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Hybritech游离PSA

分析步骤

用ACCESS免疫分析系统

对人血清中游离PSA的定量检测

内容表

原理2

标本采集2

试剂和必须品3

定标6

质控7

步骤7

检测结果7

开始检测12

检测注意事项12

参考文献13

BeckmanCoulter,Inc._Fullerton,CA92834

原理

检测原理

AccessHybritech游离PSA检测是一种双位点的酶免疫检测（双抗夹心），样品和标记了碱性磷酸酶的大鼠抗游离PSA单抗的酶结合物、包被了大鼠抗游离PSA二抗的磁性颗粒被一起加入到反应管中，样品中的游离PSA和固相上的抗体相结合，同时另一抗原位点与酶结合物相结合。

而后，反应管被传送到磁性分离区域进行多次冲洗，去处未和固相结合的其它成分。

最后在反应管中加入化学发光底物（Lumi-Phos*530）,已与固相结合的碱性磷酸酶会使该底物发出光子并被光电比色计所检测。

最后，对照仪器中储存的多点定标曲线中所描述的光量子与标准品的对应关系而计算出样品中的游离PSA浓度，反应产生的光量子与样品中游离PSA的含量成正比。

概述

前列腺癌是美国男性中最常见的肿瘤，大概在10个人中就可出现一例

（1），同时它还是第二个导致美国男性死亡的原因

（1）。

前列腺特异抗原（PSA）最早于1979年由王和他的合作者发现

（2），PSA，一种丝氨酸蛋白酶由前列腺上皮细胞所分泌，良性和恶性细胞均可分泌。

由肿瘤或疾病所导致前列腺结构的异常会导致PSA“漏”到外周血中去。

PSA在血清中以三种形式的原态存在（3），一种形式被确认为被蛋白酶抑制剂α2巨球蛋白所包裹，缺乏免疫性（4），第二种形式是与另一种蛋白酶抑制剂α1抗胰蛋白酶（ACT）相结合（4，5），第三种形式是不与任何蛋白酶抑制剂相结合，被称为游离PSA（4，5），后两种形式可用商用可得的PSA检测试剂盒通过免疫方法检测，合称总PSA。

现有的研究报道显示测定PSA形式可用于鉴别前列腺癌和其它良性前列腺疾病（6，7），PSA浓度升高的病人中，前列腺癌患者的游离前列腺特异性抗原比例（freePSA/totalPSA）将低于良性前列腺疾病患者（8~12）。

癌和良性疾病在游离前列腺特异性抗原比例分布上的区别可用于选者决定活检的临床判值，在减少20%~30%的良性疾病患者的活检同时可保持90%到95%的灵敏度。

游离前列腺特异性抗原比例也可用于个体病人罹患癌症的危险估计，低的游离前列腺特异性抗原比例患者有更大风险患癌症（8-12）。

标本采集

A.病人标本不需要特殊准备，PSA标本应在做直肠指检（DRE）、经直肠超声检查（TRUS）和前列腺活检之前采集，DRE可能引起血清中PSA和游离PSA的一过性增高（13），推荐重复检测PSA以确定基值的升高与否（14）。

B.经直肠的前列腺细针穿刺以表明可引起PSA浓度的持续升高（13，14），因此推荐细针活检后间隔6周再检查PSA浓度。

C.AccessHybritech游离PSA检测推荐的样品为血清，血浆标本不可使用。

D.标本采集中应不含任何抗凝剂，通过适当的医疗技术采血，避免溶血。

E.标本采集后应使血液充分凝集，离心以获得血清。

在抽完血3小时内要对标本进行离心和冻存（15）。

F.如果血清样品在采集后24小时内检测，标本应在2~8°C冰箱中保存，标本要长时间保存（最多5个月）时应置于-20°C或更底温度中保存（15，16）。

标本要保存时间长于5个月应置于-70°C冰箱保存（15~17）。

反复冻溶不会影响游离PSA，总PSA浓度以及游离PSA比值（15），但是，荐议及时冻存复融的标本。

G.浑浊的血清标本或标本中有颗粒要在检测前离心去除。

试剂和必须品

BeckmanCoulter,Inc.

