溶液各类配制.docx

1、溶液各类配制附录：经常使用试剂配制及应用一、经常使用缓冲液、试剂的配制碳酸盐缓冲液(Carbonate-Bicarbonate Buffer)由于碳酸盐pH值偏碱，因此，经常使用于pH9的缓冲液配制（附表1）。附表1. 0.2 mol/L碳酸盐缓冲液（）pHL Na2CO3(ml)L NaHCO3 (ml)pHL Na2CO3(ml)L NaHCO3 (ml)磷酸缓冲液(Phosphate Buffers，PB) 磷酸盐是利用最普遍的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个pKa 值，因此用它们配制的缓冲液，pH 范围最宽。NaH2PO4：pKa1，pKa2； Na2HPO4：pKa1，pKa2

2、。另外，磷酸盐还有钾盐分子形式，一样来讲，低温时钠盐难溶，钾盐易溶，因此，配制细胞培育用试剂时常常添加钾盐试剂，但假设配制十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用钠盐而不能用钾盐，因为SDS会与磷酸钾生成难溶的十二烷基硫酸钾。磷酸缓冲液的优势为：可配制成不同离子强度的缓冲液；适用pH缓冲范围较宽；受温度阻碍缓冲液pH值转变较小；离子强度对缓冲液pH阻碍较小，如L缓冲液稀释10倍其pH转变小于。磷酸缓冲液的缺点是：磷酸盐易与钙离子（Ca2+）、镁离子（Mg2+）及重金属离子结合生成不溶的沉淀物；可能干扰某些化学反映进程，如对某些酶的催化活性具有必然程度的抑制作用。NaH2P

3、O4的pH值偏酸性，可用作pH10的缓冲液。而pH68的中性缓冲液是更经常使用的缓冲液，需要NaH2PO4与Na2HPO4两种磷酸盐混合配制（附表2）。附表2. 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（）pHL NaH2PO4(ml)L Na2H PO4 (ml)pHL NaH2PO4(ml)L Na2H PO4 (ml)磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-buffered saline, PBS)磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，PBS适用于做细胞缓冲液，经常使用PBS配制如下。NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g在80

4、0ml蒸馏水中溶解，用HCl调剂溶液的pH值至加水定容至1L，15psi（1.05kg/cm2）高压灭菌20min，室温保留备用。Tris缓冲液（Tris-HCl Buffer, TB）Tris的pH值偏于碱性，因此，通过添加HCl调剂pH至所需值，Tris-HCl缓冲液的离子强度（mol/L）是专指Tris的浓度，如某一特定pH的 mol/L Tris缓冲液的配制是将50ml mol/L Tris碱溶液与附表3所示相应体积（ml）的 mol/L HCl混合，加水至将体积100ml，即为 mol/L Tris缓冲液。另外，按附表3制备的缓冲液，由于试剂来源的不同，缓冲液pH可能与所需略有不同，

5、现在可通过稍许减少或增加HCl用量，精细调剂pH至所需值。附表4. 0.05 mol/L Tris缓冲液pH需 mol/L HCl（ml)pH需 mol/L HCl（ml)Tris盐缓冲液（TBS）：Tris盐缓冲液是在Tris缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，TBS也适用于做细胞缓冲液，经常使用TBS配制如下。8g NaCl、0.2g KCl和3g Tris溶解于800ml蒸馏水中，加入0.015g酚红并用HCl调pH至用蒸馏水定容至1L，分装后在15psi（1.05kg/cm2）高压灭菌20min，室温保留。此刻经常使用Tris盐缓冲液通常不加pH指示剂，而且该溶液若是不用

6、于细胞培育，通常不加KCl及酚红。Hanks液 (Hanks Balanced Salt Solution)Hanks液是一种平稳盐溶液，要紧用于细胞培育取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗等。贮存液A液：(I)NaCl 80g KCl 4g MgSO47H2O 1gMgCl26H2O 1g用双蒸馏水定容至450ml。(II)CaCl2 1.4g (或CaCl22H2O 1.85g)用双蒸馏水定容至50ml。将I和II液混合，即成A液。贮存液B液：Na2HPO412H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g, 酚红 0.2g, 葡萄糖 , 酚红应先置研钵内磨细，然后按配方顺序一一溶解，用双蒸馏水定容

