽流感病毒其它亚型传入我国，而且为禽流感有效监控和新流行亚型的检测提供技术储备。
3．有关检测方法的优缺点
禽流感的主要诊断及检测方法主要包括病原学、免疫学、分子生物学三个方面：
AIV的分离和HA/HI试验是经典的实验室诊断方法，结果可靠但时间太长；琼脂扩散（AGP）试验由于具有简便快速的特点，但此法的敏感性较低；中和试验（NT）准确且易操作常用于实验室诊断，但需较长的时间和花费较多的材料；荧光抗体（FA）试验具有快速、简便、易行、较敏感等特点，也常用于临床诊断；免疫酶标记技术（EIA）以酶联免疫吸附试验（ELISA）为主，尽管其重复性和稳定性有待提高，但具有快速、敏感度高（其敏感度要高于AGP试验和HI试验）的特点，常用于大批样品和血清学检测检疫。
禽流感病毒的实时RT-PCR方法也具有快速敏感的特点。
然而，这些方法大多是针对H5N1或H9等几个有限的亚性，这些方法无法实现多个亚型的同时区分与鉴定。
基因芯片技术是20世纪90年代发展起来的融生物学、物理学、化学、计算机科学和微电子学一体的高度交叉的前沿技术。
基因芯片技术不仅具有快速、敏感、特异、高通量和自动化的优点，而且通过计算机软件进行数据处理和结果判定，减少了结果判定受主观因素影响的可能，提高了检测结果的可靠性与稳定性，其独到的优点是一次可同时鉴别诊断多个病毒或者一个病毒的多个亚型，因此，研究快速、敏感、特异的针对禽流感病毒各亚型的检测方法，以满足对禽流感病毒各亚型的检测和监测需要，解决检验检疫重大技术问题，保护我国农牧业生产安全及人体健康、促进国际贸易的顺利发展，防止情流感的传入传出，禽流感病毒快速分型基因芯片检测技术对于禽流感的防控具有重要的现实意义和应用价值。
三、标准制定原则和依据
在编写本标准过程中主要参考OIE公布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》2004年第五版关于2.1.14禽流感的有关章节以及在科研工作中收集的技术资料和国内外禽流感检测方法的相关资料；征求国标编写合作单位上海出入境检验检疫局、广州出入境检验检疫局、中国人民解放军军事科学院等系统内外专家意见并结合科研工作中的实践经验编制而成。
四、主要工作内容和主要试验
1方法
1.1引物设计与合成
根据Genebank中发表的A型流感病毒不同亚型的基因组序列，应用DNAStar、Bioedit、Primer5.0和OMIGA软件分别对其分析筛选，设计了AIV25对特异性引物和1对通用引物,由上海生工合成。
表1A型流感病毒基因芯片多重不对称RT-PCR引物
型别
引物编号
序列（5’～3’）
片段长度
通用
PMA-06001-uf
PMA-06002-ur
TCACTTGCTTCCGTTGAGG
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGT
H1
PMA-06003-H1f
PMA-06004-H1r
TCACTTGCTTCCGTTGAGGGGAGCAATTGAGTTCAGTATC
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGACACTCTCCTATTGTGACTG
601bp
H3
PMA-06005-H3f
PMA-06006-H3r
TCACTTGCTTCCGTTGAGGTGTTACCCTTATGATGTGCC
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCCCTGTTGCCAATTTCAGAG
669bp
H5
PMA-06007-H5f
PMA-06008-H5r
TCACTTGCTTCCGTTGAGGAGTGAATTGGAATATGGTAACTG
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTAACTGAGTGTTCATTTTGTCAAT
380bp
H6
PMA-06017-H6F
PMA-06018-H6R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGAAGGCACTTATTGGRTCAGG
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTCCTCTAGTTTCAATCTGTGG
685bp
H7
PMA-06009-H7f
PMA-06010-H7r
TCACTTGCTTCCGTTGAGGTCAGGWTCTTCWTTCTATGC
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTTCYCCTTGTGCATTTTGATG
641bp
H9
PMA-06011-H9f
PMA-06012-H9r
TCACTTGCTTCCGTTGAGGAAGAGAATGGTCCTACATCGT
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGGATCTTACTCGCAATGTCTG
493bp
N1
PMA-06013-N1f
PMA-06014-N1r
TCACTTGCTTCCGTTGAGGTCCCACTTGGAATGCAGAAC
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCACATGCACATTCAGACTCTTG
328bp
N2
PMA-06015-N2f
PMA-06016-N2r
TCACTTGCTTCCGTTGAGGATAGCATGGTCCAGCTCAAG
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTACATGCTGAGCACTTCCTG
299bp
H2
PMA-06019-H2F
PMA-06020-H2R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGCGTCATTCTTCAGGAACATGG
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGGCCTTGTTGCTATTTCWGG
229bp
H4
PMA-06021-H4F
PMA-06022-H4R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGTTGTTAYCCATTTGATGTGCC
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTRACTCTTCCAGGGTTGTT
324bp
H8
PMA-06023-H8F
PMA-06024-H8R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGAAGGTTGGTCATACATAGTGG
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTCCTCTTACTAATGGTCTGG
444bp
H10
PMA-06025-H10F
PMA-06026-H10R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGGATTGACAAGATAAGCACCGG
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTTTACTYACTCTACTAGGTGCTAT
435bp
H11
PMA-06027-H11F
PMA-06028-H11R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGACTTAGAAATGTCCCAGCAA
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCATTTCCCTCGTCTTTGGC
437bp
H12
PMA-06035-H12F
PMA-06036-H12R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGAGTACAAGAACACCAGAGATT
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCTGGCCATCCGCCTTCTAT
537bp
H13
PMA-06029-H13F
PMA-06030-H13R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGGACCCTTCTGCTCCTCATG
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGAAACTGATTGATTCCCCTGG
474bp
H14
PMA-06037-H14F
PMA-06038-H14R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGTCTCCCGACTAAACTGGCTA
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCTGCCGCTCTGATTCCTTAC
247bp
H15
PMA-06031-H15F
PMA-06032-H15R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGGACTCCTTGACTGAGATCTGG
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTAGTATCACATCTTTGTACCCAC
305bp
H16
PMA-06033-H16F
PMA-06034-H16R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGTAAACTTCTCGTGCTAATCG
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTCTTCAACTTGATCCCTTC
252bp
N3
PMA-06049-N3F
PMA-06050-N3R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGGGGAAAGARTGGATGCATGT
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTTGTTGATTCTCATCCAAGG
366bp
N4
PMA-06039-N4F