4300S.HarborBlvd.

Fullerton,CA92834

A.R1:

AccessHybritech游离PSA试剂盒

货号37210：

100个测试，2盒装，50测试/盒

•现成可用

•在2到10°C冰箱中顶端朝上存放

•试剂盒必须在2到10°C冰箱保存2小时后才能放入仪器中使用

•在2~10°C冰箱中可一直保存到标签中注明的失效期

•试剂盒被吸取使用后，在2到10°C条件下可稳定28天

•一旦发现有试剂盒多层覆膜破损或质控结果超出范围等现象出现即代表试剂盒失效

1.R1a:

含包被有burro抗羊、羊抗生物素和生物素标记的大鼠抗PSA单抗抗体的磁性颗粒的TRIS缓冲液，含离子表面活性剂、小牛血清白蛋白（BSA）、<0.1%的叠氮钠和0.1%ProClin**300。

2.R1b:

含标记有碱性磷酸酶的大鼠抗游离PSA抗体的磷酸盐缓冲液，含离子表面活性剂、小牛血清白蛋白（BSA）、<0.1%的叠氮钠和0.25%ProClin**300。

B.AccessHybritech游离PSA定标品

货号37215：

S0:

5.0mL/瓶，S1-S5:

2.5mL/瓶

定量检测的定标是用已知分析浓度的标本，象病人标本一样进行检测以观察光量子值。

光量子值和已知浓度之间的数学关系就构成了定标曲线。

定标曲线可将样本检测中得到的光量子值转化成特定的分析浓度。

•现成可用

•保存在2~10℃冰箱

•轻轻的颠倒混匀，避免产生气泡。

•2~10℃环境可稳定到定标品瓶标签上标出的失效期。

•质控结果落到允许的范围之外是定标品失效的信号。

详情请参见《操作指南》和《参考手册》中有关定标原理、设置定标、定标要求的输入和回顾定标数据等

内容。

1.S0:

BSA缓冲液，<0.1%的叠氮钠和0.25%ProClin**300。

2.S1,S2,S3,S4,S5：

BSA缓冲液中含人游离PSA的浓度大概为0.5,2.0,5.0,10,及20ng/mL<0.1%的叠氮钠和0.25%ProClin**300。

准确浓度详见定标卡。

3.定标卡：

1张

C.Access底物

货号为81906:

4瓶x130ml/瓶。

现成可用，下表注明了储存条件和稳定性，底物本底检测值的增高提示底物的不稳定。

前提

储存

稳定性

未开瓶

2到8°C

可一直保存到标签注明的失效期

使用前的平衡（未开瓶）

15到30°C（室温条件）

至少18小时

最长14天

使用中（已开瓶）

内部底物支持位置

最长5天

使用中（已开瓶）

外部液体架的底物位置

最长14天

R2底物：

Lumi-Phos530（缓冲液中包含有dioxetaneLumigen*PPD,荧光素和离子表面活性剂量）。

按照Access仪器操作指南中介绍的使用方法使用。

D.Access冲洗缓冲液

货号：

819074x1950ml/箱

现成可用。

在室温条件下（15到30°C）可稳定到包装上注明的失效期。

底物本底检测值的增高或在“双抗”体夹心法中的0点定标品的相关发光值的增高则提示冲洗缓冲液的不稳定。

R3冲洗缓冲液：

Tris盐缓冲液，离子表面活性剂，<0.1%的叠氮钠和0.1%ProClin300。

按照Access仪器《操作指南》中介绍的使用方法使用。

E.质控材料：

AccessHybritech游离PSA质控（货号37219）

AccessHybritech游离PSA质控

货号37219：

QC1-QC2:

5mL/瓶

质控品与样品的性质类似，是监测AccessHybritech游离PSA免疫化学分析正常工作的必须品。

另外，这也是确保实验室结果准确的不可缺少的一部分（18~23）。

当用Access试剂进行游离PSA检测时，包括质控品在内的检测是确保分析有效的方法，在系统处于良好状态时，质控结果应落在可接受范围。

∙现成可用

∙在2到10°C冰箱中顶端朝上存放

∙使用前轻轻的颠倒混匀，避免产生气泡。

∙2~10℃环境可稳定到定标品瓶标签上标出的失效期。

∙质控结果落到允许的范围之外是失效的信号。

使用Access免疫检测系统象检测病人样品一样对Access游离PSA质控品进行定值检测，按照Access免疫分析系统提供的操作指南和参考手册上的信息设定质控品资料、检测质控品以及回顾质控数值。

将质控品和病人样品一样检测。

1.QC1:

BSA缓冲液中人游离PSA的浓度大概为1.0ng/mL，<0.1%的叠氮钠和0.25%ProClin300。

2.QC2:

BSA缓冲液中人游离PSA的浓度大概为13.0ng/mL，<0.1%的叠氮钠和0.25%ProClin300。

参见数据卡片上的平均值和标准差。

3.质控数据卡：

1张。

参考范围

对于设定了值的AccessHybritech游离PSA质控品，大量的标本，包括所有的批号已被检测以提供一个可信的估计均值，均值和标准差已在质控卡上列出。

但技术、仪器、试剂等的不同可能导致结果与列出的不同，因此每个实验室都应建立各自的均值和标准差（SD）。

F.Access免疫分析系统和消耗品

G.警告和注意点

1.只可用于体外诊断。

警告：

AccessHybritech游离PSA只可与Hybritech（总）PSA一起来计算游离PSA比例，与其它厂家的PSA测定一起计算游离PSA比例会导致不当选则随访游离PSA测定的病人人群、游离PSA百分比数值的明显差别、临界判值和罹患癌症的可能性会高于内页中所提供的正常参考范围。

内页中正常参考范围中的游离PSA比例只适用于与Hybritech（总）PSA一起来计算游离PSA比例。

样品中PSA的浓度可因为不同厂家、不同检测原理、不同的试剂盒检测而不同，因此实验室向医师报告结果时应注明所使用游离和总PSA试剂的厂家。

不同的检测方法得到的结果是不可通用的。

2.注意：

只可在美国市场使用，联邦法律限制该设备销售和分配，只供医师或实验室在临床医师的要求下使用。

3.病人样品和血制品应按照阐述的最底危险性的常规操作进行操作，将这些物品当作潜在的传染物品，按照常规操作注意点和优秀实验室的操作常规进行处理，无论该些物质是原型、处理物或得到保证前。

用合适的消毒剂进去污。

按照各实验室规定和操作规程存放和处理该些物品及其容器（24）。

4.试剂中所含的叠氮钠可以和铅和铜反应形成有高度腐蚀性的重氮金属盐，如果被溅到含该物质的液体，则可用大量水冲洗来防止重氮的堆积（25）。

6.Xi.刺激物：

0.25%ProClin300.

R43:

皮肤接触后会引起致敏。

.

S28-37:

皮肤接触后立即用大量的肥皂和水冲洗，可戴合适的手套来避免。

7.底物暴露在空气中容易衰变，应保持瓶口紧盖，不要将不同瓶的底物相混后使用。

8.用来制备定标品的血清已作检测，未发现已肝病毒抗原（HBsAg）、丙肝抗体（HCV-Ab）和人免疫缺陷病毒抗体（HIV1-Ab和HIV2-Ab）存在。

因为没有一个测试方法的阴性能完全保证没有感染物质，因此处理试剂和样品时应视为在传递感染性疾病样品一样（24）。

9.用来制备质控品的血清已作检测，未发现已肝病毒抗原（HBsAg）、丙肝抗体（HCV-Ab）和人免疫缺陷病毒抗体（HIV1-Ab和HIV2-Ab）存在。

因为没有一个测试方法的阴性能完全保证没有感染物质，因此处理试剂和样品时应视为在传递感染性疾病样品一样（24）。

定标

对所有的测试来讲，有效的定标曲线是必须的。

对于AccessHybritech游离PSA分析而言，定标曲线至少每28天进行一次。

参见《操作指南》和《参考手册》来完成定标设置和定标步骤。

《操作指南》描述了暂时的重定标需要和系统选择定标的需要。

TheAccessHybritech游离PSA提供6个浓度的定标品，0和大概0.5,2.0,5.0,10及20ng/mL，定标曲线28天有效。

AccessHybritech游离PSA检测已作标准化处理，提供与HybritechTandemR游离PSA病人的相关性数据。

质控

质控品与样品的性质类似，是监测免疫化学分析正常工作的必须品。

因为样品可在有随机检测能力的仪器中随机检测而非批量检测，所以质控品应该包含在整个24小时的时间段内（18）。

质控品包括AccessHybritech游离PSA三浓度质控品（货号：

37219）或至少包括两个浓度值的其它可购得的商用质控品，按照厂家规定进行复溶和保存。

在正式使用前每个实验室均应建立各自得平均值和可接受范围，质控结果没有落在可接受范围提示检验结果无效。

重新检查位于上一次有效质控值到这次无效质控值之间所有得检测结果。

参见操作向导来了解如何回顾质控结果。

步骤

A.Access分析仪

参见Access免疫分析系统的《操作指南》来准备和操作。

B.检测步骤

1.从主菜单进入测试要求屏幕。

2.对每个样品，设置一个样品架上的位置，输入样品信息和需检测的测试名称。

3.将样品管（杯）放入样品架中已设定的位置。

4.按下运行键（Run）开始检测。

5.仪器会提醒操作者运行所需的定标。

6.系统会自动计算检测结果。

结果

1.系统软件会按照平滑的三次方参数曲线计算模式（smoothingcubicsplinemathmodel）自动计算病人结果。

样品中检测到的光量子值会与储存的标准曲线对应求得相应结果，病人检测结果可通过“样品结果菜单”（SampleResultsscreen）回顾，如何回顾结果请参见操作规程。

游离PSA比值的计算

游离PSA数据单个使用没有价值，因此不可单独使用。

只有同一血清标本所测得的总PSA和游离PSA才可用于计算比值，这样计算出来的比值才可用于病人诊治。

游离PSA（ng/mL）x100%=游离PSA百分比

总PSA（ng/mL）

B.正常参考范围

运行了一个多中心评估临床计划来测试在与Hybritech（总）PSA检测同时使用时，游离PSA百分比帮助区分良性前列腺疾病和前列腺癌的有效性（12），虽然在这个评估计划中使用的是HybritechTandem®游离PSA的检测方法，但在AccessHybritech游离PSA测定中运用了与之相同的单克隆抗体并使之标准化以提供相同的临床检测特性。

所有被研究个体年龄界于50~70岁，血清总PSA浓度在4~10ng/mL，并且经直肠肛检（DRE）不支持前列腺癌。

这些男性显示在“灰色诊断区域”，该区域的总PSA被证明会有较高的风险罹患前列腺癌（25%的前列腺癌可能，而PSA<4ng/mL的普通年龄大于50岁的男性的前列腺癌仅为4%的可能），但其特异性却不能被证实。

在测定游离前列腺特异性抗原前，所有男性接受了B超引导下的前列腺6点细针穿刺，进行病理学的确诊，该研究是双盲点测定，病理测定人员不知道，游离PSA百分比，而实验室测定人员也不知道病理确诊结果。