7、至500ml。 (3)应用液：A、B贮存液别离经112.6湿热灭菌20min，取A和B液各25ml，加无菌双蒸馏水至450ml，利用前用无菌的%或% NaHCO3调至所需pH。注意：药品必需全数用试剂，并按配方顺序加入，用适量双蒸水溶解，待前一种药品完全溶解后再加入后一种药品，最后补足水到总量。无Ca2+、Mg2+ Hanks液（Hanks Solution without calcium, magnesium sulfate）NaCl 80g, KCl 4g, Na2HPO412H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g,葡萄糖 10g,用双蒸馏水溶解后，加入酚红溶液50ml，再加入双蒸水至

8、1000ml，112.6湿热灭菌20min，4 冰箱保留。临用前将原液用无菌双蒸水作1：10倍稀释，用无菌的%或% NaHCO3调至所需pH。柠檬酸盐缓冲液(Citrate Buffer)柠檬酸 0.327g柠檬酸钠 2.63g磷酸氢钠 葡萄糖 蒸馏水加至100ml。枸橼酸-磷酸盐缓冲液（Citric acid- Phosphate Buffer) L citrate acid，L Na2HPO4，等量混合，调剂pH至。 mol/L EDTA, pH EDTA2H2O 186.1 gNaOH 20 g将EDTA2H2O加入800ml水中，在磁力搅拌器上猛烈搅拌。用NaOH调剂pH至，EDTA直

9、到接近pH 才完全溶解，定容至1L。分装后高压蒸汽灭菌。%酚红溶液取酚红置于研钵中逐滴加入1mol/L NaOH溶液，边研磨边使酚红转变成钠盐溶于水中，加双蒸水至100ml，过滤后，4 冰箱保留。醋酸钾（Potassium Acetate） 在60ml 5mol/L醋酸钾溶液中，加入冰醋酸和水。该溶液用于碱性裂解。3mol/L 醋酸钠（Sodium Acetate），和 在800ml水中溶解408.1g三水醋酸钠，用冰乙酸调pH至或用稀释乙酸调pH至，加双蒸水至1L。分装后高压灭菌。柠檬酸钠缓冲液(Sodium Citrate Buffer) 柠檬酸钠 1.8g HCl(1mol) 4ml 无

10、水乙醇 95ml 先用100ml去离子水溶解柠檬酸钠，然后加入HCl和无水乙醇，再补充去离子水至总量200ml。饱合硫酸铵溶液(Saturated Ammonium Sulfate Solution) 取500ml双蒸馏水，加入约400克硫酸铵，水浴加热至70，磁力搅拌器充分搅拌，直到加入的硫酸铵再也不溶解，以氨水（也可用NaOH）调，室温保留。二、酶免疫检测经常使用试剂配制包被液(Coating Buffer)（碳酸盐缓冲液）Na2CO310H2O 8.58g NaHCO3 5.8g 溶于双蒸水至1000ml。封锁液(Confining liquid)（5%脱脂乳-PBS溶液，）脱脂乳 50

11、g加L 磷酸盐缓冲液（PBS）至1000ml溶解。洗液(washing liquid) 氯化钠 8.0g 磷酸二氢钾 0.2g 磷酸氢二钠（12H2O） 2.9g 吐温-20 加去离子水至1000ml溶解即可。终止液(stop buffer)（2mol/L H2SO4）： H2SO4 加去离子水至200ml。缓冲甘油(glycerine buffer) 甘油 9份 PB（） 1份 将9份甘油与1份PB归并，充分混匀。%H2O2-甲醇液(Hydrogen Peroxide-Methanol Solution)（整体积120ml） 3%H2O2 20ml 甲醇 100mlDAB-H2O2底物缓冲液

