高考 一轮复习 人教版 微生物的培养和分离 学案doc.docx

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高考一轮复习人教版微生物的培养和分离学案doc

2020届一轮复习人教版微生物的培养和分离学案

见《自学听讲》P248

学科素养

课程标准

学习指导

1.生命观念:

能从细胞水平认识生物体的结构与功能是相适应的,生物的适应性是长期进化的结果。

2.科学思维:

通过研究培养基对微生物的选择作用,从不同的生命现象中,基于事实和证据,运用归纳的方法概括出生物学规律。

3.科学探究:

设计分离微生物的实验,针对日常生活的真实情境提出清晰的、有价值的、可探究的生命科学问题或可达成的工程学需求。

4.社会责任:

关注微生物在生产生活中的应用;能通过科学实践,尝试解决现实生活中的生物学问题。

1.进行微生物的培养和分离。

2.测定某种微生物的数量。

3.研究培养基对微生物的选择作用。

4.探讨微生物的利用。

5.尝试利用微生物进行发酵来生产特定的产物。

备考中要加强微生物的实验室培养技术、特定微生物数量的测定方法、培养基对微生物的选择作用等的记忆和理解,特别是关于微生物的培养和分离、计数及鉴定方面的应用,注意微生物培养过程中无菌操作的方法和原理,掌握微生物培养与计数的方法,记住尿素分解菌和纤维素分解菌的鉴定方法等。

微生物的培养和分离

　　1.培养基

（1）概念:

人们按照微生物对　营养物质　的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质。

（2）营养组成:

一般都含有水、碳源、　氮源　和无机盐。

此外,还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。

（3）种类

①按照物理性质可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。

②按照成分的来源可分为天然培养基和合成培养基。

③按照功能用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。

2.无菌技术常用方法

3.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基:

计算→称量→溶化→灭菌→　倒平板　。

4.纯化大肠杆菌的方法

（1）平板划线法:

通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

（2）稀释涂布平板法:

将菌液进行一系列的　梯度稀释　,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。

5.菌种的保存方法

（1）对于频繁使用的菌种,可以采用临时保藏的方法。

（2）对于需要长期保存的菌种,可以采用甘油管藏的方法。

某种微生物数量的测定

　　1.统计原理:

当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。

2.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

项目

内容

实验原理

①能合成脲酶的细菌才能分解尿素;

②配制以　尿素　为唯一氮源的培养基,能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌 

数量统计

①直接计数法（显微镜下用特定细菌计数板或血细胞计数板）;

②间接计数法:

稀释涂布平板法

实验流程

土壤取样→配制土壤溶液和制备培养基→系列稀释→涂布平板与培养→菌落计数

（1）统计菌落数目一般用　稀释涂布平板　法。

（2）统计菌落数目时,培养基表面生长的1个菌落,来源于样品稀释液中的1个活菌。

为了保证结果准确,一般选择菌落数在　30~300　的平板进行计数。

（3）从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算公式:

每克样品中的菌落数=　（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数　。

（4）设置重复组,增强实验的说服力与准确性。

培养基对微生物的选择作用

　　1.筛选菌株

（1）原则:

人为提供有利于目的菌株生长的条件,同时抑制或阻止其他微生物的生长。

（2）目的:

在培养基上形成的由　单个菌种　繁殖而来的子细胞群体——菌落。

　　2.纤维素分解菌的分离

（1）方法:

　刚果红染色法　。

（2）

刚果红

纤维素 →红色复合物

红色消失、出现　透明圈　。

注意:

纤维素酶是一种复合酶,它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,其作用如下:

（3）标志:

使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基,根据　是否产生透明圈　来筛选纤维素分解菌。

（4）操作流程

土壤取样:

富含　纤维素　的环境 

　↓

选择培养:

用　选择培养基　培养,以　增加纤维素分解　 

　　　　　菌的数量　 

　梯度稀释　 

　↓

涂布平板:

将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

　↓

挑选产生透明圈的菌落:

产生　纤维素酶　的菌落周围出 

　　　　　　　　　　现透明圈

　　1.易混淆选择培养基与鉴别培养基

（1）选择培养基允许特定的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长。

如土壤中分解尿素的细菌的分离利用的是选择培养基。

（2）鉴别培养基是在培养基中加入某种特殊的化学物质,某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物,而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应,产生明显的特征性变化,根据这种特征性变化,可将该种微生物与其他微生物区分开来的培养基。