须排除急性前列腺炎、尿道感染、经直肠前列腺检查（TURP）或近期前列腺处理和治疗等情况，因为它们会改变血清中PSA浓度。

总共有773个男性参加了这次研究，前列腺癌和良性疾病个体的中位年龄为64岁。

研究人群中86%为高加索人种，9%为非洲-美洲人种，3%为西班牙人种，2%为亚洲人种。

下表（表一）说明了该研究人群男性中游离PSA（ng/mL）、总PSA（ng/mL）和游离PSA百分比（游离PSA/总PSAx100%）的正常参考范围。

表1

Hybritech游离PSA（ng/mL）,总lPSA（ng/mL）和游离PSA百分比（%）:

诊断正常参考范围

良性疾病

前列腺癌

T总计

N=394

N=379

N=773

游离PSA

中位数

均值±SD

范围

1.0

1.1±0.6

0.2–4.9

0.7

0.8±0.5

0.2–3.6

0.9

1.0±0.6

0.2–4.9

总PSA

中位数

5.6

5.9

5.8

均值±SD

6.0±1.6

6.2±1.7

6.1±1.6

范围

4.0–10.0

4.0–10.0

4.0–10.0

游离PSA百分比

中位数

均值±SD

范围

17.9

19.0±7.8

4.3–52.2

12.2

13.4±6.8

2.3–42.1

15.3

16.3±7.9

2.3–52.2

在前列腺癌诊断程序中，DRE和PSA检测将区分出DRE阴性、PSA处于4~10ng/mL的那部分病人，然后应用游离PSA和游离PSA百分比来帮助病人的处理。

多中心的研究计划结果说明游离PSA百分比可用于以下两方面：

（1）病人个体风险评估来帮助处理决定，或

（2）提供单一的临床判值（所得结果小于等于临床判值将建议增加诸如活检等后续随访步骤）。

病人个体风险的评估

游离PSA百分比可用于决定男性个体罹患前列腺癌的相关风险，患者的家庭和病史因素可与游离PSA百分比一起使用来确定个体的最佳处理决定。

表2显示了在总PSA和游离PSA百分比测定基础上用细针活检检测前列腺癌的可能性，PSA数值取自前述的多中心研究评估有效性的前列腺癌患者的PSA数据（26，27），游离PSA百分比取自现在的研究。

显而易见的是，PSA浓度越高则检测出前列腺癌的风险就越高，而游离PSA百分比可将PSA数值界于4~10ng/ml并且DRE检测不支持前列腺癌的男性进行危险分层。

游离PSA百分比越低则风险越大，该人群的癌症风险为8%~56%，相比较而言，PSA<4ng/mL的年龄大于50岁的男性罹患前列腺癌风险仅为4%（26）。

表2

总PSA和游离PSA百分比测定基础上前列腺癌的可能性

（男性DRE检测为阴性，忽视病人年龄）

PSA

前列腺癌的可能性

游离PSA百分比

前列腺癌的可能性

0–2ng/mL

1%

0–10%

56%

2–4ng/mL

15%

10–15%

28%

4–10ng/mL

25%

15–20%

20%

>10ng/mL

>50%

20–25%

16%

>25%

8%

游离PSA百分比不可用作有无前列腺癌的确切证据，前列腺活检是诊断前列腺癌所必须的。

临床研究结果还显示老年人较年轻人有更大的风险，游离PSA百分比测定和年龄基础上的前列腺癌的可能性如表3、图1所示：

表3

前列腺癌可能性

（男性DRE检测为阴性，PSA结果界于4~10ng/mL之间，考虑病人年龄）

游离PSA百分比

病人年龄

50~64岁

65~75岁

0.00to10.00%

56%

55%

10.01to15.00%

24%

35%

15.01to20.00%

17%

23%

20.01to25.00%

10%

20%

≥25.01%

5%

9%

Figure1

单一临床判值

较之以应用于风险评估，临床判值也可提供用于病人处理时使用。

表4显示了不同游离PSA百分比临床判值的灵敏度（前列腺癌的检测率）和特异性（没有罹患前列腺癌男性避免活检的比率），根据临床研究的数据选择了一个临床判值为≤25%。