12、(DAB- H2O2 Substrate Buffer)取6mg二氨基联苯胺(3,3-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride DAB)溶解于10ml Tris-HCl 。利用前取%H2O2 加入到DAB溶液中(H2O2的终浓度为%)。如有沉淀生成，那么用滤纸过滤。5-溴-4-氯-3吲哚磷酸/四唑氮蓝底物显色液（BCIP/NBT Substrate Solution）贮存液配制：NBT：在10ml 70%的乙醇中溶解0.5g NBT。BCIP：在10ml 100%二甲基甲酰胺中溶解0.5g BCIP。贮存液4保留，可稳固一年。底物显色液：取66l NBT贮液与33

13、l BCIP加入到10ml碱性磷酸酶缓冲液中，充分混匀，底物显色液应在用前1小时内配制。三、细胞相关试剂配制 L-谷氨酰胺（L-G）溶液（L-glutamin Solution）（ mol/L）称2.9 g L-谷氨酰胺（分子量为）用去离子水溶解至100 ml，过滤除菌，分装小瓶，45 ml/瓶，-20冻存。100x青-链霉素（双抗）溶液（P/S Penicillin/Streptomycin Solution）取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1 g，溶于100 ml去离子水中，分装小瓶，45 ml/瓶，-20冻存。% NaHCO3溶液（NaHCO3 Solution）称分析纯

14、NaHCO3 7.5 g，用去离子水溶解至l00ml，过滤除菌，分装小瓶，45 m1/瓶，盖紧瓶塞，4保留。HEPES溶液（HEPES Solution）（1mol/L）称23.83 g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基呱嗪-N-2-乙基磺酸，分子量为），用去离子水溶解至100 ml，过滤除菌，分装小瓶，45 m1/瓶，4保留。氨基喋呤（A）贮存液（Aminopterin Stocking Solution）（100, 410-5 mol/L）称 mg氨基喋呤（Aminopterin, 分子量），溶

15、于90 m1去离子水中，滴加l mol/L NaOH 0.5 m1，并非断搅动，待氨基喋呤完全溶解后，加1 mol/L的HCl 0.5m1中和，再补加去离子水至100 m1。过滤除菌，分装小瓶，2 ml/瓶，-20冻存。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液（HT Stocking Solution）（100,H: 10-2 mol/L; T: 10-3 mol/L）称取 mg次黄嘌呤（Hypoxanthine，分子量）和 mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine，分子量），加去离子水至l00 ml，置4550水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶，2 m1/瓶，-20冻存。用前可置37加温助溶。HAT培育液

16、培育液98 ml，A贮存液1 m1，HT贮存液l ml。秋水仙素溶液（colchicine Solution）称取10 mg秋水仙素，溶于100 m1生理盐水中（即为100 g/ml），过滤除菌后，分装小瓶，20冻存备用。Alsevers血细胞保留液（Alsevers Solution）葡萄糖 2.05g, 柠橡酸钠 0.8g, NaCl 0.42g，蒸馏水 l00ml。以上成份混匀后，微加温使其溶解后，用柠檬酸调剂pH ，分装于三角瓶中(3050ml/瓶), 113湿热灭菌15min，4保留备用。细胞冻存液(Freezing Medium)50%小牛血清；40%不完全培育液；10%DMSO（

17、二甲基亚砜）。%胰蛋白酶%EDTA细胞消化液(Trypsin-EDTA Solution) A: %胰蛋白酶: 胰蛋白酶 2.5g 磷酸缓冲盐溶液 100ml 过滤除菌保留。 B: %二乙胺四乙酸二钠（EDTA） EDTA 0.2g 双蒸馏水 100ml 高压灭菌保留。 取A液1份，加B液99份，混匀，分装-20保留。% NH4CI溶液(Ammonium Chloride Solution)NH4CI 0.83gKHCO3 0.1gEDTA2Na 0.0037g 蒸馏水加至100ml。Tris-NH4Cl溶液(Tris-Ammonium Chloride Solution) NH4Cl 3.7

