植物组织培养讲稿.docx

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植物组织培养讲稿

第一章　绪论

目的要求：

1．掌握组织培养的概念和培养的类型

2．掌握组织培养的特点

3．一般掌握组织培养发展历史

4．初步掌握组织培养在农业实践上的应用

第一节　组织培养的意义

高等植物的组织培养（tissueculture）技术是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在无菌条件下培养的技术。

通常我们所说的广义的组织培养，是指通过无菌操作分离植物体的一部分（即外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。



组织培养按培养对象可分为植株培养、器官培养、组织培养、细胞培养和原生质体培养等。

１．植株培养（plantculture）　是对完整植株材料的培养，如幼苗及较大植株的培养。

　2．器官培养（organculture）　即离体器官的培养，根据作物和需要的不同,可以分离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果实等外植体的培养。

3.组织或愈伤组织培养（tissueorcallusculture）　为狭义的组织培养，是对植物体的各部分组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株。

4.细胞培养（cellculture）　　是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养。



5.原生质体培养（proplastculture）　是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。

组织培养是本世纪发展起来的一门技术，由于科学技术的进步，尤其是外源激素的应用，使组织培养不仅从理论上为相关学科提出了可靠的实验证据，而且一跃成为一种大规模、批量工厂化生产种苗的新方法，并在生产上越来越得到广泛的应用。

植物组织培养之所以发展如此快，应用的范围如此广泛，是由于其具备以下几个特点：

１．培养条件可以人为控制

组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化、以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。

２．生长周期短，繁殖率高

植物组织培养由于可人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长快，往往１个月左右为一个周期。

所以，虽然植物组织培养需一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。

３．管理方便，利于工厂化生产和自动化控制

植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化的高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。

与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。

第二节植物组织培养的发展

组织培养技术的蓬勃发展只是近50年的事，但它的整个历史可以追溯至19世纪末和上世纪初。

20世纪初，在schleiden和schwann所发展起来的细胞学说的推动下，1902年德国植物学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织为许多细胞组成的观点，以及植物细胞全能性的理论，即植物的体细胞，在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜在能力。

他首次发表了植物离体细胞培养实验的报告。

1912年，Haberlandt的学生Kotte和美国的Robins在根尖培养中获得了组织培养的成功。

Kotte采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各种氨基酸的培养基。

Robins用含无机盐、加葡萄糖或果糖的琼脂培养基，培养了长度为1.45-3.75厘米的豌豆、玉米和棉花的茎尖，形成了一些缺绿的茎和根。

自Haberlandt的实验之后，直到1934年美国的White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，并反复转移到新鲜培养基中继代培养，使根的离体培养实验获得了真正的成功，并在以后28年间培养了1600代。

这之后，white又以小麦根尖为材料，研究了光、温度、通气、pH、培养基组成等各种培养条件对生长的影响，并于1937年建立了第一个组织培养的综合培养基，其成份均为已知化合物，包括3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，该培养基后来被定名为White培养基。

与此同时，Gautheret（1934）在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了B族维生素和生长素对组织培养的重要意义，并于1939年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。

同年，White由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的组织培养物。

因此，Gautherer，White和Nobecourt一起被誉为组织培养学科的奠基人。

我们现在所用的培养方法和培养基，基本上都是由这三位科学家建立的。

后来，White于1943年发表了《植物组织培养手册》专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。

四十年代Skoog和崔徵在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，而能诱导形成芽，从而明确了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。

即这一比例高时，产生芽；这一比例低时，则形成根；相等则不分化。

在寻找促进细胞分裂的物质过程中，Miller等人于1956年发现了激动素。

不久即知道激动素可以代替腺嘌呤促进发芽，并且效果可增加3万倍。

结果上述控制器官分化的激素模式变为激动素与生长素的比例关系。

这方面的成功发现，有力地推动了植物组织培养的发展。

1952年，morel和Martin通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得无病毒植株。

1935～1945年Muir把单细胞放在一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂，即实施了看护接种技术，使单细胞培养获得初步成功。

1960年，cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。

1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不仅在理论上证明了无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上为外源基因的导入提供了理想的受体材料。

80年代中期以来，对禾谷类作物的原生质体培养也相继告捷，在这方面中国学者作出了重要贡献。

1962年印度Guha等人成功地在毛叶曼陀罗花药培养中，由花粉诱导得到单倍体植株，这促进了花药和花粉培养的研究。

以后相继在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草莓、苹果等多种植物获得成功，其数目达到160多种，其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培养在中国取得了引人注目的成就。