用于筛选纤维素分解菌的培养基就是鉴别培养基。

　　2.易混淆分离和计数所用的方法

（1）平板划线法:

只能分离,不能计数。

（2）稀释涂布平板法:

既能分离,也能计数。

见《自学听讲》P250

微生物的分离和培养

　　1.培养基的配制原则

（1）目的要明确:

配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。

（2）营养要协调:

注意各种营养物质的浓度和比例。

　　（3）pH要适宜:

细菌为6.5~7.5,放线菌为7.5~8.5,真菌为5.0~6.0,培养不同微生物所需的pH不同。

　　2.微生物对主要营养物质的需求特点

（1）自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐,碳源可来自大气中的CO2,氮源可由含氮无机盐提供。

（2）异养型微生物所需的营养物质主要是有机物,即碳源必须由含碳有机物提供,氮源也主要是由有机物提供,部分异养型微生物也可以利用无机氮源。

　　3.选择培养基与鉴别培养基的比较

类型

原理

用途

实例

选择培

养基

依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好、抗性而设计

从众多微生物中分离所需的微生物

培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌

培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌

以尿素作为唯一氮源的培养基分离分解尿素的细菌

不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物

石油是唯一碳源时,分离可降解石油污染的微生物

培养基放在高温环境中培养,分离耐高温的微生物

鉴别培

养基

依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中的特定试剂或化学药品反应,产生明显的特征性变化而设计

鉴别不同种类的微生物

伊红—美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌（菌落呈黑色并带有金属光泽）

　4.消毒和灭菌的比较

项目

条件

结果

常用方法

应用范围

消毒

较为温和的物理或化学方法

仅杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）

煮沸消毒法

日常用品

巴氏消毒法

不耐高温的液体

化学药剂消毒法

用酒精擦拭双手,用氯气消毒水源

灭菌

强烈的理化因素

杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子

灼烧灭菌法

接种工具

干热灭菌法

玻璃器皿、金属工具

高压蒸汽灭菌法

培养基及容器的灭菌

　5.接种和划线的注意事项

（1）接种环的灼烧

①第一次划线前:

杀死接种环上的微生物,避免污染培养物。

②每次划线前:

杀死残留菌种,保证每次划线菌种来自上次划线末端。

③划线结束后:

杀死残留菌种,避免污染环境和感染操作者。

（2）灼烧接种环之后,要冷却后再进行操作,以免温度太高杀死菌种。

（3）划线用力大小要适当,防止用力过大将培养基划破。

1.两种纯化细菌方法的辨析

比较项目

平板划线法

稀释涂布平板法

关键操作

接种环在固体平板培养基表面连续划线

一系列的梯度稀释;涂布平板法操作

注意事项

每次划线前后均需灼烧接种环

稀释度要足够高,为确保实验成功可以增加稀释度的范围

菌体获取

在具有显著菌落特征的区域的菌落中挑取菌体

从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体

优点

可以根据菌落的特点,分离获得某种微生物的单细胞菌落

既可以获得单细胞菌落,又能对微生物进行计数

缺点

不能对微生物计数

操作复杂,需要涂布多个平板

　　2.判断纯化微生物培养的两种接种方法

（1）接种后在平板上形成的菌落呈线状分布,说明接种所用的方法是平板划线法。

利用平板划线法接种后,在平板培养基上形成的菌落应该呈线状分布,且菌落密度越来越稀。

如果纯化细菌时发现培养基上的菌落连成了一片,最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌;采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。

（2）接种后在平板上形成的菌落不呈线状分布,说明接种所用的方法是稀释涂布平板法。

如果涂布不均匀,导致培养后在平板上形成的菌落分布不均匀。

例1　（2018年扬州模拟）微生物培养过程中,要十分重视无菌操作。

现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作,防止杂菌污染。

请分析下列操作中错误的是（　　）。

①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢　②接种操作要在酒精灯火焰附近进行　③无菌繁殖脱毒苗时,植物的外植体要进行消毒　④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌　⑤培养基要进行高压蒸汽灭菌　⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌

A.①③　　　B.②④　　　C.③⑤　　　D.④⑥

解析　无菌操作包括消毒和灭菌。

需进行消毒处理的有植物的外植体及操作人员的双手等,需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂（指示剂或染色剂）等。

煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢,属于消毒;为防止空气中杂菌污染,接种操作要在酒精灯火焰附近进行;家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌,故不能对葡萄进行灭菌;培养基常进行高压蒸汽灭菌。

故④⑥操作错误。

答案　D

某种微生物数量的测定

　　1.统计菌落数目的方法

（1）显微镜直接计数法

①原理:

利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

②方法:

血细胞计数板法。

a.结构:

常用的是1mm×1mm×0.1mm方格的计数板（如图）,由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成,玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台。

中间的平台较宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面刻有一个方格网。

上面分别刻有9个大方格,其中只有中间的大方格为计数室,可见每个计数板上有两个计数室。

大方格的长和宽各为1mm,深度为0.1mm,其容积为0.1mm3;大方格内分为16（25）个中格,每一中格又分为（25）16小格,即大方格是由400个小方格组成的。

b.操作:

在清洁干燥的血细胞计数板的计数室上加盖专用的盖玻片,用吸管吸取稀释后的菌液,滴于盖玻片边缘,让培养液自行缓缓渗入,充满计数室。

c.计数:

在显微镜下计数4~5个中方格内的菌体数,求出每个小方格所含有的菌体的平均数,按照以下公式计算:

每毫升原液含有的菌体数=每小格平均菌体数×400×104×原液被稀释倍数。

③缺点:

不能区分死菌与活菌。

（2）间接计数法（活菌计数法）

①原理:

当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。

通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计算公式:

每克样品中的菌株数=（C÷V）×M,其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）,M代表稀释倍数。

③操作:

设置重复组,增强实验的说服力与准确性。

同时为了保证结果准确,一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。

在进行微生物计数时,要每隔24h观察统计一次菌落种类和数量,选取菌落种类和数量稳定时的数量作为统计结果,防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的种类和数目。

　　1.微生物计数的2种方法及结果“偏大”或“偏小”

（1）直接计数法:

需借助显微镜用血细胞计数板观察,由于不能区分死菌与活菌,所以实验结果偏大。

（2）间接计数法:

稀释涂布平板法,当两个或多个细胞连在一起时,平板上只能观察到一个菌落,所以计数结果偏小。

2.正确理解“选择菌落数在30~300的平板”进行计数

（1）只得到1个菌落数在30~300的平板是错误的。

原因是不符合实验的重复原则,易受到偶然因素的影响。

（2）在同一稀释度下,至少对3个平板进行重复计数,然后求出平均值,并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

如果某个平板的菌落数与其他差别甚远,说明该平板操作过程中出现失误,应舍弃。

（3）并不是只要得到3个菌落数在30~300的平板即可,而应该是涂布的同一稀释度的平板,其上菌落数在30~300且无较大差异,才能按照计算公式进行计算,如得到3个平板菌落数分别为230、30、240,虽然菌落数均在30~300之间,但30与230、240差异太大,应重新实验找出原因。

例2　在农业生产研究上,常需要进行微生物的分离和计数。

下图是某同学采用的接种微生物的方法,请回答下列问题:

（1）本实验采用的接种微生物的方法是　　　　　　　　法,把聚集的菌种逐步　　　　分散到培养基的表面,为达到这一目的,操作上应注意:

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（回答2项）。

（2）三位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中细菌数量,在对应稀释倍数为106的培养基中,得到以下统计结果:

甲同学涂布了两个平板,统计的菌落数是236和260,取平均值248;

乙同学涂布了三个平板,统计的菌落数是210、240和250,取平均值233;

丙同学涂布了三个平板,统计的菌落数是21、212和256,取平均值163;

在三位同学的统计中,　　　　同学的统计是正确的。

解析　

（1）据图分析可知,图示表示的接种方法是平板划线法,是把聚集的菌种逐步稀释到培养基的表面,操作上应注意每次划线前要灼烧接种环;冷却后从上一次划线的末端开始划线。

（2）在进行平板菌落计数时,应选择菌落数在30~300之间的平板,同时为减小误差应选择至少3个或3个以上的平板进行计数并取平均值,在三位同学的统计中,乙同学的统计是正确的。

