溶液各类配制.docx
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溶液各类配制
附录：
经常使用试剂配制及应用
一、经常使用缓冲液、试剂的配制
碳酸盐缓冲液（Carbonate-BicarbonateBuffer）
由于碳酸盐pH值偏碱，因此，经常使用于pH>9的缓冲液配制（附表1）。
附表1.0.2mol/L碳酸盐缓冲液（～）
pH
LNa2CO3
（ml）
LNaHCO3（ml）
pH
LNa2CO3
（ml）
LNaHCO3（ml）
磷酸缓冲液（PhosphateBuffers，PB）
磷酸盐是利用最普遍的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个pKa值，因此用它们配制的缓冲液，pH范围最宽。
NaH2PO4：
pKa1＝，pKa2＝；Na2HPO4：
pKa1＝，pKa2＝。
另外，磷酸盐还有钾盐分子形式，一样来讲，低温时钠盐难溶，钾盐易溶，因此，配制细胞培育用试剂时常常添加钾盐试剂，但假设配制十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用钠盐而不能用钾盐，因为SDS会与磷酸钾生成难溶的十二烷基硫酸钾。
磷酸缓冲液的优势为：
①可配制成不同离子强度的缓冲液；②适用pH缓冲范围较宽；③受温度阻碍缓冲液pH值转变较小；④离子强度对缓冲液pH阻碍较小，如L缓冲液稀释10倍其pH转变小于。
磷酸缓冲液的缺点是：
①磷酸盐易与钙离子（Ca2+）、镁离子（Mg2+）及重金属离子结合生成不溶的沉淀物；②可能干扰某些化学反映进程，如对某些酶的催化活性具有必然程度的抑制作用。
NaH2PO4的pH值偏酸性，可用作pH<4的缓冲液。
Na2HPO4的pH值偏碱性，可用作pH>10的缓冲液。
而pH＝6～8的中性缓冲液是更经常使用的缓冲液，需要NaH2PO4与Na2HPO4两种磷酸盐混合配制（附表2）。
附表2.0.2mol/L磷酸盐缓冲液（～）
pH
LNaH2PO4
（ml）
LNa2HPO4（ml）
pH
LNaH2PO4
（ml）
LNa2HPO4（ml）
磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-bufferedsaline,PBS）
磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，PBS适用于做细胞缓冲液，经常使用PBS配制如下。
NaCl8g
KCl0.2g
Na2HPO41.44g
KH2PO40.24g
在800ml蒸馏水中溶解，用HCl调剂溶液的pH值至～加水定容至1L，15psi（1.05kg/cm2）高压灭菌20min，室温保留备用。
Tris缓冲液（Tris-HClBuffer,TB）
Tris的pH值偏于碱性，因此，通过添加HCl调剂pH至所需值，Tris-HCl缓冲液的离子强度（mol/L）是专指Tris的浓度，如某一特定pH的mol/LTris缓冲液的配制是将50mlmol/LTris碱溶液与附表3所示相应体积（ml）的mol/LHCl混合，加水至将体积100ml，即为mol/LTris缓冲液。
另外，按附表3制备的缓冲液，由于试剂来源的不同，缓冲液pH可能与所需略有不同，现在可通过稍许减少或增加HCl用量，精细调剂pH至所需值。
附表4.0.05mol/LTris缓冲液
pH
需mol/LHCl（ml）
pH
需mol/LHCl（ml）
Tris盐缓冲液（TBS）：
Tris盐缓冲液是在Tris缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，TBS也适用于做细胞缓冲液，经常使用TBS配制如下。
8gNaCl、0.2gKCl和3gTris溶解于800ml蒸馏水中，加入0.015g酚红并用HCl调pH至用蒸馏水定容至1L，分装后在15psi（1.05kg/cm2）高压灭菌20min，室温保留。
此刻经常使用Tris盐缓冲液通常不加pH指示剂，而且该溶液若是不用于细胞培育，通常不加KCl及酚红。
Hank’s液（Hank’sBalancedSaltSolution）
Hank’s液是一种平稳盐溶液，要紧用于细胞培育取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗等。
贮存液A液：
（I）NaCl80g
KCl4g
MgSO4·7H2O1g
MgCl2·6H2O1g
用双蒸馏水定容至450ml。
（II）CaCl21.4g（或CaCl2·2H2O1.85g）