当男性的游离PSA百分比数值≤25%则需进行活检，其中95%的前列腺癌患者可以被检测出来，PSA界于4~10ng/ml的男性中绝大多数是良性疾病。

在这个临床研究中，20%参加活检的罹患良性疾病的男性其游离PSA百分比大于25%的临床判值，本应该可以排除在活检之外。

游离PSA百分比≤25%的结果来源于这个临床计划，当医生根据其它的诸如病人病史或家庭因素等认为有必要时，也建议游离PSA百分比大于25%的患者同样接受进一步的检查。

表4

不同游离PSA百分比临床判值的灵敏度和特异性

推荐的游离PSA百分比临床判值：

25%

（小于等于该数值的男性要接受活检）

游离PSA百分比临床判值

灵敏度

（#检测出的癌症患者/

#所有的癌症患者）

特异性

#检测出的非癌症患者/

#所有的非癌症患者）

%（n/N）95%CI*

%（n/N）95%CI*

25%

95%（358/379）92-97%

20%（80/394）16-24%

32%

98%（373/379）96-99%

6%（25/394）4-9%

55%

100%（379/379）

0%（0/394）

*95%CI=95%可信区间

表5显示了游离PSA百分比大于25%的临床判值（这些癌症患者提示如果单单根据游离PSA百分比大于25%就不进行活检的话就会发生漏检）的男性前列腺癌患者是伴有巨大前列腺的老年男性的初发病人，老年男性（小于10年的预期寿命）通常不会受不对前列腺癌治疗的影响，因此，使用游离PSA百分比对年轻男性建议活检，通常会得到早期诊断。

前列腺体积测定对临床是有帮助的，游离PSA百分比接近或高于临床判值的男性趋向于有较大的前列腺（良性前列腺增生），而前列腺癌患者有较低的游离PSA百分比，并显示进展性的远离临床判值的趋势。

因此，当决定对超过临床判值的个体不做活检时，这是一个癌症低风险而良性疾病高可能性的一个组合。

（见表2和前一节的讨论“单一病人危险性评估”）

表5

高于和低于临床判值的前列腺癌个体的特点：

病人年龄和前列腺体积

游离PSA百分比临床判值病人年龄中位数前列腺体积中位数

>25%freePSA68years48cc

≤25%freePSA63years34cc

关于操作的说明

1.关于安装介绍、开机、操作原理、系统主要特点、操作指导、定标步骤、操作限制和注意事项、危险事项、保养和故障的排除等请参见《操作指南》和《参考手册》。

2.在装入仪器前，将试剂轻轻的颠倒混匀几次，不要颠倒已用试剂，通过轻轻旋转的方式混匀试剂。

3.每次测试使用25μI的样品，但要考虑到样品杯和样品管的死体积，各种容器的死体积大小请参见操作手册中的的样品容器章节。

4.样品结果报告结果的单位是ng/mL。

操作注意事项

1.样品可在可报告范围内即0.005~20ng/ml被准确的定量，如果病人血清中的浓度超过可报告范围上限时，报结果为>20ng/ml。

或者用AccessHybritech游离PSAS0标准品按1：

4或1：

9的稀释倍数对这些标本进行稀释，将检测后的结果分别乘以5或10即可得到这些病人的实际数值，参见操作指南来了解如何在开始检测界面输入稀释参数。

如果样品浓度低于检测线性的低值，报告结果为<0.005ng/ml。

2.人抗大鼠抗体（HAMA）可能会出现在已接受大鼠源性单抗免疫药物治疗的病人体内（28）。

另外，能和大鼠或其它免疫球蛋白结合的异嗜性抗体可能会出现在病人样品中（29