植物组织培养.docx

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植物组织培养

绪论

植物组织培养（Planttissueculture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。

外植体：

愈伤组织：

一、植物组织的主要特征：

（1）在培养容器中进行；

（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；

（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。

（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；

（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。

二、植物组织培养类型：

根据不同分类的依据可以分为不同类型。

1、根据培养材料不同分为：

（1）完整植株培养（PlantCulture）：

对幼苗和较大植株等的培养。

（2）胚胎培养（EmbryoCulture）：

包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。

（3）器官培养（OrganCulture）：

包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。

（4）组织培养（TissueCulture）：

如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。

（5）细胞培养（CellCulture）：

指对单细胞或较小的细胞团进行培养。

（6）原生质体培养（ProtoplastCulture）：

指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。

3．植物组培的应用

1.植物离体快繁。

2.无病毒苗木培养。

3.培育新品种或创制新物种。

4.次生代谢物生产。

5.植物种质资源的离体保存。

6.人工种子。

第一章

1.）实验室包括：

准备室，无菌操作室，培养室，温室。

2.）器具的灭菌：

1、器具灭菌：

培养皿、解剖刀、镊子等用品。

（1）干热灭菌：

铝箔包好后，放于恒温干燥箱内，150℃保温2小时，成本较高。

（2）高压蒸汽灭菌：

高压蒸汽灭菌锅内120℃15－20分钟。

（3）灼烧灭菌：

接种时，解剖刀及镊子等浸入95％乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。

2、培养基灭菌：

采用高压蒸汽灭菌。

120℃15－20分钟。

培养基体积越大，灭菌时间越长。

3、不耐高温化合物：

采用过滤灭菌，如IAA等。

4、外植体的表面灭菌：

采用70－75％乙醇（10-30秒）、有效氯1％的次氯酸钠（5-30分钟）、0.1－0.2%的氯化汞（2-15分钟）等。

杀菌剂中加入几滴吐温－20或80（Tween－20或80）效果较好。

3）无菌操作：

1、保持接种室的无污染环境，定期熏蒸或喷雾处理，进行消毒。

接种前打开超净工作台及紫外灯照射20-30分钟，关闭紫外等灯后使气体散出后开始操作。

2、保持超净工作台的洁净：

接种前用70％乙醇擦拭台面或用喷壶喷雾，操作前，将手和手臂用70％乙醇消毒，所需试验用品用乙醇擦拭后放入超净工作台。

3、点燃酒精灯，进行操作，接种材料前后，灼烧瓶口，工具要灼烧彻底，防止交叉污染。

4、保持培养室的洁净，发现污染及时挑出，并在灭菌后清洗，以减少污染源。

5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，出入接种室换拖鞋以保持接种室的洁净。

4）通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分，

即矿质营养、可以把植物必需元素分为大量元素和微量元素。

国际植物生理学会建议将植物所需浓度大于0.5mmol/l的的元素称为大量元素。

低于0.5mmol/l的元素称为微量元素。

根据此规则大量元素种类包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S，微量元素包括Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等

有机成分、主要包括各种维生素和氨基酸，如硫胺素（VB1）、烟酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、泛酸钙（VB5）、生物素、钴胺素（VB12）、叶酸等以及甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。

有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛乳经酶法加工的水解产物，含有20种氨基酸的混合物，用量10－1000mg/L,通常用于原生质体等培养。

此外肌醇是另外一种重要的有机成分，又叫环己六醇，在糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及维持离子平衡等生理作用。

植物生长调节剂、常用的植物激素及生长调节物涉及五大类植物激素：

1、生长素类：

IAA、IBA、NAA、2，4-D2、细胞分裂类：

6-BA、KT（Kin）、ZT、2ip

3、赤霉素类：

GA3、GA4、GA74、脱落酸：

ABA5、乙烯：

ETH

碳源、碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。

常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在2－5％，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养。

糖浓度高低直接影响形态建成。

琼脂以及其他附加物等。

琼脂作为固化剂用于组织培养中，起支持植物的作用，不提供营养，为海藻中提取的一种高分子化合物，仅溶于热水（90oC以上），成为凝胶，冷却后（40oC以下）即凝固为凝胶。