答案　

（1）平板划线　稀释　每次划线前要灼烧接种环,冷却后从上一次划线的末端开始划线　

（2）乙

培养基对微生物的选择作用

　　筛选微生物的两个实例的比较

比较

项目

土壤中分解尿素的细菌的分离

分解纤维素的微生物的分离

方法

利用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养

利用以纤维素为唯一碳源的选择培养基进行培养

原理

只有分解尿素的细菌能够合成脲酶,才能在以尿素为唯一氮源的培养基上生长

因为培养基中纤维素为唯一碳源,只有分解纤维素的微生物能够生存下来,从而大量繁殖

鉴定

在培养基中加入酚红指示剂,指示剂变红说明尿素被分解,从而说明菌落中的菌体为分解尿素的细菌

刚果红染色法,菌落周围出现红色消失的透明圈,该菌落为分解纤维素的微生物菌落

　　1.联系课本,分析鉴别微生物的两种鉴别培养基

（1）添加酚红指示剂的培养基:

尿素分解菌可使该培养基变红。

（2）添加刚果红的培养基:

纤维素分解菌的菌落周围产生透明圈。

　　2.与“透明圈”有关的问题

（1）刚果红可以与纤维素形成红色复合物,但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。

细菌分泌的纤维素酶能将培养基中的纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖,形成透明圈。

（2）图中透明圈大小与纤维素酶的量和活性有关,降解纤维素能力最强的是菌株①。

解决这种问题时,可以比较菌落“直径”与透明圈“直径”的相对大小,二者相差越大,说明降解力越强。

例3　下表为两种微生物的培养基配方:

A组

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O

葡萄糖

尿素

琼脂

1.4g

2.1g

0.2g

10.0g

1.0g

15.0g

B组

纤维

素粉

NaNO3

Na2HPO4

·7H2O

KH2PO4

MgSO4·

7H2O

KCl

酵母膏

水解

酪素

5g

1g

1.2g

0.9g

0.5g

0.5g

0.5g

0.5g

　　注:

上述两种培养基中的物质溶解后,均用蒸馏水定容至1000mL

（1）从功能上来看,上述两种培养基均属于　　　　培养基。

（2）如果要对土壤中分解尿素的细菌进行分离,则需要选择　　　　（填“A”或“B”）培养基,该培养基中的碳源是　　　　　。

（3）在分离尿素分解菌所用的培养基中可加入　　　　指示剂,根据指示剂的颜色可鉴定某种细菌能否分解尿素,若有分解尿素的细菌,培养基将会呈现　　　　。

解析　

（1）据题表中的培养基的配方分析可知,A组中的氮源为尿素,是筛选尿素分解菌的选择培养基。

B组中的碳源是纤维素,是筛选纤维素分解菌的选择培养基。

（2）对土壤中分解尿素的细菌进行分离时,需要使用以尿素为唯一氮源的选择培养基,故应当选择A组培养基,该培养基中的碳源是葡萄糖。

（3）尿素分解菌可以用酚红指示剂进行鉴定,尿素分解菌产生的脲酶能够将尿素分解为氨而使pH升高,使酚红指示剂呈红色。

答案　

（1）选择　

（2）A　葡萄糖　（3）酚红　红色

1.（2018年全国Ⅰ高考）将马铃薯去皮切块,加水煮沸一定时间,过滤得到马铃薯浸出液。

在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂,用水定容后灭菌,得到M培养基。

回答下列问题:

（1）M培养基若用于真菌的筛选,则培养基中应加入链霉素以抑制　　　　的生长,加入了链霉素的培养基属于　　　　　　培养基。

（2）M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质,营养物质类型除氮源外还有　　　　　　　　　（答出两点即可）。

氮源进入细胞后,可参与合成的生物大分子有　　　　　　　　　（答出两点即可）。

（3）若在M培养基中用淀粉取代蔗糖,接种土壤滤液并培养,平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。

加入的显色剂是　　　　　　,该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。

（4）甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量,在同一稀释倍数下得到以下结果:

甲同学涂布了3个平板,统计的菌落数分别是110、140和149,取平均值133;

乙同学涂布了3个平板,统计的菌落数分别是27、169和176,取平均值124。

有人认为这两位同学的结果中,乙同学的结果可信度低,其原因是 

　。

解析　

（1）M培养基若用于真菌的筛选,说明M培养基能满足真菌的生长,链霉素是一种抗生素,可以抑制细菌的生长。

加入了链霉素的培养基能筛选出真菌,该培养基属于选择培养基。

（2）氮源进入细胞后,可参与合成含氮的生物大分子。

（3）淀粉遇碘显蓝色,产淀粉酶的细菌能水解培养基中的淀粉,形成透明圈。

（4）乙同学结果不合理,因为1个平板的计数结果与另2个相差悬殊,结果的重复性差,不能简单地用其平均数作为最终结果。

答案　

（1）细菌　选择　

（2）碳源、无机盐　蛋白质、核酸　（3）碘液　淀粉遇碘液显蓝色,产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解,形成透明圈　（4）乙同学的结果中,1个平板的计数结果与另2个相差悬殊,结果的重复性差