1960年，motel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，其繁殖系数极高。

由于这一方法有很大的应用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起兰花工业。

1973年Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体融合，获得了第一个体细胞杂种，Cocking等倡导的原生质体培养和体细胞杂交，研究得到了迅速发展，已经能使矮牵牛和烟草属的杂种细胞增殖分化生成杂种植株。

在整个组织培养发展的历史中，我国学者做出多方面的贡献，除了前述的崔徵的工作以外，还有1993年李继侗等关于玉米等植物离体根尖培养的工作，以及罗士韦关于幼胚和茎尖培养，李正理关于离体胚培养、王伏雄等关于幼胚培养的工作。

第三节组织培养与农业的关系

植物组织培养成为生物科学的一个广阔领域，除了在基础理论的研究上占有重要地位，在农业生产也得到越来越广泛的应用。

一、快速繁殖优良种苗

用组织培养的方法进行快速繁殖是生产上最有潜力的应用，包括花卉和观赏植物，其次是蔬菜、果树、大田作物及其它经济作物。

快繁技术不受季节等条件的限制，生长周期短，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。

快速繁殖可用下列手段进行：

通过茎尖、茎段、鳞茎盘等产生大量腋芽；通过根、叶等器官直接诱导产生不定芽；通过愈伤组织培养诱导产生不定芽。

试管快速繁殖应用在下列研究中：

1.繁殖杂交育种中得到的少量杂交种，以及保存自交系、不育系等。

2.繁殖脱毒培养得到的少量无病毒苗。

3.繁殖生产上急需的或种源较少的种苗。

由于组织培养周期短，增殖率高及能全年生产等特点，加上培养材料和试管苗的小型化，这就可使有限的空间培养出大量的植物，在短期内培养出大量的幼苗。

组织培养突出的优点是“快”，通过这一方法在较短时期内迅速扩大植物的数量，以一个茎尖或一小块叶片为基数，经组织培养一年内可增殖到10,000～100,000株。

二、无病毒苗（Virusfree）的培养

几乎所有植物都遭受到病毒病不同程度的危害，有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害，尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖，若蒙受病毒病，代代相传，越染越重。

自从Morel（1952）发现采用微茎尖培养的方法可得到无病毒苗后，微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一。

若再与热处理相结合，则可提高脱毒培养的效果。

对于木本植物，茎尖培养得到的植株难以发根生长，则可采用茎尖微体嫁接的方法来培育无病毒苗。

组织培养无病毒苗的方法已在很多作物的常规生产上得到应用，如马铃薯，甘薯，草莓，苹果，香石竹，菊花等。

已有不少地区建立了无病毒苗的生产中心，这对于无病毒苗的培养、鉴定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一个规范的系统程序，从而达到了保持园艺植物的优良种性和经济性状的目的。

三、在育种上的应用

植物组织培养技术为育种提供了许多手段和方法，使育种工作在新的条件下更有效的进行。

如用花药培养单倍体植株；用原生质体进行体细胞杂交和基因转移；用子房、胚和胚珠完成胚的试管发育和试管受精等；种质资源的保存等等。



胚培养技术很早就有利用，在种属间远缘杂交的情况下，由于生理代谢等方面的原因，杂种胚常常停止发育，因此不能得到杂种植物，通过胚培养就可保证远缘杂交的顺利进行。

到五十年代在实践上的应用就更多了，在桃、柑橘、菜豆、南瓜、百合、鸢尾等等许多园艺植物远缘杂交育种上都得到了应用。

大白菜×甘蓝的远缘杂交种“白兰”，就是通过杂种胚的培养而得到的。

对早期发育幼胚因太小难培养的种类，还可采用胚珠和子房培养来获得成功，利用胚珠和子房培养也可进行试管受精，以克服柱头或花柱对受精的障碍，使花粉管直接进入胚珠而受精。

花药、花粉的培养在苹果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘蓝、天竺葵等约20种园艺植物得到了单倍体植株。