琼脂的用量通常在4～10g/L.琼脂是组织培养培养基中主要的成本支出，约占80％。

5）培养基的具体步骤：

取出母液并按顺序放好，将有机营养物质贮液融化待用；取一只烧杯，放入三分之一左右纯水，将母液按顺序加入并不断搅拌；加入植物生长调节剂和蔗糖，待糖溶解后定容；将定容的培养基倒入容器中，加入琼脂，并加热视其溶解；调ph；分装封瓶；灭菌；冷却取出待用。

第二章植物组织培养的基本原理

1）植物细胞的全能性（Totipotency）即植物体细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的能力。

2）分化（differentiation）：

是指植物体各个部分出现异质性的现象，体现在细胞分化、组织分化、器官分化三个水平上。

3）脱分化（Dedifferentiation）：

也称去分化，指离体条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细胞的过程。

4）植物胚胎发生：

植物离体培养的细胞、组织、器官产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似合子胚胎发生和发育过程，这种现象称为植物体细胞胚胎发生，形成的类似胚的结构称为体细胞胚或胚状体。

1）植物离体培养中再生植株有哪些途径？

根、茎或芽器官的发生可使植株重建。

先诱导分化出芽，后形成根较好。

（还有先根后芽，先愈伤再根芽）

离体培养中再生植株的主要途径有：

器官发生；器官型（直接由外植体的细胞形成器官原基），器官发生型（外植体先形成愈伤组织，再产生器官原基）

胚胎发生（与合子胚的发生过程类似，体细胞胚在形态和生化水平上和合子胚都相似。

）

2）愈伤组织是如何形成与生长的？

在细胞脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。

愈伤组织的细胞往往是异质性的，无明显极性，其形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。

诱导期（起动期）：

是细胞准备分裂的时期。

细胞大小几不变，内部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。

分裂期：

外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。

细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。

在原培养基上，细胞必分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分裂，维持不分化状态。

分化期：

细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。

生长：

诱导期后，外植体外层细胞分裂，在组织受伤表面形成一层愈伤组织，细胞数目迅速增多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。

质地类型：

松脆和致密两种。

高浓度生长素，可使Callus变得松脆；高浓度细胞分裂素，则可使致密。

生理生化变化：

次生物质合成能力变化，对激素的需求变化等。

3）植物体细胞胚胎发生有哪些途径？

直接途径：

指从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎，如子叶、花序、珠心等外植体。

间接途径:

外植体先脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织的某些细胞重新“决定”为胚性细胞，进而分化出体细胞胚胎。

多数体细胞胚胎通过该途径形成的。

通常包括2个阶段：

（1）胚胎发生丛（Embryogenicclump）EC是由液泡小、细胞质浓的小细胞构成。

（2）胚状体的发育。

将EC转入降低或除去生长素、降低还原氮的培养基上培养即可。

4）影响植物离体形态发生的因素有哪些？

一、植物种类和基因型

1、植物种类不同难易程度不同；被子植物比裸子植物容易。

2、同一物种不同基因型间存在较大差别。

二、培养材料的生理状态

1、发育年龄：

一般幼态比老态组织形态发生能力高；

2、培养器官或组织类型：

细胞分裂旺盛的器官较好；

3、培养时间和细胞倍性：

一般取处于旺盛生长期的愈伤来诱导器官形成。

三、培养基

1、营养成分

一般认为，培养基中的铵态氮和K+有利于胚状体形成，提高无机磷的含量可促进器官发生。

茎尖培养和芽诱导培养基主要是MS及其修改的培养和B5培养基。

茎尖培养的起始培养基和芽增殖的培养基往往是不同。

碳水化合物种类及浓度对胚状体发育有重要作用。

缺糖或低糖无法形成胚状体。

2.植物激素及生长调节剂（起主导作用，通过影响内源激素的平衡起作用）

（1）生长素：

促进外植体生长、生根，并与细胞分裂素共同诱导不定芽分化及侧芽萌发与生长。

2，4–D诱导体细胞胚胎发生。

（2）细胞分裂素：

促进分化和芽形成，抑制根发育及衰老。

（3）赤霉素：

GA3促进茎的伸长，打破休眠，对芽的诱导和形成有促进作用。

（4）乙烯：

对芽的诱导和形成有促进或抑制作用

（5）脱落酸：

对体胚的发生及成熟很重要，可增加胚性愈伤组织的形成和体胚发生。

3、培养基的性质

（1）愈伤组织诱导：

在固体培养基上（胡萝卜、石刁柏）。

（2）细胞和胚状体的诱导：

在液体培养基上。

（3）诱导胚状体或早期胚状体培养：

渗透压，要求高.