2.（2018年全国Ⅱ高考）在生产、生活和科研实践中,经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。

回答下列问题:

（1）在实验室中,玻璃和金属材质的实验器具　　　　（填“可以”或“不可以”）放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。

（2）牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法,与煮沸消毒法相比,这两种方法的优点是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。

（3）密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒,其原因是紫外线能　　　　　　　　　　　　,在照射前,适量喷洒　　　　,可强化消毒效果。

（4）水厂供应的自来水通常是经过　　　　（填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”）消毒的。

（5）某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时,若压力达到设定要求,而锅内并没有达到相应温度,最可能的原因是　　　　　　　　　　　　　。

解析　

（1）能耐高温的、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。

（2）煮沸消毒法即在100℃时煮沸5~6min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢;巴氏消毒法即在70~75℃条件下煮30min或在80℃条件下煮15min,可以杀死微生物,并且保证营养物质不被破坏。

因此,与煮沸消毒法相比,牛奶消毒常采用的巴氏消毒法或高温瞬时消毒法的优点是达到消毒目的的同时,营养物质损失较少。

（3）因紫外线能破坏DNA结构,所以密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒。

在照射前,适量喷洒消毒液,可强化消毒效果。

（4）通常乙醇消毒用的是75%的酒精,因乙醇有气味,影响水质,不适宜用于自来水消毒;高锰酸钾本身有颜色,消毒后溶液呈紫红色,无法使用;因此水厂供应的自来水通常是经过氯气消毒的。

（5）采用高压蒸汽灭菌时,待锅内的水煮沸,将其中原有的冷空气彻底排除后才能将锅密闭。

如果未将锅内冷空气排尽,则会出现压力达到设定要求,而锅内并没有达到相应温度的现象。

答案　

（1）可以　

（2）在达到消毒目的的同时,营养物质损失较少　（3）破坏DNA结构　消毒液　（4）氯气　（5）未将锅内冷空气排尽

3.（2018年江苏高考）酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半,可作为饲料蛋白的来源。

有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养,这样既可减少污染又可降低生产成本。

研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母,并进行大量培养。

下图所示为操作流程,请回答下列问题:

（1）配制培养基时,按照培养基配方准确称量各组分,将其溶解、定容后,调节培养基的　　　　,及时对培养基进行分装,并进行　　　　　　灭菌。

（2）取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中,在步骤③中将温度约　　　　（在25℃、50℃或80℃中选择）的培养基倒入培养皿混匀,冷凝后倒置培养。

（3）挑取分离平板中长出的单菌落,按步骤④所示进行划线。

下列叙述合理的有　　　　。

a.为保证无菌操作,接种针、接种环使用前都必须灭菌

b.划线时应避免划破培养基表面,以免不能形成正常菌落

c.挑取菌落时,应挑取多个菌落,分别测定酵母细胞中甲醇的含量

d.可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度,获得甲醇高耐受株

（4）步骤⑤中,为使酵母数量迅速增加,培养过程中需保证充足的营养和　　　　供应。

为监测酵母的活细胞密度,将发酵液稀释1000倍后,经等体积台盼蓝染液染色,用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数,理论上　　　　色细胞的个数应不少于　　　　,才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。

解析　

（1）配制培养基的操作步骤为计算→称量→溶化→定容→调pH→培养基的分装→包扎→灭菌,因此微生物的培养基配制好后应该先调节pH,再分装。

常见的灭菌方法有:

干热灭菌、高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌。

培养基适宜用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。

（2）在步骤③中,待培养基冷却至50℃左右时进行倒平板。

（3）在划线过程中,接种针、接种环使用前都必须灭菌,以防止杂菌污染,a正确;划线时应避免划破培养基表面,否则将不能形成正常菌落,b正确;该实验的目的是获得利用工业废甲醇作为碳源的酵母菌,不需要测定酵母菌中的甲醇含量,c错误;培养基中的甲醇浓度越高,此种培