在常规育种中为得到纯系材料要经多代自交，而单倍体育种，经染色体加倍后可以迅速获得纯合的二倍体，大大缩短了育种的世代和年限。

利用组织培养可以进行突变体的筛选。

突变的产生因部位而异，茎尖遗传性比较稳定，根、茎、叶乃至愈伤组织和细胞的培养则变异率就较大。

培养基的激素也会诱导变异，因浓度而不同。

此外还有采用紫外线、X射线、γ射线对材料进行照射，来诱发突变的产生。

在组织培养中产生多倍体、混倍体现象比较多，产生的变异为育种提供了材料，可以根据需要进行筛选。

利用组织培养，采用与微生物筛选相似的技术，在细胞水平上进行突变体的筛选更加富有成效。

原生质体培养和体细胞杂交技术的开发，在育种上展现了一幅崭新的前景。

已有多种植物的经原生质体培养得到再生植物，有些植物得到体细胞杂种，这无论在理论和实践上都有重要价值。

随着这方面工作的深入，水平的提高，原生质体培养一定会在育种上产生深远的影响。

四、工厂化育苗

近年来，组培苗工厂化生产已作为一种新兴技术和生产手段，在园艺植物的生产领域蓬勃发展。

组培苗工厂化生产，是以植物组织培养为基础，在含有植物生长发育必需物质的人工合成培养基上，并附加一定量的生长调节物质，把脱离于完整植株的本来已经分化的植物器官或细胞，接种在不同的培养基上，在一定的温度、光照、湿度及pH、值条件下，利用细胞的全能性以及原有的遗传基础，促使细胞重新分裂、分化长成新的组织、器官或不定芽。

最后长成和母株同样的小植物体。

例如非洲紫罗兰组培苗的工厂化生产，就是取样品株一定部位的叶片为材料，消毒后切成一定大小的块，接种在适宜的培养基上，在培养室内培养，两个月左右在切口处产生不定芽，这些不定芽再切割后又形成新的不定芽，如此继续，即可获得批量的幼小植株，按需要量生产与样品株完全相同的苗子。

工厂化生产组培苗，是按一定工艺流程规范化程序化生产的，具有繁殖速度快、整齐、一致、无虫少病、生长周期短、遗传性稳定的特点，可以加速产品的发展，尽快获得繁殖无性系。

特别是对一些繁殖系数低、杂合的材料有性繁殖优良性状易分离、或从杂合的遗传群体中筛选出表现型优异的植株，需要保持其优良遗传性，有更重要的作用。

组培苗的无毒生产，可减少病害传播，更符合国际植物检疫标准的要求，扩大产品的流通渠道，增加产品市场的销售能力，同时减少了气候条件对幼苗繁殖的影响，缓和了淡、旺季供需矛盾。

世界上一些先进国家园艺植物组织培养技术的迅速发展从60年代就巳经开始，并随着生长、分化规律性探索逐步深化，到了70年代仅花卉业就已在兰花、百合、非洲菊、大岩桐、菊花、香石竹、矮牵牛等二十几种花卉幼苗生产上建立起大规模试管苗商品化生产，到1984年世界花卉幼苗产业的生产总值已达二十亿美元，其中美国花卉幼苗市场总值为六亿多美元，日本三友种苗公司有60％的幼苗靠组织培养技术繁殖。

1985年仅兰花一项，在美国注册的公司就有100余家，年销售额在一亿美元以上。

由于组织培养技术的应用，加快了花卉新品种的推广。

以前靠常规方法推广一个新品种要几年甚至十多年，而现在快的只要l～2年就可在世界范围内达到普及和应用。

我国采用快速繁殖技术，也使优良品种达到迅速的推广和应用。

如广东切花菊“黄秀风”的应用，使菊花变大，长势加强，花色鲜艳，抗病力增强，打开了进入香港市场的渠道，使三十多种观叶植物的推广很快遍及全国，丰富了人们的生活；并将自然界的几百个野生金钱莲品种繁种驯化，培养了一批园林垂直绿化的材料，促进了园林业的发展。

植物组织培养也存有一定的困难，首先是繁殖效率与商品需要量的矛盾，有些作物由于繁殖方法尚未解决，因而无法满足生产的需要，其次是在培养过程中如何减少变异株的发生。

更重要的是应降低组培苗工厂化生产的成本，只有降低成本，才能更好的投产应用。

总之，随着组织培养这一技术的发展及各种培养方法的广泛应用，使这一技术在遗传育种、品种繁育等方面表现出了巨大的潜力，特别是生物工程和工厂化育苗实施以后，它将以新兴产业的面目在技术革命中发挥重大作用。