18、35g/450ml双蒸水+Tris 1.3g/50ml双蒸水（pH ）。细胞裂解液（Cell Lysis Solution）20mmol/L HEPES(pH 150mmol/L NaCl1 mmol/L EDTA10g/ml leupeptin1mmol/L PMSF1% Triton X-100% deoxicholate (sodium salt)% SDS组织匀浆缓冲液（Histolysis Buffer）50mmol/L Tris-HCl 150mmol/L NaCl 1% NP401mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride 4g/ml leupept

19、in1g/ml aprotinin细胞核裂解液(Nuclear Lysis Buffer)10mmol/L Tris-HCl 150mmol/L NaCl10mmol/L EDTA蛋白酶K 100g/ml%SDS（最后加）10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF） 在异丙醇中溶解PMSF至ml，即10mmol/L，分装后保留于-20，若是需要的话，可将贮存液制备至ml，即100mmol/L的高浓度。闪烁液(Scintillation Solution) PPO (2,5-二苯基) 5.0g、POPOP（1,4-双5苯基）0.5g溶于1000ml二甲苯中。也可将POPOP加入二甲苯，在37水浴上溶

20、解后，再加PPO，然后补足二甲苯。3H-TdR 工作液（woking Solution） 按1:20的比例将浓度为1mCi/ml的3HTdR用无血清的RPMI培育液稀释，终浓度为50Ci/ml。肝素溶液的配制： 含有肝素的培育液能够使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培育液中最终浓度为50ug/ml。因为此刻市售的多为肝素钠，包装为约为克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，留宿，然后过滤除菌，分装小瓶，保留温度为4 。利历时，向100ml培育液中加入1ml（精准可加入）即可。 型胶原酶： 型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此能够

21、用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20保留。 历时提早一小时37复温即可. %的I型胶原酶的配置，100mg的粉末状的I型胶原酶能够溶于100ml的DMEM/F12，微米滤器过滤%的I型胶原酶的配置，100mg的粉末状的I型胶原酶能够溶于100ml的DMEM/F12，微米滤器过滤.四、染色液配制（Prepration of Staining Solution）苏木素液(Hematoxylin Solution)：苏木素2.5g，乙醇，钾明矾2.5g，氧化汞1.25g，冰乙酸，蒸馏水。配制方式是先将苏木素溶于乙醇中（略加热）。将预先已溶解明矾的蒸馏水加入苏木素乙醇液中，使溶液尽快沸腾后，将

22、火焰熄灭，慢慢加入氧化汞，避免溶液油溅出，再煮沸2min。将烧瓶当即浸入冷水中，当染液冷却后，加入醋酸，室温保留，用前过滤。伊红Y染色液(Eosin Y Solution)伊红Y 1.0g，蒸馏水75ml，95%乙醇25ml，冰乙酸12滴。先取少量蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红研碎，再加入全数蒸馏水，溶解后加入乙醇。甲基绿染色液(Methyl Greeen Solution)新购买的甲基绿需用氯仿处置去除甲基紫。方式是将2%甲基绿水溶液20ml倾入干净分液漏斗，移去慢慢下沉带紫红色的氯仿，再加入新的氯仿10ml，如此反复改换氯仿，到无紫红色为止。该液作为贮存液，4保留。染色液：甲基绿贮存液5ml

23、，5%派诺宁水溶液1ml，蒸馏水12ml，L乙酸钠18ml（临用前配制，滤纸过滤）。吖啶橙贮存液(Acridine Orange Stocking Solution) 10mg吖啶橙溶解于100ml PBS中，滤过，4避光保留。吉姆萨贮存液(Giemsa Solution)吉姆萨染色粉1g先溶于少量甘油，在研钵内研磨30min以上，至看不见颗粒为止，再将全数(66ml)剩余甘油倒入，于56温箱内保温2h。然后再加入甲醇(66ml)，搅匀后保留于棕色瓶中。母液配制后放入冰箱可长期保留，一样刚配制的母液染色成效欠佳，保留时刻越长越好。临历时用磷酸缓冲液稀释10倍，随配随用。瑞氏染色液(Wright

