天然产物提取液中蛋白质和脂肪等杂质的去除试验毕业论文.docx
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天然产物提取液中蛋白质和脂肪等杂质的去除试验毕业论文
天然产物提取液中蛋白质和脂肪等
杂质的去除试验
RemoveTestofProteinandFatandotherImpuritiesfromnaturalproductextraction
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目录
摘要I
AbstractII
引言1
第一章绪论2
1.1天然产物的介绍2
1.2我国天然产物的研究和应用现状2
1.2.1天然产物的研究方法2
1.2.2天然产物的提取方法2
1.2.3我国天然产物的应用现状5
1.2.4天然产物的发展前景5
1.2.5我国天然产物的发展方针6
1.3天然产物提取液的精制方法7
1.3.1蛋白质分离纯化方法8
1.3.2冷冻脱脂的原理及影响因素11
1.4高速离心分离技术12
1.4.1离心分离简介12
1.4.2离心分离的基本原理12
1.4.3常用离心方法13
第二章实验部分14
2.1实验材料14
2.2仪器和试剂14
2.2.1实验仪器14
2.2.2主要试剂14
2.3分析方法14
2.4实验方法14
2.4.1粗提取液纯化14
2.5提取液的高效液相色谱分析15
第三章结果与讨论16
3.1温度控制条件的确定16
3.2除杂前提取液吸收光谱的测定19
3.3提取液处理前后的紫外光谱分析22
3.4提取液的高效液相色谱谱图分析24
3.5除杂前后对有机玻璃的上色效果27
结论29
致谢30
参考文献31
天然产物提取液中蛋白质和脂肪等杂质的去除试验
摘要：
利用蛋白质分子的热变性和低温脱脂原理对迎春花和连翘花提取液进行处理，根据提取液处理前后的紫外吸收光谱和高效液相色谱的不同以及对有机玻璃上色效果的对比；考察了除杂效果。
实验结果表明对天然产物提取液进行冷冻、加热、离心处理能够有效除去提取液中的蛋白质和脂肪等大分子杂质。
除杂的条件是，3℃6小时，45℃60分钟，2000转/分离心15分钟。
关键词：
天然产物；加热；冷冻；除杂
RemoveTestofProteinandFatandotherImpurities
fromnaturalproductextraction
Abstract：
Theextractionofjasmineandforsythiaflowerwastreatedbyusingproteinmoleculethermaldenaturationandtheprincipleoflowtemperaturedefatted,theeffectofremovingimpuritieswasstudiedbythedifferenceoftheUVabsorptionspectroscopybetweentheuntreatedextractionandtreatedextractionandbythedifferenceofHighPerformanceLiquidChromatography（HPLC）betweentheuntreatedextractionandtreatedextraction,andalsobytheeffectcontrastofdyeingtheorganicglass.Theexperimentalresultsshowthattheproteinandfatandothermacromoleculeimpuritiesinnaturalproductextractioncanbeeffectivelyremovedbybeingfrozen,heatedandcentrifugallyseparated.Theconditionsofremovingimpurityare3℃forsixhours,45℃foronehour,2000r/minforfifteenminutes.