用双蒸馏水定容至50ml。
将I和II液混合，即成A液。
贮存液B液：
Na2HPO4·12H2O1.52g，
KH2PO40.6g,
酚红0.2g,
葡萄糖,
酚红应先置研钵内磨细，然后按配方顺序一一溶解，用双蒸馏水定容至500ml。
（3）应用液：
A、B贮存液别离经112.6℃湿热灭菌20min，取A和B液各25ml，加无菌双蒸馏水至450ml，利用前用无菌的%或%NaHCO3调至所需pH。
注意：
药品必需全数用试剂，并按配方顺序加入，用适量双蒸水溶解，待前一种药品完全溶解后再加入后一种药品，最后补足水到总量。
无Ca2+、Mg2+Hank’s液（Hank’sSolutionwithoutcalcium,magnesiumsulfate）
NaCl80g,
KCl4g,
Na2HPO4·12H2O1.52g，
KH2PO40.6g,
葡萄糖10g,
用双蒸馏水溶解后，加入％酚红溶液50ml，再加入双蒸水至1000ml，112.6℃湿热灭菌20min，4℃冰箱保留。
临用前将原液用无菌双蒸水作1：
10倍稀释，用无菌的%或%NaHCO3调至所需pH。
柠檬酸盐缓冲液（CitrateBuffer）
柠檬酸0.327g
柠檬酸钠2.63g
磷酸氢钠
葡萄糖
蒸馏水加至100ml。
枸橼酸-磷酸盐缓冲液（Citricacid-PhosphateBuffer）
Lcitrateacid，LNa2HPO4，等量混合，调剂pH至。
mol/LEDTA,pH
EDTA·2H2O186.1g
NaOH～20g
将EDTA·2H2O加入800ml水中，在磁力搅拌器上猛烈搅拌。
用NaOH调剂pH至，EDTA直到接近pH才完全溶解，定容至1L。
分装后高压蒸汽灭菌。
%酚红溶液
取酚红置于研钵中逐滴加入1mol/LNaOH溶液，边研磨边使酚红转变成钠盐溶于水中，加双蒸水至100ml，过滤后，4℃冰箱保留。
醋酸钾（PotassiumAcetate）
在60ml5mol/L醋酸钾溶液中，加入冰醋酸和水。
该溶液用于碱性裂解。
3mol/L醋酸钠（SodiumAcetate），和
在800ml水中溶解408.1g三水醋酸钠，用冰乙酸调pH至或用稀释乙酸调pH至，加双蒸水至1L。
分装后高压灭菌。
柠檬酸钠缓冲液（SodiumCitrateBuffer）
柠檬酸钠1.8g
HCl（1mol）4ml
无水乙醇95ml
先用100ml去离子水溶解柠檬酸钠，然后加入HCl和无水乙醇，再补充去离子水至总量200ml。
饱合硫酸铵溶液（SaturatedAmmoniumSulfateSolution）
取500ml双蒸馏水，加入约400克硫酸铵，水浴加热至70℃
，磁力搅拌器充分搅拌，直到加入的硫酸铵再也不溶解，以氨水（也可用NaOH）调，室温保留。
二、酶免疫检测经常使用试剂配制
包被液（CoatingBuffer）（碳酸盐缓冲液）
Na2CO3·10H2O8.58g
NaHCO35.8g
溶于双蒸水至1000ml。
封锁液（Confiningliquid）（5%脱脂乳-PBS溶液，）
脱脂乳50g
加L磷酸盐缓冲液（PBS）至1000ml溶解。
洗液（washingliquid）
氯化钠8.0g
磷酸二氢钾0.2g
磷酸氢二钠（12H2O）2.9g
吐温-20
加去离子水至1000ml溶解即可。
终止液（stopbuffer）（2mol/LH2SO4）：
H2SO4加去离子水至200ml。
缓冲甘油（glycerinebuffer）
甘油9份
PB（）1份
将9份甘油与1份PB归并，充分混匀。
%H2O2-甲醇液（HydrogenPeroxide-MethanolSolution）（整体积120ml）
3%H2O220ml
甲醇100ml
DAB-H2O2底物缓冲液（DAB-H2O2SubstrateBuffer）
取6mg二氨基联苯胺（3,3’-DiaminobenzidineTetrahydrochlorideDAB）溶解于10mlTris-HCl。
利用前取%H2O2加入到DAB溶液中（H2O2的终浓度为%）。
如有沉淀生成，那么用滤纸过滤。
5-溴-4-氯-3吲哚磷酸/四唑氮蓝底物显色液（BCIP/NBTSubstrateSolution）
贮存液配制：
NBT：
在10ml70%的乙醇中溶解0.5gNBT。
BCIP：
在10ml100%二甲基甲酰胺中溶解0.5gBCIP。
贮存液4℃保留，可稳固一年。
底物显色液：
取66μlNBT贮液与33μlBCIP加入到10ml碱性磷酸酶缓冲液中，充分混匀，底物显色液应在用前1小时内配制。
三、细胞相关试剂配制