四、培养条件

1、光照培养条件下，光照的作用是影响细胞的状态，而不是光合作用。

连续光照有利于培养细胞维管组织的形成。

昼夜光照有利于极性的建立及形态发生。

光强一般要求1000-5000lx。

植物间有所差别。

光照周期为10~16h/日。

不同波长光质作用不同，蓝光有利于芽的分化，红光有利于根系发生。

2、温度：

大多数培养温度为25±2℃.花药培养低温或高温预备处理。

3、气体：

氧气、二氧化碳以及乙烯等气体的浓度和通气状况。

5）、体细胞胚胎发生的两个特点：

双极性；母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，处于较为孤立的状态，即存在生理隔离。

第3章植物器官和组织培养

1）植物器官培养：

是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。

分为营养器官（根、茎、叶）和繁殖器官（果实、种子、花器官）培养。

2）植物分生组织（meristemculture）培养：

是指对植物的分生组织进行离体培养的技术，包括植物根尖、茎尖等顶端分生组织和形成层组织的培养。

其中茎尖培养广泛应用于植物再生和脱病毒研究。

1）植物器官和组织培养的基本程序是什么？

如何获得无菌培养材料？

一、无菌外植体的获得二、初代培养物的建立三、形态发生和植株再生四、培养产物的观察记载

清洗外植体，利用灭菌剂对外植体灭菌，无菌水冲洗3到5次。

2）离体茎尖经培养后将会出现怎样的培养反应？

生长太慢；生长过旺，愈伤增多；生长正常

3）植物脱病毒的机理是什么？

感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点（约0.1～1.0mm区域）则几乎不含或含病毒很少、这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。

在切取茎尖时越小越好，但太小则不易成活，过大又不能保证完全除去病毒。

4）影响茎尖组织培养脱毒效果的因素有哪些？

母体材料病毒侵染的程度；外植体的生理状态；起始培养的茎尖大小

第4章植物胚胎培养及离体授粉

1）植物胚胎培养:

指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植物的技术。

包括胚培养（成熟胚培养、幼胚培养）、胚珠培养、子房培养、胚乳培养、试管受精等类型。

2）植物离体授粉：

指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术。

3）胚珠培养:

在人工控制的条件下，对胚珠进行离体培养使其生长发育形成幼苗的技术。

4）胚乳培养：

是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。

5）子房培养：

是指将子房从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。

1）胚胎培养的类型？

成熟胚培养（以成熟胚为外植体）；幼胚培养（以未成熟胚为外植体，后继出现胚性生长和早熟萌发）

2）什么是幼胚的“早熟萌发”？

幼胚培养时迅速萌发形成幼苗，不能维持胚性生长。

3）为什么幼胚培养比成熟胚培养要求的培养基和培养条件更为严格？

由于成熟胚生长不依赖胚乳的贮藏营养，只要提供合适的生长条件及打破休眠，它就可以在比较简单的培养基上萌发生长，形成幼苗。

幼胚对营养物质的需求较成熟胚复杂，以保证离体幼胚能沿着胚胎发生的途径发育。

4）比较胚培养、胚珠培养和子房培养的异同。

5）胚胎培养在育种工作中有哪些应用？

1、克服远缘杂交不亲和性；如利用“胚胎拯救（Embryorescue）”技术获得远缘杂种。

2、打破种子休眠，缩短育种周期

3、提高种子萌发率；特别是对于一些长期营养繁殖的植物种子。

6）子房培养的意义？

获得杂种植株；

未授精子房培养为试管受精提供技术基础；

未受精子房培养能获得获得单倍体植株，用于单倍体育种。

7）胚珠培养的意义？

防止杂种胚早期败育，获得杂种植株；

受精前胚珠培养，可作为试管受精的基础；

未受精胚珠培养，能培养获得单倍体植株，用于单倍体育种。

8）离体授粉的意义主要表现在哪些方面？

可以克服远缘杂交中的不亲和性，特别是离体子房授粉和离体胚珠授粉，能消除柱头和花柱所造成的受精前障碍。

9）糖在胚胎培养中的作用

调节渗透压；碳源；防止幼胚早萌。

第5章植物花药和花粉培养

1）花药和花粉培养：

指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。

该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径”或“雄核发育”。

1）植物单倍体培养分哪两类，各有何特点？

花药培养、花粉培养

胚珠或子房培养（未受精）

2）什么是Haploid（单倍体）?