Keyword：
Naturalproducts;Heating;Freezing;Impurity
引言
天然产物广泛存在于多种生物特别是动植物体中，其安全性和营养价值高，有的兼有一定的药理作用。
开发天然产物是世界食用色素业和医药等行业的发展趋势之一，以天然产物为主的保健品和药物等具有相当大的市场前景，但由于天然产物分离纯化困难，很难达到和国际接轨的要求，因此解决天然产物研究中样品分离纯化的难题，得到除杂后的精制产品会使天然产物的开发利用具有更加广阔的前景，同时开发高效的天然产物的除杂方法对彻底改变中国天然产物开发层次低，生产方式粗放，技术落后有重要作用，对中国天然产物利用现状的转型与提升具有重要意义。
本实验在查阅大量文献的基础上进行，得出除杂效果好、操作简便、经济、能耗低，适应实验室大多数相似天然产物的除杂需要的操作方法，为天然产物研究工作者提供参考。
第一章
绪论
一.1天然产物的介绍
天然产物是指动物、植物、昆虫、海洋生物和微生物体内的组成成分或其代谢产物以及人和动物体内许多内源性的化学成分。
其中主要包括蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、各种酶类、单糖、寡糖、多糖、糖蛋白、树脂、胶体物、木质素、维生素、脂肪、油脂、蜡、生物碱、挥发油、黄酮、糖苷类、萜类、苯丙素类、有机酸、酚类、醌类、内酯、甾体化合物、鞣酸类、抗生素类等天然存在的化学成分，其中许多有效成分是预防和治疗疾病、调节身体的物质基础。
并且天然产物由于其安全性高，已成为医药、食品和饲料等的重要来源[1-2]。
一.2我国天然产物的研究和应用现状
一.2.1天然产物的研究方法
天然产物的获得和生产主要有三条途径：
一是直接提取；二是人工合成；三是利用生物技术生产。
目前绝大多数品种的天然产物是采用直接提取方法生产的。
由于生物合成代谢的复杂性，许多天然物质很难在人工控制下化学合成，人工合成的方法只能生产极个别的具有天然产物化学组成和分子结构的物质。
近年来随着生物技术的发展，利用生物技术生产天然产物已为人们开阔了广泛的领域，如利用微生物发酵方法生产蓝色素、红曲色素等多种天然色素已成为现实[3-4]，利用微生物具有特定的优势，如不受资源、环境和空间的限制，以及生长迅速等，可快速大量的生产天然产物。
对天然产物性质的研究，首先应考虑毒理学的评价或安全性，其次是天然产物的理化性，主要包括：
pH值、光照、温度以及食品中金属离子、碳水化合物和添加剂的影响，天然产物的抑菌活性、光谱性质和抗氧化还原能力等[5]，同时随着近代科学技术的发展，人们要从分子水平上去认识天然产物，包括它的结构和分子方面的性质，这样就能更好的了解天然产物的性质和应用范围。
通过对天然产物分子性质的研究，人们就可以更好地指导其在工业生产中的应用，为天然产物工业的发展提供理论基础。
一.2.2天然产物的提取方法
发展至今，天然产物的提取方法常见的有有机溶剂提取法、碱液提取法、超临界提取法、微波萃取法等几种方法。
（1）有机溶剂提取法
溶剂提取法是目前从动植物中提取色素的一种常用的方法。
提取高梁红色素是用0.1%的盐酸水溶液浸泡2h，除去杂质和杂色后，再用7%的乙醇水溶液在40℃下浸提，然后过滤、浓缩、干燥而得[6]。
利用有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等提取姜黄得姜黄色素[7]，将虾壳用盐酸浸泡24h后过滤，滤渣用95%乙醇浸泡提取液经蒸馏后得到浓缩的粗制虾青素提取物。
相对而言，有机溶剂提取法萃取剂便宜，设备简单，操作简单易行，提取率较高，但用其提取的某些产品质量较差，纯度较低，有异味或溶剂残留，影响产品的应用范围。
（2）碱提取法
碱提法主要是应用碱对多种生物物质的影响作用，其提取效率虽不如有机溶剂提取率高，但从经济角度和安全性考虑仍有应用价值。
虾壳中的虾青素大多与蛋白质结合，应用碱液脱蛋白的原理，当用热碱液煮虾壳时，蛋白质溶出，虾青素也随着溶出，从而达到提取虾青素的目的。
辣椒红色素的碱提取是以15%-40%的
水溶液处理辣椒油树脂，使辣椒红色素中的脂肪成分发生皂化反应，从而将辣椒红色素游离释放出来，再分离精制可得到产品。
由于碱提法加工过程需消耗大量酸碱，且废液较难回收，因此近几年来对碱提法的研究报道较少。
（3）超临界
流体萃取法
超临界二氧化碳流体萃取是近二十年发展起来的一种新型物质分离、精制技术。