L-谷氨酰胺（L-G）溶液（L-glutaminSolution）（mol/L）
称2.9gL-谷氨酰胺（分子量为）用去离子水溶解至100ml，过滤除菌，分装小瓶，4～5ml/瓶，-20℃冻存。
100x青-链霉素（双抗）溶液（P/SPenicillin/StreptomycinSolution）
取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml去离子水中，分装小瓶，4～5ml/瓶，-20℃冻存。
%NaHCO3溶液（NaHCO3Solution）
称分析纯NaHCO37.5g，用去离子水溶解至l00ml，过滤除菌，分装小瓶，4～5m1/瓶，盖紧瓶塞，4℃保留。
HEPES溶液（HEPESSolution）（1mol/L）
称23.83gHEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicacid，N-2-羟乙基呱嗪-N'-2-乙基磺酸，分子量为），用去离子水溶解至100ml，过滤除菌，分装小瓶，4～5m1/瓶，4℃保留。
氨基喋呤（A）贮存液（AminopterinStockingSolution）（100×,4×10-5mol/L）
称mg氨基喋呤（Aminopterin,分子量），溶于90m1去离子水中，滴加lmol/LNaOH0.5m1，并非断搅动，待氨基喋呤完全溶解后，加1mol/L的HCl0.5m1中和，再补加去离子水至100m1。
过滤除菌，分装小瓶，2ml/瓶，-20℃冻存。
次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液（HTStockingSolution）（100×,H:
10-2mol/L;T:
×10-3mol/L）
称取mg次黄嘌呤（Hypoxanthine，分子量）和mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine，分子量），加去离子水至l00ml，置45～50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶，2m1/瓶，-20℃冻存。
用前可置37℃加温助溶。
HAT培育液
培育液98ml，A贮存液1m1，HT贮存液lml。
秋水仙素溶液（colchicineSolution）
称取10mg秋水仙素，溶于100m1生理盐水中（即为100μg/ml），过滤除菌后，分装小瓶，－20℃冻存备用。
Alsever’s血细胞保留液（Alsever’sSolution）
葡萄糖2.05g,
柠橡酸钠0.8g,
NaCl0.42g，
蒸馏水l00ml。
以上成份混匀后，微加温使其溶解后，用柠檬酸调剂pH，分装于三角瓶中（30～50ml/瓶）,113℃湿热灭菌15min，4℃保留备用。
细胞冻存液（FreezingMedium）
50%小牛血清；40%不完全培育液；10%DMSO（二甲基亚砜）。
%胰蛋白酶－%EDTA细胞消化液（Trypsin-EDTASolution）
A:
%胰蛋白酶:
胰蛋白酶2.5g
磷酸缓冲盐溶液100ml
过滤除菌保留。
B:
%二乙胺四乙酸二钠（EDTA）
EDTA0.2g
双蒸馏水100ml
高压灭菌保留。
取A液1份，加B液99份，混匀，分装-20℃保留。
%NH4CI溶液（AmmoniumChlorideSolution）
NH4CI0.83g
KHCO30.1g
EDTA·2Na0.0037g
蒸馏水加至100ml。
Tris-NH4Cl溶液（Tris-AmmoniumChlorideSolution）
NH4Cl3.735g/450ml双蒸水+Tris1.3g/50ml双蒸水（pH）。
细胞裂解液（CellLysisSolution）
20mmol/LHEPES（pH
150mmol/LNaCl
1mmol/LEDTA
10μg/mlleupeptin
1mmol/LPMSF
1%TritonX-100
%deoxicholate（sodiumsalt）
%SDS
组织匀浆缓冲液（HistolysisBuffer）
50mmol/LTris-HCl
150mmol/LNaCl
1%NP40
1mmol/Lphenylmethylsulfonylfluoride
4μg/mlleupeptin
1μg/mlaprotinin
细胞核裂解液（NuclearLysisBuffer）
10mmol/LTris-HCl
150mmol/LNaCl
10mmol/LEDTA
蛋白酶K100µg/ml
%SDS（最后加）
