生物技术综合实验指导手册.docx

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生物技术综合实验指导手册

生物技术综合实验

实验指导

适用专业：

生物技术

鲁东大学生命科学学院

目录

第一部分、综合性实验4

综合项目一、α-淀粉酶产生菌的分离与筛选4

实验一、培养基配制及样品采集4

实验二、样品处理及初筛5

实验三、α-淀粉酶产生菌的分离与筛选6

综合项目二、酵母菌的诱变育种8

实验四、培养基配制和菌种活化8

实验五、酵母菌的诱变处理9

实验六、呼吸缺陷型菌株的初筛10

实验七、呼吸缺陷型酵母菌的验证11

综合项目三、谷氨酸发酵及提取工艺12

实验八、谷氨酸菌种的制备12

实验九、谷氨酸的中糖发酵及控制13

实验十、发酵液中谷氨酸的回收及精制15

综合项目四、红曲发酵及红曲色素的提取17

实验十一、红曲液体菌种的制备17

实验十二、红曲固体发酵18

实验十三、红曲色素的提取及色价测定19

综合项目五、糖化酶的发酵和提取………………………………………………….22

实验十四、培养基的配制和菌种活化

实验十五、糖化酶的摇瓶发酵

实验十六、糖化酶的提取、浓缩、活性测定

第二部分：

设计性实验25

设计性实验要求25

设计项目一、摇瓶发酵法生产柠檬酸26

设计项目二、固体发酵法生产柠檬酸29

设计项目三、α-淀粉酶生产32

设计项目四、酵母细胞的固定化33

第三部分附录36

附录一、中试发酵设备的使用方法36

附录二、气升式生化反应器的使用38

附录三、发酵液中还原糖的测定方法40

附录四、谷氨酸浓度测定法42

附录五、α-淀粉酶的测定方法43

附录六、糖化型淀粉酶活力的测定45

附录七、柠檬酸的检测……………………………………………………………48

附录八原料中粗淀粉的测定……………………………………………………..49

实验守则

一、实验

1、实验前认真做好课本有关章节的阅读及实验讲义的预习，简单了解实验装置的构造，掌握有关测量仪表的使用方法，确定实验方法和步骤，做好实验原始数据的记录。

2、指导教师在实验前进行提问，如发现没有达到预习要求的同学，有权停止其参加当次实验。

3、操作过程应在装置指定范围内进行调节，注意观察实验现象，正确读取实记录。

4、注意节约水电、药品、物品、爱护仪器设备，实验结束，将设备、仪器整理复原，场地清扫，与实验无关的装置仪器不得挪用。

5、实验室内保持安静，不得高声谈笑、喧闹，违者按破坏课堂纪律处理，实验结束后，所测数据经指导教师许可，方可离开。

二、实验报告

1、实验报告内容包括：

实验原理、流程简图、操作要点、数据图表（附原始记录、计算示例）主要结论，实验结果的分析。

2、实验报告写在报告纸上，三天内交给指导教师。

三、注意事项

1、不碰摸与本实验无关的电源开关、电气设备、仪器。

2、仪器设备转动前，注意其周围是否有阻碍物，若发热或声音不正常，应及时停车检查。

3、注意防止高压容器泄露和蒸汽管道烫伤事故的发生。

第一部分、综合性实验

综合项目一、α-淀粉酶产生菌的分离与筛选

实验一、培养基配制及样品采集

一、实验目的

学习和掌握菌种选育技术中从自然界中采样的技术，掌握α-淀粉酶筛选的特异性培养基配制方法。

二、实验原理

自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。

但总体来讲土壤样品的含菌量最多，土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。

从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。

但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。

因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。

三　实验材料

1.采样器具：

灭菌的牛皮纸袋、小铲刀（或不锈钢勺）、温度计、pH试纸、记号笔等。

2.筛选培养基：

斜面肉汤琼脂+1%可溶性淀粉

四、操作步骤

1.采样：

用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好，或事先灭菌处理的牛皮纸袋、玻璃器皿内。

北方的干燥土壤，可在10～30cm处取样。

给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。

一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。

（注意：

一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。

山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。

从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土，由于阳光照射，蒸发量大，水分少，且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比5～25cm的土层少；25cm以下土层则因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。

