氯化钠细菌内毒素检查方法验证报告.docx
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氯化钠细菌内毒素检查方法验证报告
氯化钠细菌内毒素检查方法验证报告
文件编码：
D01-5302
版本号：
01
项目
姓名
签名
日期
起草
审核
审核
批准
生效日期
一、目的
建立氯化钠细菌内毒素检查方法，即按照《氯化钠细菌内毒素检查方法验证方案》D01-5302进行验证，在本实验条件下的适用性，所采用的检验方法能够始终如一地获得符合客观实际的数据或结果，确保检验结果的准确性。
二、适用范围
适用于本公司所生产的氯化钠细菌内毒素检查方法的验证。
三、内容
1.概述
按照《2015年分析仪器、实验设备确认总计划》进度安排，验证小组按《氯化钠细菌内毒素检查方法验证方案》D01-5302中既定检查项目，对氯化钠细菌内毒素检查方法进行了检查、测试，且所有测试结果已收集齐全，现特此起草《氯化钠细菌内毒素检查方法验证报告》，分析、总结各项验证情况，对氯化钠细菌内毒素检查方法做出客观评价，提出合理化使用建议，以确保该检验方法的检验结果准确可靠。
2.验证组织
部门
部门职责
责任人
职务
工作划分
备注
质量部
方案起草、组织实施、过程监控、书写报告
方案、报告起草，验证实施及操作结果的复核
进行验证操作
过程监控
验证委员会
方案、报告审核、批准、验证合格证发放
方案、报告审核
方案、报告批准；验证合格证发放
3.验证实施时间：
2015.10.20
4.验证内容
根据公司《验证管理规程》C05-0001的有关规定，对氯化钠细菌内毒素检查方法进行验证。
验证内容包涵鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验以及凝胶限度试验，以确认所建立的氯化钠细菌内毒素检查方法可行性、准确性。
5.验证依据
5.1.验证的法规依据
《药品生产质量管理规范（2010年修订）》
《药品GMP指南·质量控制实验室与物料系统》
《中华人民共和国药典》2015年版四部
6.验证前完成工作检查
6.1.文件资料的检查
确认项目
认可标准
确认方法
确认结果
是否符合
是
否
验证方案
已起草，并经过审核、批准
对验证方案进行检查
验证方案已完成起草，并按照规定结果验证委员会成员审核，验证委员会组长批准。
√
参与人员
已经过验证方案培训
检查人员培训签到表
已对验证参与人员进行了验证方案的培训，培训签到表作为验证方案附件保存。
√
执行标准
符合《中华人民共和国药典》2015年版四部《细菌内毒素检查法》
检查验证方案是否符合《中华人民共和国药典》2015年版四部《细菌内毒素检查法》的要求
检查验证方案符合《中华人民共和国药典》2015年版四部《细菌内毒素检查法》的要求
√
结论
验证方案已起草，并经审核、批准，并对相关人员进行了培训，且符合相关法规规定要求。
检查人：
日期：
复核人：
日期：
QA：
日期：
6.2.工作标准品、鲎试剂及细菌内毒检查用水的检查
确认项目
认可标准
确认方法
确认结果
是否符合
是
否
工作标准品
应由有资质的单位提供且在有效期内
检查工作标准品瓶身
由中国食品药品检定研究所提供，且在定值后有效期内。
√
鲎试剂
应由有资质的单位提供且在有效期内
检查鲎试剂瓶身的信息
鲎试剂由湛江安度斯生物有限公司提供，有效期至2017年04月。
√
细菌内毒检查用水
应由有资质的单位提供且在有效期内
检查细菌内毒素
瓶身的信息
细菌内毒素检查用水由湛江安度斯生物有限公司提供，有效期至2018年06月。
√
结论
根据《氯化钠细菌内毒素检查方法验证方案》D01-5302中既定项目进行确认，所有确认结果均符合规定要求。
检查人：
日期：
复核人：
日期：
QA：
日期：
6.3.干燥箱的检查
确认项目
认可标准
确认方法
确认结果
是否符合
是
否
干燥箱
已进行过检定，且在有效期内
检查干燥箱检定合格证
由仙桃市检定计量测试所进行检定，检定有效期至2016年03月10日。
√
结论
根据《氯化钠细菌内毒素检查方法验证方案》D01-5302中既定项目进行确认，所有确认结果均符合规定要求。
检查人：
日期：
复核人：
日期：
QA：
日期：
7.方法验证
7.1.鲎试剂灵敏度复核试验
7.1.1.试验用鲎试剂、标准品、仪器等信息
鲎试剂
生产单位：
湛江安度斯生物有限公司
批号：
1505151
灵敏度：
0.125EU/ml
生产日期：
2015.05.15
规格：
0.1ml/支
/
/
细菌内毒素工作标准品
生产单位：
中国食品药品检定研究所
批号：
150601-201580
效价：
80EU/支
细菌内毒素检查用水/BET水
生产单位：
湛江安度斯生物有限公司
批号：
1504130
/
/
7.1.2.内毒素标准溶液的制备：
80EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml
0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml
（4λ）（2λ）（λ）（0.5λ）（0.25λ）
7.1.3.验证项目、认可标准及验证方法
验证项目
认可标准
验证方法
鲎试剂
灵敏度
复核
0.5λ≤λc≤2λ
检验操作：
将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。