它兼备有气体低粘度、高扩散和流体的高密度、大溶解度两方面的特点[8]。
由于超临界
提取工艺简单，能耗低，萃取剂便宜，提取的产品具有纯度高，溶剂残留少，无毒副作用等优点，越来越受到人们的重视。
Tsunc等的专利报道中，应用超临界
从虾壳中提取虾青素，浓度可达到8.331%[9]。
宿树兰等采用正交试验优化超临界流体萃取姜黄药材中姜黄素，得到姜黄素占萃取物量高达8.91%。
（4）微波萃取法
微波萃取是在密闭容器中用微波加热样品及有机溶剂，将待测物质组分从样品基体中提取出来的一种方法，是由密闭容器中酸硝解样品和液固萃取有机物两种技术相结合演变出来的，其能在短时间内完成多种样品组分的萃取，溶剂用量少，结果重现性好[10]。
微波萃取克服了超临界萃取和溶剂萃取方法的上述缺陷，既降低了操作费用，又符合环境保护的要求，表现出良好的发展前景和巨大的应用潜力。
（5）分子蒸馏技术
分子蒸馏是一种特殊的液-液分离技术，其基本原理是基于不同物质分子在高真空下分子运动平均自由程的差别，在远低于物质常压沸点温度的条件下将其分离出来。
该技术具有蒸馏温度低，蒸馏压力低，分离程度高，受热时间短等特点，因而能大大降低高沸点物料的分离成本，极好地保护热敏性物料的品质，真正保持了纯天然的特性。
钟耕等采用分子蒸馏法，以冷榨甜橙油为原料，提取其中的类胡萝卜素。
结果表明，采用分子蒸馏法，从脱蜡的甜橙油中一步提取的色素，不含有机溶剂，纯度高，色价高。
（6）双水相萃取技术（ATPE）
双水相萃取技术是二十世纪60年代以来研究开发的新型固-液分离技术。
其基本原理是利用被提取物质在不同的两相系统间分配行为的差异进行分离。
与传统的萃取方法相比，ATPE技术所形成的两相大部分为水，两相界面张力很小，为有效成分的溶解和萃取提供了适宜的环境，相际间的质量传递快，操作方便，时间短，条件温和，易于工程放大和连续操作。
（7）高效液相色谱（HPLC）技术
HPLC是一种以液体为流动相的现代柱色谱分离分析技术。
该技术具有分离效率高，分析速度快，用样量少，灵敏度高，流出组分可收集，兼具分析和制备等优点，适应于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析。
对于热不稳定性或极性大的天然产物来说，HPLC是一种有效的分离分析方法。
赵明波等建立了菊科植物红花中的主要有效成分羟基红花黄色素A的HPLC定量分析方法。
（8）酶法提取法
纤维素酶可使纤维素、半纤维素等物质降解，引起细胞壁和细胞间质结构发生局部疏松、膨胀等变化，从而增大胞内有效成分向提取介质的扩散，促进天然产物提取效率的提高。
应用纤维素酶提取红花中的红花黄色素，与传统水浸提取工艺相比，提取率提高了9.40%-13.35%，具有提取条件温和，有效成分理化性质稳定等优点。
应用酶促反应还可改变天然栀子黄色素中的栀子苷的结构，生产出栀子红、蓝色素。
（9）膜分离法
膜分离法是用天然或人工合成的高分子膜，以外界能量或化学位差为推动力对混合物进行分离、分级、提纯和浓缩的方法。
在色素分离中，利用色素与杂质分子大小的差异，采用纤维超滤膜和反渗透膜，可阻留各种不溶性大分子如多糖、蛋白质等。
该法工艺简单，效能高[11]。
一.2.3我国天然产物的应用现状
我国疆域辽阔，有着天然产物生产所需的丰富植物资源，在发展天然产物方面具有一定的优势。
所以在开发利用天然产物时，既要充分利用我国丰富自然资源，但也要注意综合利用、环境的保护以及资源的可持续发展。
目前已经开发出80余种不同原料来源的食用天然色素。
云南的西双版纳、武陵山区、秦巴山及东北的长白山为天然色素植物资源较为集中的地区，玉米、红花、辣椒等品种为我国发展天然色素工业提供了充足的原料。
我国还有一支庞大的天然色素研究开发队伍。
我国食用色素的生产使用管理是改革开放以来食品工业快速发展而迅速发展壮大起来的。
经过20多年的努力，我国的食用色素产业已初具规模，成为食品工业中的一个重要行业。
目前，我国已推出品种繁多的天然食用色素，诸如，姜黄色素、叶绿素铜钠盐、红药子黄色素、玉米黄色素、红曲色素粉、高粱红色素、枣红色素、桅子黄色素、辣椒红色素、红花黄色素等，均受到广大食品厂家的青睐。
据1998年下半年统计，我国食用色素的年产量约2.5万吨。
其中：