因此，采土样最好的土层是5～25cm。

一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到，如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等。

但总的说来酵母菌分布土层最浅，约5～10cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。

）

2．筛选培养基配制：

筛选培养基配方（g/L）：

牛肉膏3，蛋白胨10，氯化钠5，可溶性淀粉10，琼脂粉15，pH7.5。

每500ml三角瓶装200ml培养基，121℃灭菌20min，备用。

LB培养基斜面：

牛肉膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂粉15，pH7.5。

培养基装试管，灭菌后摆斜面，备用。

3．无菌水制备

100ml三角瓶，加入9ml蒸馏水，玻璃珠8颗，透气塞及牛皮纸（或报纸）封口，灭菌后备用。

试管10支，装9ml/支蒸馏水，透气塞及牛皮纸（或报纸）封口，灭菌后备用。

培养皿包封，灭菌后备用。

1ml吸管若干，棉花封口，报纸包扎后灭菌，备用。

涂布棒包扎后灭菌，备用。

五、思考题

1．你认为自然界中哪些地点更容易采集和分离到本试验的目标菌株？

实验二、样品处理及初筛

一、实验目的

学习从自然界中采集的样品中进行菌种分离的技术，掌握稀释涂布平板方法及透明圈法进行产α-淀粉酶产生菌的初筛的技术。

二、实验原理

菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。

菌株分离、筛选（screening）虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。

工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：

一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。

枯草芽孢杆菌在自然界中分布很广，常用来生产α-淀粉酶，在含淀粉质较多的环境中经常能够找到。

由于其体内能够产生芽孢，能抗高热，所以，获得样品时可先加热，将其他非耐热的微生物杀死得以富集。

透明圈法是常见的初筛方法。

在含有淀粉的平板上，由于枯草杆菌能够产生淀粉酶，因此，可将菌落周围的淀粉酶解掉，形成透明圈。

所以，我们可以根据是否产生透明圈，来初筛目的菌。

三、实验材料

1.培养基：

筛选培养基。

2.试剂：

芽孢染色液、碘-碘化钾溶液。

3.其他器具：

超净工作台、显微镜、培养皿、水浴锅；涂布棒、三角瓶、接种环、酒精灯等。

四、操作步骤

1．样品稀释：

称取土样1g，加入到备好的玻璃珠和无菌水的三角瓶内，振摇5min。

根据微生物稀释方法操作，稀释到10－3～10－6。

2．加热处理：

将最后三支土样稀释液，置于100℃沸水浴3～5min，灭活营养细胞，保留芽孢。

3．涂布平板和培养：

筛选培养基倒平板，凝固后，处理好的三个稀释度的样品各取0.1ml涂布平板，30℃倒置培养。

五、思考题

你认为还有哪些方法对样品进行预先处理，有益于本试验目标菌株的获得？

实验三、α-淀粉酶产生菌的分离与筛选

一、实验目的

学习从初筛菌株中进行目标菌株的挑选以及复筛的方法技术，掌握透明圈法、变色圈法进行产α-淀粉酶产生菌的复筛的技术。

二、实验原理

分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。

通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应进行分离，可显著提高菌株分离纯化的效率。

在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。

能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。

该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。

在分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为唯一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液进行鉴别，根据菌落周围是否出现透明圈来分离淀粉酶产生菌。