10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）
在异丙醇中溶解PMSF至ml，即10mmol/L，分装后保留于-20℃，若是需要的话，可将贮存液制备至ml，即100mmol/L的高浓度。
闪烁液（ScintillationSolution）
PPO（2,5-二苯基）5.0g、POPOP（1,4-双－5－苯基）0.5g溶于1000ml二甲苯中。
也可将POPOP加入二甲苯，在37℃水浴上溶解后，再加PPO，然后补足二甲苯。
3H-TdR工作液（wokingSolution）
按1:
20的比例将浓度为1mCi/ml的3H－TdR用无血清的RPMI培育液稀释，终浓度为50µCi/ml。
肝素溶液的配制：
含有肝素的培育液能够使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培育液中最终浓度为50ug/ml。
因为此刻市售的多为肝素钠，包装为约为克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，留宿，然后过滤除菌，分装小瓶，保留温度为4℃。
利历时，向100ml培育液中加入1ml（精准可加入）即可。
Ⅰ型胶原酶：
％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。
注意：
因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此能够用蔡式滤器过滤除菌。
分装入10ml小瓶-20℃保留。
历时提早一小时37℃复温即可.%的I型胶原酶的配置，100mg的粉末状的I型胶原酶能够溶于100ml的DMEM/F12，微米滤器过滤%的I型胶原酶的配置，100mg的粉末状的I型胶原酶能够溶于100ml的DMEM/F12，微米滤器过滤.
四、染色液配制（PreprationofStainingSolution）
苏木素液（HematoxylinSolution）：
苏木素2.5g，乙醇，钾明矾2.5g，氧化汞1.25g，冰乙酸，蒸馏水。
配制方式是先将苏木素溶于乙醇中（略加热）。
将预先已溶解明矾的蒸馏水加入苏木素乙醇液中，使溶液尽快沸腾后，将火焰熄灭，慢慢加入氧化汞，避免溶液油溅出，再煮沸2min。
将烧瓶当即浸入冷水中，当染液冷却后，加入醋酸，室温保留，用前过滤。
伊红Y染色液（EosinYSolution）
伊红Y～1.0g，蒸馏水75ml，95%乙醇25ml，冰乙酸1～2滴。
先取少量蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红研碎，再加入全数蒸馏水，溶解后加入乙醇。
甲基绿染色液（MethylGreeenSolution）
新购买的甲基绿需用氯仿处置去除甲基紫。
方式是将2%甲基绿水溶液20ml倾入干净分液漏斗，移去慢慢下沉带紫红色的氯仿，再加入新的氯仿10ml，如此反复改换氯仿，到无紫红色为止。
该液作为贮存液，4℃保留。
染色液：
甲基绿贮存液5ml，5%派诺宁水溶液1ml，蒸馏水12ml，L乙酸钠18ml（临用前配制，滤纸过滤）。
吖啶橙贮存液（AcridineOrangeStockingSolution）
10mg吖啶橙溶解于100mlPBS中，～滤过，4℃避光保留。
吉姆萨贮存液（GiemsaSolution）
吉姆萨染色粉1g先溶于少量甘油，在研钵内研磨30min以上，至看不见颗粒为止，再将全数（66ml）剩余甘油倒入，于56℃温箱内保温2h。
然后再加入甲醇（66ml），搅匀后保留于棕色瓶中。
母液配制后放入冰箱可长期保留，一样刚配制的母液染色成效欠佳，保留时刻越长越好。
临历时用磷酸缓冲液稀释10倍，随配随用。
瑞氏染色液（Wright’sSolution）
瑞氏染色粉0.3g
甘油3ml
甲醇97ml
将瑞氏染色粉放干燥研钵内磨细，加入甘油继续研磨，不断滴加甲醇并继续研磨，将上层溶解的染料倒入棕色瓶中，直至染料全溶后加甲醇至所需量。
混匀后置棕色瓶中保留，用前过滤。
一般配制后置室温一周即可利用，保留时刻愈入，那么染色成效愈佳。
吉姆萨-瑞氏染色液（Giemsa-Wright’sStainingSolution）
瑞氏染色粉0.3g
吉姆萨染色粉0.03g
甲醇100ml
将二种粉末置于研钵中磨细，再逐滴加入甲醇混匀后倒入棕色瓶中，塞紧瓶口并充分振荡。
置室温溶解后利用。
噻唑兰（MTT）
称取250mgMTT，加50mlPBS（L，pH）在磁力搅拌器上搅拌30min，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃保留。