焦糖每年产量约1.82万吨；红曲米及红曲米粉每年约产4000多吨；红曲红每年约产200多吨；辣椒油树脂及辣椒红每年约产250多吨；桅子黄色素每年约产10吨；高梁红色素每年约产45吨；可可壳棕每年约产10吨；甜菜红每年约产20吨；虫胶红每年约产20吨。
这些食品天然色素产品除在国内销售外，还远销国外。
焦糖色素是一种天然的食品着色剂和天然食用色素。
在人们崇尚绿色天然食品的今天，用纯化学物质人工合成的食品着色剂和食用色素已不占食用色素市场的主流。
因此，用糖类、淀粉类制作的焦糖色素作为天然食品着色剂和天然食用色素，成为国际上的食品市场首选的食用色素，按比例计量，焦糖色素占所有食品色素量的90%以上，广泛应用于食品工业中的酱油、酱菜、食醋、烧腊、肉类罐头、糖果、烘烤食品、有色饮料、有色酒类等产品[12]。
一.2.4天然产物的发展前景
随着我国食品、医药、轻工业的发展，天然产物的市场需求量将大幅度增加，新产品开发和应用范围的扩大，使得天然产物市场具有广阔的发展前景。
中国天然产物的发展将为我国进人一日三餐的加工食品增加更多的色彩和安全感。
同时由于人们对化学合成色素危害性认知的增加，天然产物具有的天然和健康属性，使天然色素的种类和市场需求量大幅度增加，而且色素品种逐渐由合成色素转变为天然色素，但目前天然色素的开发生产远不能满足现代工业发展的需要，开发新品种的天然色素，探索新的天然色素来源，对原有天然色素的生产工艺进行改进，扩大天然色素的应用范围，降低天然色素的生产成本，已成为添加剂行业和研究者们非常迫切的问题。
同时我国幅员辽阔，位处寒、温、亚热、热带地区，生物资源丰富，种类繁多，而且许多品种产地集中，如云南的西双版纳、武陵山区、秦巴山以及东北的长白山均是天然色素资源较为集中的地区，其他各地都有天然色素生产的原料，均可以因地制宜地开发利用。
特别是一些农产品，如玉米、高粱、辣椒、萝卜等更是随处可见，这就为天然产物的开发利用提供了丰富的原料，也为农副产品的深加工开辟了新的途径。
一.2.5我国天然产物的发展方针
我国天然产物产业是改革开放以来，随着食品工业的蓬勃发展而发展壮大起来的。
随着人民生活水平的提高和食品工业不断发展与壮大，食用色素发展在我国具有广阔的前景，以天然色素为例说明我国对天然产物发展的政策方针。
（1）大力发展“天然、营养、多功能”的食用天然色素
今后在我国化学合成着色剂与天然色素并用的情况下，应当大力发展“天然、营养、多功能”的天然色素，着力开发、研究、生产、使用既可以着色，又有某些生理功能的天然色素例如天然价胡萝卜素，作为食品黄色着色剂，进人人体后在加氧酶作用下能在肝脏或肠粘膜裂解成两个分子的维生素A，而维生素A有使上皮细胞健全、保持正常视觉、提高免疫力等多种生理功能。
红曲米中含有降血脂物质酪伐它汀，作为着色剂用于食品中，可以有效地使人体内血脂达到正常平衡不少以类黄酮为天然色素的物质有抗氧化功能或软化血管功能。
我国天然色素资源丰富，进一步开发、研究、生产、应用功能性天然色素大有潜力。
（2）提高技术与装备水平，促进天然色素的生产
天然色素的生产应当采用高新技术，不断提高装备水平，提高产品的产量和质量，降低成本，从而提高产品在国内外市场的竞争力。
我国产物生产行业虽有少数工厂拥有较好的生产技术、工艺和装备，但大多数企业在技术、工艺方面比较落后，设备陈旧或简陋，必须不断创新提高，才能使产品上档次，行业才有发展。
在天然色素的生产过程中，可以采用的高新技术有：
基因工程、细胞工程、发酵工程、吸附色谱、凝胶过滤、微孔过滤、超滤、电渗析、反渗透、膜分离技术、超临界流体萃取分离技术（
、丙烷）、冷冻干燥等技术。
采用了高新技术，就是提高设备的装备水平，这是提高天然色素的收率，提高产量，保证优质的基础。
（3）实现产品的标准化、系列化、实用化，开拓国内外市场。
近年来，我国天然色素产业的管理水平和规范化方面虽然有长足的进步，但还应当进一步加强。
我国各天然色素生产企业一般规模都偏小，产品单一，在小量、低质量、高损耗中徘徊，经济效益不明显，抗风险能力差。
多数工厂所生产的是原料型的天然色素，一般不能直接使用，因而价格低，经济效益不高。
就某一个天然色素而言，一个企业也没有完全做到标准化、系列化，缺欠实用技术的开发。
欧洲、美国、日本等国天然色素产业的发展早于我国，这些国家在管理水平、规范化、标准化、系列化、实用化等方面日臻完善。
我们应当奋进直追，迎头赶上。
