医学细胞生物学实验指导.docx
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医学细胞生物学实验指导
普通生物学实验指导
供医学八年制使用
华中科技大学生命与技术学院
实验教学中心
实验一显微镜的结构及使用方法
一、实验目的
1.学习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。
3.了解几种特殊光学显微镜的工作原理及其使用
光学显微镜的使用
（一）显微镜的结构及使用方法
光学显微镜，简称光镜（microscope），是生物医学研究及临床工作中常用的仪器，每个学生都必须熟悉它的结构和性能，掌握其使用方法。
1．光学显微镜的主要构造
显微镜的构造主要分为三部分：
机械部分、照明部分和光学部分（图1-1）。
（1）机械部分
①镜座：
亦称镜脚，是显微镜的基座，用以支持整个显微镜。
②镜柱：
是镜座向上直立的短柱，用以支持其他部分。
③镜臂：
是镜柱向上弯曲的部分，适于手握。
有些显微镜镜柱与镜臂之间有倾斜关节。
④镜筒：
连在镜臂前方的镜筒部分，一般长度为16cm。
有直筒和斜筒两种，前者镜筒上下可调节，后者镜筒是固定的
⑤调节器：
是装在镜臂上的大小两种螺旋，转动时可使镜台升降或使镜筒上下移动以调节焦距。
粗调节器（粗螺旋）转动时可使镜台或镜筒在垂直方向以较快速度和较大距离进行上下升降，调节物镜与标本的距离。
通常在低倍镜下，先用粗调节器找到物像。
细调节器（细螺旋）形状较小，通常在粗调节器的下方或外侧，转动时可使镜台或镜筒缓慢地上下移动，以精细调节焦距，得到清晰的物像。
⑥旋转器（镜头转换器）：
装在镜筒的下端，呈盘状，下面有3～4个物镜孔供装置不同放⑦载物台（镜台）：
用以放玻片样本，中间有一通光圆孔，称为镜台孔，由此孔可透入集光器传入的光线。
⑧标本移动器：
装于载物台上，用于前后左右移动玻片标本。
移动器上有标尺，可以测定标本大小。
（2）照明部分．
①反光镜（mirror）：
是一个一面平一面凹的双面镜，装在镜柱基部的前方，可向任意方向转动，其作用是改变光源射出的光线方向，送至聚光镜中心，再经镜台孔照明标本。
反光镜的凹面聚光作用较强，通常在光线较弱时使用；在光线强而均匀时，宜用平面镜。
有些显微镜采用电光源代替反光镜，使用时接上电源，在打开电源前，光照亮度旋至最小位置，然后打开电源，旋转亮度旋扭调节光照强度至适宜为止。
关闭电源前，应先将光照亮度旋至最小位置。
②聚光器（又名集光器，condenser）：
位于载物台下方的聚光器架上，由聚光镜和虹彩光阑组成。
聚光镜由一片或数片透镜组成，其作用相当于一凸透镜，起会聚光线的作用，一般可通过装在镜柱旁的聚光器调节螺旋的转动而上下移动，上升时视野中光亮度增加，下降时光亮度变弱、虹彩光阑（又名光圈，diaphragm）在聚光镜下方，由十几张活动的金属薄片组成。
其外侧伸出一柄，推动此柄可随意调节开孔的大小，以调节光量。
（3）光学部分
①目镜（ocular）：
位于镜筒上方，常用的有5×，6×，8×，10×，12×，15×，数字越大，放大倍率越高，可根据需要挑选使用。
一般装在镜筒上的是10×目镜。
②物镜（objective）：
装在镜筒下端的旋转器上，一般有3～4个物镜。
其中最短的刻有“4×”或“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜；最长的刻有“100×”符号的为油镜。
在物镜上，还有镜口率（NA）的标志。