透明圈与菌落直径的比例，可以反映菌株产酶能力的大小。

三、实验材料

1.碘液制备

原碘液：

称取分析纯结晶碘llg，分析纯碘化钾22g，注意：

碘不好溶解，需要用研钵捣碎，最后达到完全溶解为之，定容至500mL，贮于棕色瓶内。

稀碘液：

取原碘液2mL，加碘化钾20g，加蒸馏水溶解定容至500mL,贮于棕色瓶内。

四、操作步骤

1．单菌落挑取：

对平板上生长的单菌落进行编号，挑单菌落接种试管斜面保存（编号），并分别接种在同样平板培养基上，每个培养皿接不同的菌落4株（编号和标记）。

置30℃培养箱培养。

2．初筛平板定性观察：

初筛平板浇上一层碘液，10分钟后观察，凡有无色透明圈即可看出它有淀粉酶产生。

记录有淀粉酶产生的菌种号。

3．复筛平板的定性观察和定量测定：

培养二天后，浇上一层碘液，10分钟后观察，凡有无色透明圈即可看出它有淀粉酶产生。

测量菌落直径与透明圈直径大小，计算透明圈直径/菌落直径的比值，挑取透明圈与菌落直径比大的菌株，用于做进一步的摇瓶筛选。

五、结果与讨论

提出一个你自己的更加高效、合理的菌株复筛方案。

综合项目二、酵母菌的诱变育种

实验四、培养基配制和菌种活化

一、实验目的

学习制作适合于诱变处理的细胞的制备。

二、实验原理

通过人工方法可以使微生物发生突变，其突变率远远高于自发突变。

再经过筛选和选育，可以简便、快速地筛选出不同类型的突变株，供生产和研究之用。

人工诱变的突变是不定向的，但选择可以是定向的。

用来诱发突变的菌株称为出发菌株。

出发菌株可以是自然界中分离出来的野生菌株，可以是生产中应用的自发突变菌株，也可以是已经诱发过的菌株。

诱变处理时应选择菌体生长的敏感期，如菌体的对数期，孢子或芽孢的萌发前期。

选择孢子、芽孢，因其多为单核状态。

一般制成单孢子或单细胞悬液，目的是能均匀接触诱变剂，并能减少诱变后件状的分离及退化现象。

三、实验材料

1.菌株：

酒精酵母

2.CM培养基：

葡萄糖40gMgSO42g

蛋白胨10g琼脂15g

酵母膏5g水1000ml

KH2PO45g

不加琼脂即为液体CM，分装20ml于250ml三角瓶中。

3.TTC上层培养基

葡萄糖5gTTC（红氮四唑）0.5g

琼脂10g水1000ml

分装，58.84kPa灭菌15min。

4.TTC下层培养基

葡萄糖10gMgSO47H2O0.4g

蛋白胨2g琼脂20g

酵母膏5g水1000ml

KH2PO41gpH5.5～5.7

5.MM甘培养基

酵母膏6.7g甘油20ml

水980mlpH5.5

琼脂粉20g

分装，58.84kPa灭菌10min。

6．培养皿、涂布棒、稀释试管若干，1ml移液管（棉封）若干，牙签若干，包扎后灭菌备用。

7.恒温震荡器、培养箱

四、操作步骤

1.菌种活化：

保存菌种转接CM培养基斜面，30℃培养活化2天。

2.培养基制备及其它材料的准备：

按照要求准备各种实验用培养基，灭菌后备用。

3.其它材料按要求准备：

按照要求准备其它玻璃器皿，灭菌备用。

五、结果与讨论

讨论酵母细胞诱变处理的敏感期可以选择哪个阶段？

试验五、酵母菌的诱变处理

一、实验目的

学习和掌握微生物的诱变处理方法。

二、实验原理

不同诱变剂诱变的作用强弱不同。

微生物诱变剂常用紫外线、硫酸乙二脂、烷化剂等。

诱变剂选择的原则是使用的方便性和有效性，获得高正变株出现率的就是有效诱变剂。

诱变剂多为致癌剂，操作时要注意安全。

诱变剂剂量选择及处理时间一般以杀菌率控制。

目前常采用剂量是杀菌率为30（70）—80%，杀菌率取决于剂量和作用时间及作用距离。

用高剂量诱变剂处理获得的负突变率高，而在低的剂量中正突变率反而较高。

三、实验材料

1.溴化乙锭

2.TTC（红氮四唑）

四、操作步骤