PMA-06040-N4R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGGGAAGCAATCGACCATGGAT
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCGACACCCATCCATTAGCAT
260bp
N5
PMA-06051-N5F
PMA-06052-N5R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGACTGTTATTGGGTAATGACG
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTTGCTTGTTTTGGTCCAACCG
459bp
N6
PMA-06041-N6F
PMA-06042-N6R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGACCTAATAACAATGCTTCGG
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCACTCTTCTATATGCTGTGC
246bp
N7
PMA-06043-N7F
PMA-06044-N7R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGTGTGCAGAGATAAYTGGCA
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCCGGAATAGCCTGACCAATT
352bp
N8
PMA-06045-N8F
PMA-06046-N8R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGGGGCAMTGATGTATGGATGG
TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTAAGAATAGCTCCATCGTGCC
340bp
N9
PMA-06047-N9F
PMA-06048-N9R
TCACTTGCTTCCGTTGAGGTTCTATGCTCTCAGCCAAGG
TAMRA--GGTTTCGGATGTTACAGCGTTGGCATACGCATTCAGATTC
310bp
注：
Y=（C,T），W=（A,T），R=（A,G）。
Note:
Y=（C,T），W=（A,T），R=（A,G）
1.2样品的处理
1.3多重不对称扩增方法的建立
1.4基因芯片探针的设计与合成
根据各亚型已扩增的靶序列和Genebank中发表的A型流感病毒不同亚型的序列，应用DNAStar、Bioedit和OMIGA软件，设计了基因芯片分型的52条特异性探针和3条质控探针，并由上海生工生物工程有限公司合成。
1.5基因芯片的制备
1.5.1基因芯片设计方案
本芯片设计的微矩阵为14×9×4阵列（见图1），矩阵设计图包括5个部分：
QC为点样阳性参照，8个重复位点；NC为点样buffer参照，8个重复位点；PC为杂交阳性参照，2个重复位点；N为空白参照，2个重复位点；其它位点为检测探针，25个亚型52条特异性探针，每条探针2个重复位点。
图1芯片点样矩阵图
QC质控探针PC阳性探针NC点样buffer对照N空白对照
DP（H1-16,N1-9）检测探针
1.5.2基因芯片点样
1.6基因芯片杂交与洗涤
1.6.1基因芯片杂交
取杂交缓冲液6μL，1.4中的多重不对称扩增产物5μL，质控探针1μL（4μM）混匀，95℃变性5min,立即冰浴3min；用移液器吹打均匀后取样品杂交液7μL于芯片点样区，放入杂交盒，52℃水浴，杂交2.5hr。
1.6.2基因芯片洗涤
杂交完毕，将杂交盒水平拿出，立即将芯片取出，放入预热至45℃的洗涤液
（2×SSC，0.1%SDS）中，100rpm洗涤5min。
取出芯片放入45℃的洗涤液
中再洗一次。
取出芯片，放入预热至45℃的洗涤液
（0.2×SSC，0.1%SDS），100rpm洗涤5min，洗涤两次。
取出芯片，放入洗液
（0.2×SSC），100rpm室温洗涤5min。
将芯片在无水乙醇中浸提几次，然后把芯片放入芯片盒中，1000rpm/min离心5min甩干。
1.7基因芯片扫描与结果判读
将芯片插入PerkinElmerScanArrayGxplus扫描仪中进行扫描分析:
Wavelenghth，532nm；PMT60%；Power,90%；Brightness，93；Contrast，96，扫描1-2次。
扫描结果用Tiff图片保存。
当QC和PC位点都有绿色荧光信号，且NC位点没有荧光信号时，芯片检测结果为有效结果。
根据图1的亚型分布进行读判，同一条探针出现2个阳性信号者判为阳性；1个阳性信号判为可疑，进行重复试验再次读判；不出现阳性信号者判为阴性。
1.8基因芯片有效性试验
为了防止各亚型间的相互干扰，本研究首先将A型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H6N2、H7N1和H9N2型多重不对称RT-PCR扩增产物等比例混合后与芯片杂交，又将全部亚型的扩增产物等比例混合与芯片杂交。
1.9基因芯片特异性试验
对AIV各亚型、IBV﹑ARV﹑IBDV、NDV、FPV、MDV等病毒核酸进行基因芯片检测。
1.10基因芯片敏感性试验