4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ、和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。
加样结束后，将试管中溶液轻轻振动混匀，封闭管口，避免产生气泡，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60±2分钟。
观察并记录结果：
将试管架从恒温器中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者记录为阳性（+）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者记录为阴性（－）。
实验结果判断与计算：
当最大浓度2λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验方为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）。
计算公式：
λc=lg-1（∑X/4）
式中：
x为反应终点浓度的对数值（lg）。
反应终点浓度是系列递减内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果浓度。
7.1.4.验证结果
仪器名称：
试管恒温仪
仪器型号：
TAL-40D
设备编号：
03-ZL-189
恒温时间：
09:
11～10:
11
恒温温度：
37.0℃
/
/
验证项目
验证结果
是否符合
内毒素
浓度
平行管数
2λ
（0.25）EU/ml
λ
（0.125）EU/ml
0.5λ
（0.06）EU/ml
0.25λ
（0.03）EU/ml
阴性对照
反应终点浓度（EU/ml）
λC
是
否
鲎试剂灵敏度复核
1
+
+
-
-
-
0.125
0.125
√
2
+
+
-
-
-
0.125
3
+
+
-
-
/
0.125
4
+
+
-
-
/
0.125
结论
根据《氯化钠细菌内毒素检查方法验证方案》D01-5302中既定项目进行确认，所有测试结果均符合规定要求。
检查人：
日期：
复核人：
日期：
QA：
日期：
7.2.干扰试验
7.2.1.试验用样品、鲎试剂、标准品等信息
氯化钠
生产厂家：
中盐宏博集团云梦云虹制药有限公司
批号：
20150807
进厂编号：
1212Y00025A015001
鲎试剂
生产单位：
湛江安度斯生物有限公司
批号：
1505151
灵敏度：
0.125EU/ml
生产日期：
2015.05.15
规格：
0.1ml/支
/
/
细菌内毒素工作标准品
生产单位：
中国食品药品检定研究所
批号：
150601-201580
效价：
80EU/支
细菌内毒素检查用水/BET水
生产单位：
湛江安度斯生物有限公司
批号：
1504130
/
/
7.2.2.内毒素标准溶液的制备：
80EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml
7.2.3.供试品溶液的制备：
取本品0.0468g，加细菌内毒素检查用水5ml溶解，制成样品溶液。
样品
3ml
样品2倍
稀释液
/ml
样品/倍
稀释液
/ml
供试品溶液
3mlBET水
/mlBET水
/mlBET水
7.2.4.鲎试剂标示灵敏度的对照系列：
0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml
（4λ）（2λ）（λ）（0.5λ）（0.25λ）
7.2.5.干扰试验系列：
2.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml
（2λ）（λ）（0.5λ）（0.25λ）
7.2.6.验证项目、认可标准及验证方法
验证项目
认可标准
验证方法
干扰试验
0.5λ≤Es≤2λ
0.5λ≤Et≤2λ
检验操作：
将准备好的鲎试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。
其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。
将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。
其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的含2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液，另一列2支（管）加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照。
加样结束后，将试管中溶液轻轻振动混匀，封闭管口，避免产生气泡，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60±2分钟（保温和拿取试管过程中应避免受到振动）。
结果计算：
只有当两组最大浓度2λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照,管均为阴性时，试验方为有效。
按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）.