为何育种者对其感兴趣？

只具有单套染色体组的植株。

作物育种；物种进化研究；遗传分析；分子生物学；植物基因克隆筛选。

3）什么是Androgenesis（雄性单性生殖）?

影响花药培养的主要因素有哪些？

基因型；植株生长条件和生理状态：

花粉发育时期；预处理（高低温，化学物质，离心，射线）；培养基；培养条件；花药壁因素。

4）为何要将单倍体加倍成双单倍体？

有哪些方法？

单倍体高度植株高度不育，要充分利用单倍体，只有将它加倍成纯和的二倍体。

一）自发加倍将单倍体植株的一部分作为为植体（通常用茎段）进行培养，诱导愈伤组织形成。

由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。

（二）化学试剂诱变有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。

1、秋水仙素诱导

（1）浸泡法无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株，再转移至新鲜培养基中培养。

（2）生长锥处理秋水仙素水溶液直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）。

（3）培养基处理将单倍体植株和任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度和秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的相同培养基中继续培养诱导胚状体。

2、除草剂诱导（毒性小，引起植株的变异几率小）

5）如何区分单倍体和双单倍体？

如何区别双单倍体和正常杂合二倍体？

1、染色体直接计数法：

通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。

2、间接鉴定

（1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。

（2）细胞形态学鉴定法叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。

（3）植株形态学鉴定法单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。

（4）杂交鉴定法自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。

（5）分子标记鉴定包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）

（1）形态比较

（2）自交或测交鉴定法自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。

（3）分子标记鉴定包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）

6）简要描述单倍体培养的一般程序。

选择合适的供体植株；预处理花药（物理或生理逆境）；收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子；培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体；胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株；倍性鉴定或染色体加倍。

7）花粉分离和纯化方式

自然散落法；挤压法；机械游离法；小孢子分离和纯化。

8）花粉培养方法

平板培养；液体培养；双层培养；看护培养；微室培养；条件培养基培养。

第六章植物细胞及原生质体培养

1）植物细胞培养（plantcellculture）：

指对植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞（或小细胞团）进行培养，形成单细无性系或再生植物的技术。