1.10.1通过病毒噬斑形成试验对接尿囊液病毒进行定量，用QIAampViralRNAMiniKit提取RNA，并对其进行10倍倍比稀释，进行多重不对称RT-PCR，再进行基因芯片检测（每型AIV作3个芯片微矩阵的重复试验）。
1.10.2取1.4中的多重不对称扩增产物采用E.Z.N.A.Cycle-PureKit进行纯化回收，用NanoDrop测定回收产物浓度并对其进行10倍倍比稀释，再进行基因芯片检测。
1.11基因芯片条件的优化
本研究分别进行了芯片杂交检样量（△1μL试验）、杂交温度（△2℃试验）、杂交时间（△0.5hr试验）的优化试验。
杂交上样量分别是3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL；杂交温度分别是46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃；杂交时间分别为1.5hr、2.0hr、2.5hr、3.0hr、3.5hr、4.0hr、4.5hr；对其进行优化筛选。
1.12基因芯片稳定性试验
生产出1天的和常温保存4个月后的基因芯片，各检测标准毒株5份、口岸检样395份（360份阴性，35份阳性），对基因芯片稳定性进行测试。
2.结果
2.1基因芯片有效性试验结果
将H1N1、H3N2、H5N1、H6N2、H7N1和H9N2型病毒多重不对称RT-PCR扩增产物按比例混合进行检测和将25个亚型阳性模板扩增产物按比例混合进行芯片检测，所对应探针位点都出现了各自的检测信号（见图2和图3）。
图2H1、H3、H5、H6、H7、H9、N1和N2亚型AIV基因芯片杂交扫描结果
图325个亚型AIV基因芯片全位点杂交扫描结果
2.2基因芯片特异性试验结果
结果，IBV﹑ARV﹑IBDV、NDV、FPV、MDV基因芯片检测结果均为阴性，除QC和PC阳性参照有荧光信号外，其它位点均无杂交反应，为信号阴性（见图4），而AIV的每个亚型检测结果只在各自相应的位点出现阳性信号（见图5~图10），说明该基因芯片具有高度特异性。
。
图4IBV﹑ARV﹑IBDV、NDV和MDV等常见病毒基因芯片检测扫描结果
图5H1N1AIV基因芯片检测扫描结果
图6H3N2AIV基因芯片检测扫描结果
图7H5N1AIV基因芯片检测扫描结果
图8H7N1AIV基因芯片检测扫描结果
图9H9N2AIV基因芯片检测扫描结果
图10单个亚型A型流感病毒基因芯片杂交扫描结果
1-18分别为H2、H4、H6、H8、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9亚型的A行流感病毒基因芯片杂交扫描结果
2.3基因芯片敏感性试验结果
以H5N1为例，噬斑总数为2.47×107pfu/mL,基因芯片的检测敏感度可达2.47pfu/mL，见图11；其扩增目的片段敏感性可达2.5ng，说明该芯片具有良好的敏感性。
图11基因芯片敏感性扫描结果
2.4基因芯片条件的优化
结果表明：
取多重不对称RT-PCR扩增产物5μL，加杂交缓冲液6μL，质控探针1μL混匀，95℃变性5min,立即冰浴3min；用移液器吹打均匀后取样品杂交液7μL于芯片点样区，放入杂交盒，52℃水浴杂交2.5hr，结果比较理想。
2.5基因芯片稳定性试验结果
基因芯片生产1天后立即检测，与常温保存6个月后检测结果完全一致，阳性样品号完全吻合，结果5份标准毒株和35份口岸检样全为阳性，360份阴性口岸检样为阴性。
五、应用效果
应用本标准检测了49个地区的2677份样品，其特异性强、敏感性好、重复性高。
本标准送审稿已通过行业标准专家审定。
该方法操作方便可行，便于推广应用。
六、验证试验
基因芯片验证试验
对AIV参考毒株进行RNA提取（在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室完成），然后用本标准方法进行基因芯片验证试验。
结果显示：
AIV参考毒株H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H12、H14、H15、N1、N2、N3、N4、N6、N8、N9均出现较好的荧光信号，H11、H13和N5各自的一个探针信号稍弱，见图12。
图12基因芯片验证试验扫描结果
并且本标准方法得到山西出入境检验检疫局、深圳出入境检验检疫局、内蒙古出入境检验检疫局、湖南出入境检验检疫局等4个单位的应用。
七、验证结论：
1用所建立的禽流感病毒分型基因芯片检测方法对AIV参考毒株进行了检测。
检测结果与毒株亚型完全一致。
2本次验证试验结论与研究报告相一致。
该方法特异、敏感、快速、简便，建议尽快组装试剂盒，在系统内推广应用。
综上所述，本标准以OIE指南为主要依据，根据进出口动物结核病检疫要求，参考国内外标准，制定了禽流感病毒分型基因芯片检测操作规程，是对禽流感现有标准体系的补充和完善，所规定的方法符合OIE等国际标准要求，可操作性强。
八、本标准的应用领域
本项目所制定的方法标准，适用于动物（家禽、猪、水鸟及其他哺乳动物等）和人禽流感（流感）的诊断，也可用于禽等动物产品进行禽流感病毒感染检测。
应用领域包括进出境检验检疫、疫病防控、流行病学调查、食品安全监控等。
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