在天然色素的发展方面，应当进一步加强天然色素实用技术的研究、开发，这个课题并不亚于天然色素本身的研究、开发和生产，是我国天然色素打开国内外市场的关键。
（4）进行原料的综合利用
在原料上应当走综合利用，变废为宝的道路。
一个原料多出好几个产品，物尽其用，提高经济效益。
许多天然色素生产的原料是野生植物、农作物副产品或废弃物。
目前许多天然红色素，如红高粱、酸枣色、葡萄皮红等，都是从农产品的废弃物中提取的。
用高粱壳生产高粱红；用葡萄皮渣生产葡萄色素等，原料低廉。
又例如生产辣椒红色素的工厂，用辣椒作为原料。
辣椒的种子可以提取辣椒碱及辣椒油，残渣含高蛋白；辣椒种皮可以提取辣椒红色素、辣椒碱，残渣再配上面酱、油、鲜味剂，可精制辣酱。
一个姜黄原料可以生产出姜黄油、姜黄素、姜黄油树脂、姜黄粉、乳化姜黄色素等多种产品，这对于农产品的深加工以及废弃物的处理，不失为一个好方法。
这种综合利用的开发，可以大大提高经济效益。
（5）立足国内市场、开拓国际市场
我国天然色素产品应当立足于国内巨大的市场，开拓国际市场。
我国是一个占世界人口四分之一的、具有13亿人口的大国，因此，这样多的人口，要进入一日三餐的加工食品时代，需要的食用天然色素是很大的。
一些外国的有识之士也十分重视这个市场。
只要我们能把自己的天然色素做到标准化、系列化、实用化，一定能培养出中国这个大市场，这已经为火腿肠使用红曲红和饼干喷涂辣椒红的中国市场所证明。
当今国际经济一体化要求我们将中国的天然色素打人世界其它国家，特别是西方发达国家，它除了要开拓中国天然色素的国际市场外，还有一个东方饮食文化的交流和交融的重要意义[12]。
一.3天然产物提取液的精制方法
随着科技的发展和生活水平的提高，天然产物以其健康、安全的特点，将越来越受人们的欢迎，但天然产物大多不能直接使用，而只需要其中的某些物质，因此需要对天然产物进行提取分离，提取后所得提取液大多数是混合物，需利用体系中各组分物性的差别，使用不同的方法使混合物得到分离提纯。
一.3.1蛋白质分离纯化方法
（1）根据分子大小不同进行分离纯化
蛋白质是一种大分子物质，并且不同蛋白质的分子大小不同，因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，以致超滤速度减慢，截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜，也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。
离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如，在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和
-淀粉酶进行预处理后，再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[13]。
使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度（区带）离心。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。
可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。
密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白，得到的产品纯度高但产量偏低。
蒋辰等通过比较不同密度梯度介质的分离效果，利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。
凝胶过滤也称凝胶渗透层析，是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外；反之，比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。
目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。
在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果，纯度鉴定证明产品为分子量约为
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