本章小结

1．植物组织培养是指分离单个或多个细胞或植物体的一部分，在人工配制的培养基上进行培养，使之长成一株完整植株的过程。

2．按照外植体的不同，植物组织培养可分为植株培养、胚胎培养、器官培养、细胞培养和原生质体培养5种类型。

3．组织培养具有：

培养条件可以人为控制；生长周期短；繁殖率高；管理方便；利于工厂化生产的特点。

因而发展迅速。

4．植物组织培养技术在农业生产上的应用主要体现在：

快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；植物育种；工厂化育苗等。

复习思考题

1．植物组织培养的广义与狭义概念？

2．外植体的含义？

3．根据外植体的不同，植物组织培养可以分为几种？

比较常用的是哪些？

4．植物组织培养有哪些特点？

5．你认为植物组织培养技术在目前的农业生产中有什么价值？

为什么？

第五章　植物组织培养的应用原理

目的要求：

1．一般掌握细胞全能性的含义

2．掌握愈伤组织形成过程中几个阶段的典型变化

3．一般掌握不定芽与胚状体发育成完整植株的主要差异

4．掌握由胚状体形成完整植株的主要特征

5．掌握植物生长物质对愈伤组织再分化的调控作用

第一节　细胞的全能性和植物的再生性

一、植物细胞的全能性

所谓细胞的全能性，就是植物的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。

根据细胞理论，细胞是生物有机体的基本结构单位，特别是植物细胞又是在生理上、发育上具有潜在全能性较强的单位。

在植物的生长发育中，从一个受精卵产生具有完整形态和结构机能的植株，这是全能性，是该受精卵具有该物种全部遗传信息的表现。

同样，植物的体细胞，也是从合子的有丝分裂产生的，也具全能性，具备着遗传信息的传递、转录和翻译的能力。

在一个完整的植株上某部分的体细胞只表现一定的形态，承受一定功能，这是由于它们受到自身遗传物质所决定以及具体器官或组织所在环境的束缚，但其遗传潜力并没有丧失。

一旦脱离原来所在的器官或组织，成为离体状态时，在一定的营养、激素和外界条件的作用下，就可能表现出全能性，而生长发育成完整的植株。

二、植物的再生作用

从植物分离出根、茎、叶等一部分器官，在切口处组织受到了损伤，但这些受伤的部位往往会产生新的器官，长出不定芽和不定根，从而成为新的完整的植株。

人们利用植物的再生作用来进行无性繁殖，到近代又结合应用生根性生长调节剂，使原来扦插不易成活的种类也可进行。

植物之所以会产生器官，是由于受伤组织产生了创伤激素，促进了周围组织的生长而形成愈伤组织，凭借内源激素和贮藏营养的作用又产生新的器官。

植物组织培养技术的成功，使植物的再生作用在更大的范围内表现出来。

表现为植物种类大大的增加，再生的部位大大的扩大。

而且小到肉眼无法辨别、在解剖镜下操作的材料也可培养再生。

在自然情况下，一些植物的营养器官和细胞再生比较困难，主要是由于内源激素调整缓慢或不完全，外界条件不易控制等因素所致。

在组织培养人工控制培养的条件下，通过对培养基的调整，特别是对激素成分的调整，就有可能顺利地再生。

在组织培养中再生植株还可通过与合子胚相似的胚胎发育过程进行，即形成胚状体再发育成完整植株。

在组培中诱导胚状体和诱导芽相比有以下优点：

数量多，速度快，结构完整。

在组织培养的研究中，已发现有分化胚状体能力的种子植物已达117种。

产生胚状体的离体培养物也是多种多样的，如从离体的根、茎、叶、花药、幼苗、子叶、子房中的合子胚、各种单细胞、游离的小孢子以及原生质体等。

关于诱导胚状体产生的因素，目前认为是激素作用的结果。

第二节　愈伤组织的形成和形态发生

在植物细胞、组织和器官培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并再分化成植株。

其整个过程大致可分为起动期、分裂期、分化期和形态发生期等四个时期。

在这四个时期中，其细胞组织的代谢状况，形态结构和细胞大小，都有明显的区别。

一、愈伤组织的形成

植物的任何器官和任何组织的细胞，在离体培养中，接受各种因素作用，细胞会发生分裂而脱分化，经持续分裂增殖成细胞团，并进一步分化发展成为不受亲体外植体影响的典型愈伤组织，这些愈伤组织可转移到新鲜的相同培养基上培养而长期保存，或在液体培养基中进行悬浮培养而迅速增殖，用于大规模生产有用化合物，或用于细胞培养筛选无性系，或用于原生质体培养等。

从单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：

（一）诱导期

诱导期是细胞准备进行分裂的时期。

接种的外植体材料的细胞通常都是成熟细胞，处在静止状态。

诱导期是通过一些刺激因素和激素的诱导作用，使其合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸物质的合成。