镜口率反映该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨力越高。
物镜的工作距离是指显微镜处于工作状态（物像调节清楚）时，物镜的下表面与盖玻片（盖玻片的厚度一般为 0.17mm）上表面之问的距离。
物镜的放大倍数愈大，它的工作距离愈小。
显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如：
物镜为10×，目镜为10×，其放大倍数就为l00。
2．光学显微镜的使用方法
（1）低倍镜的使用方法
①检查：
用右手握镜臂，从镜箱中将显微镜取出，左手托镜座，平稳地放到实验桌上。
使用前应先检查一下显微镜各部分结构是否完整，如发现有缺损或性能不良，要立即报告教师，请求处理。
②准备：
将显微镜放于自己座位面前实验桌上稍偏左侧，镜台向前镜筒向后，旋转粗调节器使镜台远离物镜，旋转物镜转换器，使低倍镜对准镜台孔，这时可听到转换器边上固定扣碰上而发出的声音，或手上感到一种阻力，说明物镜的光轴已正对镜筒的中心。
③对光：
打开光圈，将聚光器上升。
双眼同时张开，以左眼向目镜内观察（如为双筒显微镜，用双眼观察．，下同），调节反光镜的方向，使光线射入镜筒中，直到求得明亮而均匀的视野为止；或打开电源，调节光照亮度旋钮，直到光亮度最适宜为止。
④置片和调整焦距：
将玻片标本置于镜台上，注意使有盖玻片的一面朝上，利用标本移动器将玻片夹住，然后将玻片稍加调节，使标本对准镜台孔。
从侧面注视低倍镜，转动粗调节器，使镜台慢慢上升，至物镜距标本半厘米处为止，再以左眼自目镜中观察，左手转动粗调节器使镜台徐徐下降，直到视野中出现标本的物像为止；再转动细调节器，使镜台微微上下，调节距离，使物像清晰。
（2）高倍镜的使用方法
①依上法先用低倍镜找到物像后，将欲观察的标本部分移到视野中央。
②眼睛从侧面注视物镜，用手转动物镜转换器，使高倍物镜对准标本（如果操作正确，此时物镜与标本之间距离正好，不会碰到）。
③眼睛向目镜内看，同时只需轻轻转动细调节器使镜台微微升降，即得到清晰的物像。
（3）油镜的使用方法
①同高倍镜的使用方法
②在玻片标本上需要观察的部分加上少许香柏油，然后转动物镜转换器，使油镜对准标本。
调节油镜至油镜的前端浸在香柏油内，从目镜观察，同时转动细调节器，至视野出现清楚物像为止。
油镜的放大倍数大，观察时要用较强的光线。
③观察以后，用粗调节器使镜台下降（镜筒上升），用擦镜纸将镜头、玻片标本上的香柏油擦去，可用少许二甲苯，但不能用力擦，以免损坏镜头和标本。
水分较多的临时制片，使用油镜观察时，应事先吸尽水分。
3．使用光学显微镜的注意事项
（1）取显微镜时必须右手握镜臂，左手托镜座，平贴胸前。
切勿一手斜提，前后摇摆，以防碰撞和零件跌落。
（2）擦拭显微镜的光学玻璃部分，必须用擦镜纸，切忌用其他硬质纸张或布等擦拭，以免造成镜面划痕。
（3）切忌用水、酒精或其他药品浸润镜台或镜头。
一旦沾染应立即进行处理，以免污染或腐蚀镜头。
（4）放置玻片标本时，应将有盖玻片的一面向上，否则会压坏标本和物镜。
（5）观察时应两眼同时张开，用左眼观察，用右眼注视绘图。
左手调节粗、细调节器，右手调节标本移动器和绘图。
实验完毕后，将显微镜擦拭干净。
物镜不要与镜台相对，关闭光圈，适当下降聚光器，将反光镜直立，送回原处。
实验二动物细胞形态结构的观察
一、实验目的
观察几种细胞的形态结构
二、实验用品
显微镜
三、实验内容
细胞的基本形态观察
（一）原理
细胞的形态结构与功能相关事很多细胞的共同点，在分化程度较高的细胞更为明显，这种合理性是生物漫长进化过程所形成点。
例如：