2）单细胞的分离：

机械法和酶解法。

3）单细胞培养：

对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直到长成完整植株的技术。

培养方法：

平板培养、看护培养、微室培养、条件培养基培养法。

4）植物细胞培养的意义：

（1）研究细胞生理代谢过程及各种影响因子；

（2）用于植物品种的改良；

（3）用于植物次生代谢物质的生产。

5）细胞的悬浮培养方法

分批培养；半连续培养；连续培养；

6）影响细胞培养的因素

培养基；细胞密度；植物生长调节剂；ph和二氧化碳浓度。

7）植物细胞培养的应用。

一、植物次生代谢产物的生产

二、突变体的选择

三、诱导多倍体

四、生产人工种子

8）人工种子：

一般是指离体培养的条件下的植物材料，通过繁殖获得大量的高质量的成熟胚状体，把这些胚状体外面包上有机化合物作为保护胚状体及提供营养的“种皮”。

第7章植物原生质体培养及细胞融合

1.植物原生质体融合：

指通过物理或化学方法使原生质体融合，经过培养获得具有双亲全部遗传物质的后代方法。

2.简述分离细胞的方法；

机械分离法；酶分离法（纤维素酶，果胶酶）；

3.单细胞培养的基本方法有几种；

平板培养、看护培养、微室培养、条件培养基培养法。

4.简述植物原生质培养及细胞融合的作用；

（1）可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配子不亲合性；

（2）可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，且获得的遗传变异范围极广；

（3）一次操作可实现两个以上亲本的融合作用

（4）可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种；

（5）可形成有性生殖障碍植物的种间杂种；

5原生质体培养方法

平板培养法；液体浅层培养法；固液结合培养法。

6.原生质体再生

细胞壁再生；细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成；植株再生。

7.杂种细胞的选择

互补筛选法；（激素自养型互补选择；白化互补选择；营养缺陷型互不选择；抗性突变体互补选择；基因互不选择。

）

机械筛选法；（天然颜色标记分离；荧光素标记分离；荧光活性自动细胞分类器分类融合体）

8.杂种植株的选择

形态学鉴定；细胞学鉴定；生物化学鉴定；分子生物学鉴定。

第8章植物体细胞无性系变异

1）体细胞无性系变异：

指培养物在培养阶段发生变异，进而导致再生植株亦发生遗传改变的现象。

2）影响植物体细胞无性系变异的因素；

外植体；物种和基因型；培养基；继代培养时间。

3）植物体细胞无性系变异在育种中的应用。

改良作物品种，拓宽种植资源；加强外源基因向栽培种的渐渗；遗传学研究；发育生物学研究；代谢途径研究；

4）体细胞变异的优缺点：

优点：

适用于各种可进行组织培养的作物；持续快速提供变异源；消除优良品种的一个或几个缺陷；提供新型变异株系；

缺点：

继代培养多次以后，植株再生能力减弱；一些变异经自交或杂交以后，表现不稳定；这种变异没有可预见性往往产生一些不符合育种需求的变异。

5）诱变材料的选择；自发变异；细胞诱变；突变体筛选；突变体稳定性鉴定。

6）体细胞无性系变异机理。

预先存在的变异表达；染色体数目变化；点突变；体细胞染色体变换及姐妹染色单体交换；ＤＮＡ复制和缺失；转座因子的活化；ＤＮＡ甲基化

第9章植物离体繁殖、

1）植物离体快繁：

指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其在短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。

是工厂化育苗的技术基础。

2）植物快繁与传统营养繁殖相比的优点：

繁殖效率高。

生长速度快；培养条件可控制性强；占用空间小；管理方便，利于自动化控制；便于种质交换和保存。

3）植物快繁的器官发生类型有哪些？

植物快繁的器官再生主要分为五种类型：

短枝发生型；丛生芽发生型；不定芽发生型；胚状体发生型；原球茎发生型

4）如何区分体细胞胚和不定芽？

5）试述植物快繁的全过程及影响因素。

植物快繁的程序包括四个阶段：

无菌（或初代）培养的建立；繁殖体增殖；芽苗生根；小植株的移栽驯化

外植体；培养基；培养条件；继代培养；移栽

6）植物离体繁殖商业化生产中应注意哪些问题？

A污染污染的来源：

培养基及器具、器皿污染；外植体灭菌不彻底；操作原因；环境原因等

污染的控制：

灭菌彻底；操作正确；保持操作区环境清洁无菌。

B.遗传稳定性影响遗传稳定性的因素：

基因型；继代次数；器官发生方式。

降低遗传变异的措施：

选用合适的基因型；减少继代次数；采用合适的器官发生方式；减少生长调节剂的使用浓度。

C玻璃化：

生理失调症状，表现为叶片、嫩梢呈水浸透明或半透明状。

叶片脆弱易碎，角质层发育不全，没有功能性气孔。

器官分化能力低，生根难，移栽后不易成活。

玻璃化苗发生原因：

琼脂和蔗糖浓度偏低；培养温度偏高；细胞分裂素浓度偏高；乙烯的影响；光照偏弱；培养基含量偏高等因素。

防止玻璃化苗发生的措施：

提高培养基硬度；降低培养基水势；提高蔗糖含量；增加培养瓶气体交换，降低湿度；增加光照，降低温度等。

D褐化：

是由于培养材料中的酚类物质被氧化形成。

影响褐化发生的因素：

植物种类和品种（如木本比草本更易褐化）；外植体年龄和取材料时间；外植体损伤程度；光温因素；培养基成分。

E黄化

第11章植物种质资源离体保存

1）种质资源的离体保存：

是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。

2）限制生长保存法：

一、低温保存法

是限制生长保存中应用最广的方法。

培养温度一般为1-9℃（热带、亚热带植物则一般为10-20℃），同时提高培养基的渗透压，培养物的生长受到抑制，继代时间可延长间隔数月到1年以上。

二、高渗透压保存法

三、生长抑制（或延缓剂）保存法，如加入ABA、矮壮至少、多效唑等

四、降低氧分压保存法

五、干燥保存法

对培养物台愈伤或体细胞胚进行脱水处理，然后置于特定的培养基条件下保存。

3）植物超低温种质保存是指将植物的离体材料包括茎尖（芽）、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法处理后在超低温（-196℃液