1．将准备好的CM固体培养基溶化后倒平皿，过夜，（检验是否无菌，干燥）。

2．取活化后的酵母菌1环，接入到三角瓶中液体CM培养基中，并加入诱变剂溴化乙锭10μg/ml，120rpm、30℃震荡培养过夜，进行诱变处理。

五、结果与讨论

简述溴化乙锭的诱变作用机理。

试验六、呼吸缺陷型菌株的初筛

一、实验目的

学习和掌握呼吸缺陷型菌株的初筛方法。

二、实验原理

许多突变株在菌落形态上会发生变异，所以通过观察菌落形态特征挑出突变株是进行初筛的有效手段之一。

在酵母中，呼吸缺陷型突变株是经常遇到的。

在平皿培养后，一般为小菌落，这些小菌落丧失呼吸能力。

产生这种变异的原因，主要是细胞质基因发生突变，但有时核基因也会突变。

小菌落突变后，对非发酵型底物如甘油、酒精、醋酸等不能氧化，但CO2放出高于对照株，酒精脱氢酶活力也较对照高出1倍左右，对提高酒精产率有好处。

同样，呼吸缺陷型也是育种工作可利用的一个有效的遗传标记。

三、实验材料

1．TTC下层培养基

2．TTC上层培养基

3．灭菌的培养皿

四、操作步骤

1．将诱变处理过的酵母培养液适当稀释（稀释度初步10-3、10-4、10-5），涂布CM培养基平板，涂布后30℃培养24h。

2．TTC下层培养基倒平板。

3．将CM培养基平板上长出的菌落点种TTC下层平板上，30℃培养3d。

4.培养3天后，将TTC上层培养基溶化并冷却（不烫手）后，小心倾入TTC上层培养基上，使其刚好掩埋菌落。

等凝固后，30℃培养2～3h。

此时，平板菌落颜色会区分成红色、粉红色和白色。

呼吸缺陷型突变株为白色菌落。

五、结果与讨论

讨论呼吸缺陷型突变株为白色菌落为白色，其它菌株红色、粉红色的机理。

试验七、呼吸缺陷型酵母菌的验证

一、实验目的

学习和掌握呼吸缺陷型验证方法。

二、实验原理

呼吸缺陷型酵母突变株对非发酵型底物如甘油、酒精、醋酸等不能氧化，因此不能在以甘油为唯一碳源的培养基上生长，利用这一特性可以进行呼吸缺陷型突变株的验证。

三、实验材料

1.CM培养基

2．MM甘培养基

3．灭菌的培养皿

4．无菌牙签。

四、操作步骤

1．用无菌牙签将在TTC鉴别培养基上生长的白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上。

注意点种时，先点MM甘培养基，后点种CM培养基，并在平皿上做好标记。

30℃培养1d。

2．观察记录MM甘培养基和CM培养基上菌落的生长状况，验证白色的小菌落是否是呼吸缺陷型突变株。

五、结果与讨论

如果白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上培养后都有生长，讨论有哪些原因？

综合项目三、谷氨酸发酵及提取工艺

实验八、谷氨酸菌种的制备

一、实验目的：

了解发酵工业菌种的制备工艺流程和质量控制方法，并为本发酵实验准备菌种。

二、实验原理：

谷氨酸棒杆菌是一种好氧性细菌，在合适的培养基上经摇瓶培养能快速生长，可得到大量健壮的种子。

处于旺盛生长的生长对数期的菌体适合作为种子。

三、实验器材和药品：

试管、三角瓶、抽滤瓶、高压灭菌锅、摇床、培养箱、显微镜等。

四、实验步骤：

1.斜面种子的制备

①将试管洗净，做好棉塞，并7支一组捆扎好，空消：

0.10MPa，30min。

②按配方配制斜面培养基，加热将培养基溶解后分装到已消好的空试管中，装量约为1/5，灭菌后并摆成斜面。

③将做好的斜面37℃空培24h，检查确定无菌后备用。

④将保存的斜面菌种上的菌苔划线接种到新制斜面上，37℃培养24h，制成斜面菌种。

斜面培养基配方：

葡萄糖0.1%蛋白胨1%

牛肉膏1.0%氯化钠0.5%

琼脂2.0%pH值7.0

灭菌条件：

0.1MPa，30min

2.一级种子培养

培养基配方：

葡萄糖：