计算公式：
Es=lg-1（∑Xs/4）、Et=lg-1（∑Xt/4）
式中：
Xs、Xt分别为用检查用水和供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。
7.2.7.验证结果
仪器名称：
试管恒温仪
仪器型号：
TAL-40D
设备编号：
03-ZL-189
恒温时间：
11:
19～12:
19
恒温温度：
37.0℃
/
/
验证项目
验证结果
是否符合
内毒素
浓度
平行管数
2λ
（0.25）EU/ml
λ
（0.125）EU/ml
0.5λ
（0.06）EU/ml
0.25λ
（0.03）EU/ml
阴性对照
供试品溶液
反应终点浓度（EU/ml）
λC
是
否
鲎试剂灵敏度复核
1
＋
＋
－
－
－
/
0.125
0.125
√
2
＋
＋
－
－
－
/
0.125
3
＋
＋
－
－
/
/
0.125
4
＋
＋
－
－
/
/
0.125
干扰试验
1
＋
＋
－
－
/
－
0.125
0.125
√
2
＋
＋
－
－
/
－
0.125
3
＋
＋
－
－
/
/
0.125
4
＋
＋
－
－
/
/
0.125
结论
根据《氯化钠细菌内毒素检查方法验证方案》D01-5302中既定项目进行确认，所有测试结果均符合规定要求。
检查人：
日期：
复核人：
日期：
QA：
日期：
7.3.凝胶限度试验
7.3.1.试验用鲎试剂、标准品等信息
氯化钠
生产厂家：
中盐宏博集团云梦云虹制药有限公司
批号：
20150807
进厂编号：
1212Y00025A015001
鲎试剂
生产单位：
湛江安度斯生物有限公司
批号：
1505151
灵敏度：
0.125EU/ml
生产日期：
2015.05.15
规格：
0.1ml/支
/
/
细菌内毒素工作标准品
生产单位：
中国食品药品检定研究所
批号：
150601-201580
效价：
80EU/支
细菌内毒素检查用水/BET水
生产单位：
湛江安度斯生物有限公司
批号：
1504130
/
/
7.3.2.内毒素标准溶液的制备：
80EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml
7.3.3.供试品溶液的制备：
取本品0.0512g，加细菌内毒素检查用水5ml溶解，制成样品溶液。
样品
1ml
样品2倍
稀释液
/ml
样品/倍
稀释液
/ml
供试品溶液
1mlBET水
/mlBET水
/mlBET水
供试品阳性对照液的制备：
0.5EU/ml
0.5ml
0.25EU/ml
0.5ml样品（/倍稀释液）
7.3.4.验证项目、认可标准及验证方法
验证项目
认可标准
验证方法
凝胶限度试验
＜27.7EU/g
在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。
操作方法：
供试品溶液的制备（稀释倍数不得超过MVD）；阳性对照溶液的制备：
用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液；供试品阳性对照溶液的制备：
用待检测的供试品溶液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液（方法同供试品阳性对照溶液的制备）；阴性对照液用细菌内毒素检查用水。
取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1ml供试品溶液（其稀释倍数不得超过MVD）作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管，2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管，2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管。
加样结束后，将试管中溶液轻轻振动混匀，封闭管口，避免产生气泡，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60±2分钟。
备注：
凝胶限度试验需取样品3批进行三次试验，若样品不满足3批次，可选择同一批次进行3次独立试验。
7.3.5.验证结果
仪器名称：
试管恒温仪
仪器型号：
TAL-40D
设备编号：
03-ZL-189
恒温时间：
14:
24～15:
24
恒温温度：
37.0℃
/
/
项目
样品批号
供试品阳性对照
供试品溶液
阳性对照
阴性对照
是否符合
Ⅰ
Ⅱ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅰ
Ⅱ
是
否
20150807
样1
+
+
-
-
+
+
-
-
√
样2
+
+
-
-
+
+
-
-
样3
+
+
-
-
+
+
-
-
结论
根据《氯化钠细菌内毒素检查方法验证方案》D01-5302中既定项目进行确认，所有测试结果均符合规定要求。
检查人：
日期：
复核人：
日期：
QA：
日期：
8.验证总结论
8.1.整个验证过程进展顺利，未发生任何偏差；
8.2.按《氯化钠细菌内毒素检查方法验证方案》D01-5302对氯化钠细菌内毒素检查方法进行验证，所有验证项目的验证结果均符合要求。
证明了按照《中国药典》2015年版四部细菌内毒素检查法项下的有关规定检验，所采用的检验方法能够始终如一地获得符合客观实际的数据或结果，确保检验结果的准确性。
9.评价及建议
氯化钠细菌内毒素检查方法在未变更的情况下，应进行周期性再验证，再验证周期为三年。
若检验方法发生变更时应对变更后的检验方法进行验证。
四、附件
无
五、变更历史
变更前版本号
变更后版本号
变更原因
变更批准日期
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