两周内有效。
台酚蓝染色液（TrypanBlueSolution）
A：
台酚蓝染料1g
蒸馏水100ml
将染料置于研钵中边研磨边加入蒸馏水溶解。
B：
NaCl1.7g
蒸馏水100ml
临用前A、B液1：
1混合，离心沉淀，取上清供染色用。
混合后的染液寄存太久，易形成沉淀，故应新鲜配制。
染色时，取细胞悬液加入新鲜配制的染色液一滴，室温下染5～10分钟，取一滴悬液于载波片上，加盖玻片，高倍镜下检查。
死亡细胞膨大并染成浅蓝色，活细胞不着色，大小正常。
五、固定剂（Fixatives）
大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因此对不同的固定方式或固定剂的反映也不同。
某些固定剂乃至可同时破坏和/或爱惜同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并依照需要来选择适宜的固定剂（或固定方式）和改良固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中经常使用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为经常使用。
4%多聚甲醛L磷酸缓冲液,（formaldehyde-PhasphateBuffer）
多聚甲醛 40g
L磷酸缓冲液 至1000ml
配制方式：
称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800mlL磷酸缓冲液（PhosphateBuffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）至完全溶解，通常需滴加少量1NNaOH才能使溶液清亮，最后补足L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保留。
4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠（formaldehyde-SodiumPhosphate/SodiumHydroxideBuffer）
A液：
多聚甲醛 40g
蒸馏水 400ml
B液：
Na2HPO4·2H2O
蒸馏水 300ml
C液：
NaOH
蒸馏水 200ml
配制方式：
A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方式同前），最多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽可能幸免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1NNaOH或1NHCl将pH调至～，最后，补充双蒸水至1000ml充分混合，4℃冰箱保留备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为%～1%。
该固定剂较温和，适于组织的长期保留。
组织标本于该固定液中，4℃冰箱保留数月仍可取得中意的染色成效。
六、蛋白电泳相关试剂
30％丙烯酰胺（Acrylmide）
丙烯酰胺29g
N,N’-亚甲双丙烯酰胺1g
溶于60ml水中，加热至37℃溶解，补加水至终体积100ml。
µM滤器过滤除杂质，置深色瓶中室温保留。
考马斯亮蓝R-250染色液（CoomassieStainingSolution）
1.称取1g考马斯亮蓝R-250，置于1L烧杯中。
2.量取250ml的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。
3.加入100ml的冰醋酸，搅拌均匀。
4.加入650ml的去离子水，搅拌均匀。
5.用滤纸除去颗粒物质后，室温保留。
考马斯亮蓝脱色液（DestainingSolution）
量取以下溶液，置于1L烧杯中，充分混合后利用。
醋酸100ml
乙醇50ml
dH2O850ml
1mol/L二硫苏糖醇贮存液（DTTStockingSolution）
用20mlL乙酸钠溶液（）溶解，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于－20℃保留。
DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处置。
LpH甘氨酸-
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