2.5%尿素：

0.5%

硫酸镁：

0.04%磷酸氢二钾：

0.1%

玉米浆粉：

0.5~0.6%硫酸亚铁：

2mg/L

硫酸锰：

2mg/LpH7.0

在500mL三角瓶中装入50mL培养基，8层纱布封口，0.10MPa表压灭菌30min，冷却后接种，接种量为一支斜面接一瓶。

置旋转摇床上培养12h（转速170~190r/min），培养温度30~32℃。

3.二级种子培养

培养基配方：

葡萄糖：

2.5%尿素：

0.34%

硫酸镁：

0.04%磷酸氢二钾：

0.16%

玉米浆粉：

0.5~0.6%消泡剂：

0.086ml/L

pH7.0

0.08MPa表压，30min灭菌，冷却接种后，摇床7~8h。

二级种子的制备量按发酵罐投料量的10%的量准备。

五、思考题

种子制备过程中应注意哪些事项？

实验九、谷氨酸的中糖发酵及控制

一、实验目的

了解发酵罐的操作程序和注意事项，完成谷氨酸发酵的全过程操作。

二、实验原理

谷氨酸的生物合成包括EMP、HMP、TCA、乙醛酸循环、二氧化碳的固定反应等。

谷氨酸产生菌丧失或仅有微弱的α-酮戊二酸脱氢酶活力，但谷氨酸脱氢酶活性很强，同时NADPH2再氧化能力弱，这样使α-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻，在有NH4+存在时，经过谷氨酸脱氢酶作用和还原氨基化反应生成谷氨酸。

三、实验装置

发酵罐系统（发酵罐，蒸汽发生器，空压机）、恒温培养箱、分光光度计等。

四、实验步骤

1.投料

投料量：

按发酵罐体积的70%配料。

配方：

葡萄糖：

160g/L

尿素5g/L

硫酸镁：

0.5g/L

磷酸氢二钾：

1.5g/L

玉米浆25~35g/L

硫酸亚铁20mg/L

硫酸锰20mg/L

pH7.0

2.实消

注意罐压，控制0.1~0.11MPa，15min，通过蒸汽流量调节。

3.接种

接种量为10%，通过接种管接种。

4.发酵过程控制

（1）温度控制：

谷氨酸发酵前期为菌体生长期，最适温度30~32℃，后期为谷氨酸产生期，产酸期温度控制在34~36℃。

（2）pH控制：

发酵过程中产物的积累会导致pH下降，而流加氮源（氨水、尿素）会导致pH升高。

发酵中当pH降到7.0~7.1时，应及时流加氮源。

菌体生长期（0~12h）控制pH不大于8.2（由尿素流加量、风量和搅拌转速来调节）；产酸期（12h以后）控制pH7.1~7.2。

（3）发酵过程中参数的记录和分析：

pH2小时1次pH计

还原糖3小时1次斐林试剂滴定法

谷氨酸3小时1次附录方法

菌体生长量2小时1次752分光光度计OD620nm

温度2小时1次温度计

风量2小时1次气体流量计

5.放罐

残糖5g/L以下，耗糖速率缓慢时放罐。

四、实验结果与讨论

以时间为横坐标，OD620nm、残糖量、谷氨酸量为纵坐标，绘制发酵过程中参数变化曲线。

实验十、发酵液中谷氨酸的回收及精制

一、实验目的

1.了解用等电点法从发酵液中回收谷氨酸的方法。

2.掌握由谷氨酸制备谷氨酸钠的方法。

3.掌握脱色、浓缩、结晶等单元操作的原理和方法。

二、实验原理

谷氨酸的分离提纯，通常应用它的两性电解质的性质。

通过谷氨酸的溶解度、分子大小、吸附剂的作用以及谷氨酸的成盐作用等，可以把发酵液中的谷氨酸提取分离出来。

三、实验器材

无极速搅拌机、旋转蒸发器、恒温水浴锅、水环式真空泵、pH试纸、盐酸。

四、实验步骤

（一）等电点回收

1.流程

发酵液——离心除菌体（5000rpm,10min）——加盐酸——育晶2h（pH4~5）——加盐酸——育晶2h（pH3.5~3.8）——加盐酸——育晶2h（pH3.0~3.2）——加盐酸——搅拌育晶20h——沉淀4h——母液和细谷氨酸。