此期细胞的大小变化不大。

诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状况和外部因素而异。

如有的植物（菊芋）的诱导期只要一天，而有的植物（胡萝卜）需要几天。

CO2对诱导分化有抑制作用，因此，增加可利用的氧和迅速除去释放的CO2，有利于细胞分裂。

组织的机械损伤能诱导细胞开始分裂，如伤口往往出现愈伤组织。

在组织培养中沿用了愈伤组织的概念，其实组织培养中诱导的细胞组织，大都不是损伤的结果。

外源生长物质对诱导细胞开始分裂效果最好。

最常用的有2，4-D、NAA、IAA和细胞分裂素等。

静止细胞是具有分裂潜力的，只是被存在着的一类抑制剂所抑制，如果除去抑制物质，就可恢复分裂能力。

这些抑制物质的作用是阻碍DNA复制，若加入抵消抑制剂影响的物质，那么细胞就立即进行DNA复制，全部细胞进入合成期，并发生同步分裂。

分裂前的细胞内发生一系列的变动，首先是在切离和培养后的几秒钟内，细胞的气体交换迅速增加。

其次是多聚核糖体的不断增加，到有丝分裂前，每个细胞中的RNA含量增加到30%。

第三是在诱导期内，蛋白质也发生周期性积累，每个分裂细胞的总增加量约为200%。

第四是酶活力也有变化，在DNA复制前，DNA聚合酶活力增加；在分裂前，与代谢有关的酶类，如己糖激酶和一些脱氢酶的活力增加。

（二）分裂期

分裂期是指细胞通过一分为二的分裂，不断增生子细胞的过程。

外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始发生细胞分裂，使细胞脱分化。

1．细胞的数目迅速增加。

胡萝卜培养7天后，细胞数可增加10倍。

2．每个细胞平均鲜重下降。

这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。

3．细胞体积小，内无液泡，如同根尖和茎尖的分生组织细胞一样。

4．细胞的核和核仁增大到最大。

5．细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。

6．随着细胞不断分裂和组织生长，组织的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。

总之，分裂期的愈伤组织的共同特征是：

细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态。

如果在原培养基上继续培养，细胞将不可避免地发生分化，产生新的结构，但是把它及时转移到新鲜的培养基上，则愈伤组织可无限制地进行细胞分裂，而维持其不分化的状态。

外植体的脱分化因植物种类和器官及其生理状况而有很大差别，如烟草、胡萝卜等脱分化较易，而禾谷类的脱分化较难；花器脱分化较易，而茎叶较难；幼嫩组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。

（三）分化期

分化期是指停止分裂的细胞发生生理代谢变化而形成不同形态和功能的细胞。

细胞内开始发生一系列的形态和生理变化，导致细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。

1．细胞分裂部位和方向发生改变。

这时的主要特征是：

分裂期的细胞分裂局限在组织的外缘，主要是单周分裂；在分化期开始后，愈伤组织表层细胞的分裂逐渐减慢，直至停止。

愈伤组织内部深处的局部地区的细胞开始分裂，使分裂面的方向改变了，出现了瘤状结构的外表和内部分化。

2．分生组织瘤状结构和维管组织的形成。

迅速生长的愈伤组织，都是极相似的，而当愈伤组织生长速度减慢时，就出现特殊的形状和结构。

一个显著的特征是：

形成由分生组织组成的瘤状结构，它变成不再进一步分化的生长中心，而在其周缘产生扩展的薄壁细胞。

瘤状结构团团地散布在愈伤组织块中。

这时形成了维管组织，但不形成维管系统，而呈分散的节状和短束状结构，它可单由木质部组成，也可由木质部、韧皮部乃至形成层组成。

细胞分裂素促进维管化组织形成。

3．细胞的体积不再减小。

形成分化时的一个最好征兆，是愈伤组织细胞的平均大小突然不再减小，而在此以后，保持相对不变。

4．出现了各种类型的细胞。

如薄壁细胞、分生细胞、管胞、石细胞、纤维细胞、色素细胞、毛状细胞、细胞丝状体等。

5．生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色，有光泽，也有淡绿色或绿色的；老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。

二、愈伤组织的生长

外植体的细胞经过启动、分裂和分化等一系列深刻变化过程，形成了无序结构的愈伤组织块。

它们若在原培养基上继续培养，由于其中营养不足或有毒代谢物的积累，会导致愈伤组织块停止生长，直至老化变黑死亡。

因此，若要愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2～4星期）将它们分成小块，接种到新鲜的原培养基上继代培养，愈伤组织可长期保持旺盛的生长。

用继代培养维持愈伤组织生长，也是长期保存愈伤组织的一种方法。

一般来说愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增