24、s Solution)瑞氏染色粉 0.3g甘油 3ml甲醇 97ml将瑞氏染色粉放干燥研钵内磨细，加入甘油继续研磨，不断滴加甲醇并继续研磨，将上层溶解的染料倒入棕色瓶中，直至染料全溶后加甲醇至所需量。混匀后置棕色瓶中保留，用前过滤。一般配制后置室温一周即可利用，保留时刻愈入，那么染色成效愈佳。吉姆萨-瑞氏染色液(Giemsa- Wrights Staining Solution)瑞氏染色粉0.3g吉姆萨染色粉 0.03g甲醇 100ml将二种粉末置于研钵中磨细，再逐滴加入甲醇混匀后倒入棕色瓶中，塞紧瓶口并充分振荡。置室温溶解后利用。噻唑兰（MTT） 称取250mgMTT，加50ml PBS（L

25、，pH ）在磁力搅拌器上搅拌30min，用0.22m的微孔滤膜过滤除菌，分装，4保留。两周内有效。台酚蓝染色液(Trypan Blue Solution)A：台酚蓝染料 1g蒸馏水 100ml将染料置于研钵中边研磨边加入蒸馏水溶解。B：NaCl 1.7g蒸馏水 100ml临用前A、B液1：1混合，离心沉淀，取上清供染色用。混合后的染液寄存太久，易形成沉淀，故应新鲜配制。染色时，取细胞悬液加入新鲜配制的染色液一滴，室温下染510分钟，取一滴悬液于载波片上，加盖玻片，高倍镜下检查。死亡细胞膨大并染成浅蓝色，活细胞不着色，大小正常。五、固定剂(Fixatives)大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在

26、用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因此对不同的固定方式或固定剂的反映也不同。某些固定剂乃至可同时破坏和/或爱惜同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并依照需要来选择适宜的固定剂（或固定方式）和改良固定条件。目前，免疫细胞化学研究中经常使用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为经常使用。4%多聚甲醛L磷酸缓冲液, （formaldehyde-Phasphate Buffer） 多聚甲醛 40g L磷酸缓冲液至1000ml 配制方式：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入5

27、00800ml L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60左右，持续搅拌（或磁力搅拌）至完全溶解，通常需滴加少量1N NaOH才能使溶液清亮，最后补足L的PB于1000ml，充分混匀。该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定224h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保留。4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠（formaldehyde-Sodium Phosphate/Sodium Hydroxide Buffer） A液：多聚甲醛 40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO42H2O 蒸馏水 300ml C液：NaO

28、H 蒸馏水 200ml配制方式：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方式同前），最多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽可能幸免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1N NaOH或1N HCl 将pH调至，最后，补充双蒸水至1000ml充分混合，4冰箱保留备用。该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为%1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保留。组织标本于该固定液中，4冰箱保留数月仍可取得中意的染色成效。六、蛋白电泳相关试剂30丙烯酰胺（Acrylmide） 丙烯酰胺 29g

29、N, N-亚甲双丙烯酰胺 1g 溶于60ml水中，加热至37溶解，补加水至终体积100ml。M滤器过滤除杂质，置深色瓶中室温保留。考马斯亮蓝R-250染色液（Coomassie Staining Solution） 1. 称取1 g考马斯亮蓝R-250，置于1 L烧杯中。 2. 量取250 ml的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。 3. 加入100 ml的冰醋酸，搅拌均匀。 4. 加入650 ml的去离子水，搅拌均匀。 5. 用滤纸除去颗粒物质后，室温保留。考马斯亮蓝脱色液（Destaining Solution） 量取以下溶液，置于1 L烧杯中，充分混合后利用。 醋酸 100ml乙醇 50mldH2O 850ml 1mol/L二硫苏糖醇贮存液（DTT Stocking Solution）用20ml L 乙酸钠溶液（）溶解，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于20保留。DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处置。L pH 甘氨酸-