2.等电点操作

（1）先测定发酵液的体积、pH、谷氨酸含量和温度。

若放罐的发酵液温度高，应先将发酵液的温度冷却到25~30℃，消除泡沫后再开始调pH，用盐酸调到pH5.0。

（2）当pH达到4.5时，应放慢加酸速度，注意观察晶核形成情况，若有晶核形成，应停止加酸，搅拌，育晶2~4h。

若发酵不正常，产酸低于4%，pH调到3.5~3.8左右。

（3）搅拌2h，以利于晶核的形成，或者适当加一点晶种刺激起晶。

（4）搅拌，育晶2h后，继续加酸，耗时4~6h，调pH至3.0~3.2，搅拌2h后开大冷却水降温，使温度尽可能降低。

（5）到等电点pH（3.2）后，继续搅拌16h以上，停止搅拌静置沉淀4h，关闭冷却水，吸去上层菌液，底部谷氨酸离心甩干。

（二）谷氨酸钠的精制

回收的谷氨酸又称麸酸，并没有鲜味，用碳酸钠中和精制，在pH7.0左右得到谷氨酸一钠，在pH9~10左右得到谷氨酸二钠。

1.流程：

谷氨酸——加水、活性炭、碳酸钠——中和——脱色——过滤——二次脱色——滤液——三次脱色——过滤——浓缩结晶——干燥

2.操作

（1）工艺条件：

湿谷氨酸：

水=1：

2

湿谷氨酸：

碳酸钠=1：

0.3~0.34

湿谷氨酸：

活性炭=1：

0.01

T=60℃，pH6.4（用试纸测）

（2）在不锈钢桶内加入清水及活性炭升温至65℃，开始搅拌（60r/min）。

投入谷氨酸，缓慢、逐步加入碳酸钠中和到pH6.4（试纸），加热至65℃，继续搅拌约30min。

（3）将澄清的脱色液加入旋转蒸发器（加料小于二分之一），真空度在600mmHg以上，温度小于70℃，浓缩至34~34.5波美度，升温至80℃放料，冷却，搅拌2~3h后开冷却水降温，至室温。

（4）分离：

抽滤（工业滤布做介质）

（5）烘干：

鼓风干燥箱（温度小于60℃），即可得到味精原粉。

五、思考题

分析影响谷氨酸结晶的因素？

综合项目四、红曲发酵及红曲色素的提取

实验十一、红曲液体菌种的制备

一、实验目的

了解红曲菌液体菌种的制备方法,为红曲发酵实验准备液体种子。

二、实验原理

红曲霉菌是一种好氧性微生物,除了能进行固体浅盘培养外,还可以用液体摇瓶培养的方法来获得种子。

液体菌种生产具有纯度高、活力强、繁殖快的特点，接种到固体培养料内有流动性好、萌发点多，菌丝生长迅速等特种点。

液体菌种应用于生产与固体菌种相比有以下优点：

菌种生产周期短；接种后，萌发点多；接种方便、成本低；适宜工厂化生产。

液体菌种为固态发酵的集约化、标准化生产创造了更好的条件。

三、实验器材与试剂

1．菌种：

红曲5003

2．玉米面液体培养基（g/L）：

蛋白胨20；玉米面20；酵母浸粉10；硫酸镁0.5；磷酸氢二钾1；硫酸亚铁0.1；pH6.0。

3．恒温摇床,超净工作台,高压蒸汽灭菌锅等。

四、实验步骤

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