具有收缩机能的肌细胞伸展为细长型；具有感受刺激和传导冲动机能的神经细胞有长短不一点树枝状突起；游离点血细胞为圆形/椭圆形或圆饼形。
不论细胞的形态如何,细胞的结构一般分为三大部分:
细胞膜、细胞质和细胞核。
但也有例外，如哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。
（二）观察方法与结果
1.制备猪脊髓压片观察脊髓前角运动神经细胞。
在显微镜下观察，染色较深的小细胞是神经胶质细胞。
染色为蓝紫色的、大的、有多个突起的细胞是脊髓前角运动神经细胞，胞体呈三角形或星形，中央有一个圆形细胞核，内有一个核仁。
2.鸡血涂片点制备与观察
取一滴鸡血液，靠近一端滴在载玻片上，将另一载玻片点一端呈45°角紧贴在血滴点前缘，均匀用力向前推，使血液在载玻片上形成均匀的薄层，晾干，加瑞氏染液2~3滴，使覆盖整个血膜，固定0.5~1min，滴加等量或稍多点新鲜蒸馏水，与染料混匀染色5~10min，用清水冲去染液，待自然干燥后或用吸水纸吸干，即可进行镜检。
显微镜下可见鸡血细胞为椭圆形，有核。
白细胞数量少，为圆形。
3.观察平滑肌分离装片
低倍镜下观察平滑肌分离装片，可见染成紫红色呈纺锤形点肌细胞，细胞核为椭圆形，位于细胞的中央，着色很深，在细胞质中有淡红色的肌原纤维。
低倍镜观察油镜下
作业
1.思考题
为什么使用高倍镜或油镜必须从低倍镜到高倍镜或从低倍镜到油镜的顺序进行?
如果高倍镜下找不到物象，应从哪些方面找原因，如何解决?
2.绘图
截取40×或者油镜100×下鸡红细胞、神经细胞、平滑肌细胞的图。
实验三细胞器的光镜切片观察
一、实验目的
观察细胞器中光学显微镜下的基本形态结构
二、实验内容
两种细胞器的光镜切片
高尔基复合体的观察
脊神经节以硝酸钴固定，再经硝酸银染液浸染制成永久制片。
高尔基复合体能与硝酸银作用，并具有还原能力，使硝酸银呈现棕黑色沉淀颜色反应，因而显示高尔基复合体的形态和位置。
方法：
低倍镜观察：
寻找圆形或椭圆形的被染成黄色或淡黄色的细胞；
转换高倍镜：
中央透亮区为核所在位置，核周围棕褐色扭曲呈线状、颗粒状结构即为高尔基复合体。
线粒体的观察
原理
肝、肾组织细胞富含线粒体，以重铬酸钾固定，再经铁苏木精染色，制成永久制片。
线粒体有双层膜结构，蛋白、磷脂含量很高，有大量羧基和磷酸基等阴离子基团，含阳离子的铁苏木精易与其结合，使线粒体显示兰色反应。
方法
低倍镜观察：
可见许多被染成深兰色的细胞，选择颜色清晰，密集程度较低的区域；
转换高倍镜：
细胞核为1-2圆形的不着色的区域（有深兰色的核仁），核周围分布有许多深兰色颗粒或杆状小体，即线粒体。
附：
生物学实验绘图方法与要求
绘图时生物学实验报告点一种重要形式，其基本要求如下：
1.准备好3H铅笔、橡皮、刀、尺子及绘图纸，将绘图纸放在观察物的右边，纸下不要垫书或纸张。
2.绘图时，特别注意观察物的形状、各部分点位置、比例和毗邻关系。
3.图点位置、大小要适宜，图占报告纸左上方2/3点面积，并考虑注字点位置。
4.观察清楚后，选择典型的细胞或者组织，左眼看显微镜，右眼配合左眼，先用铅笔在纸上轻轻描出轮廓，使形态正确，然后再用清晰的线条绘出，线条粗细要均匀不要重复。
5.用圆点表示明暗和立体感，点的点大小要均匀，不能涂阴影。
6.图绘好后，要在图点右侧注明各部分结构名称，引线要直而平行，长短适度，各引线不能交叉，各线右端上下对齐，注字要用正楷，不能潦草，要自左向右写。
7.每一个图下面要注明图的点名称、放大倍数。
8.绘图纸上所有注字（包括姓名、实验日期、题目等）均用铅笔书写，不能用其他笔写。
作业
.绘图
截取40×或者油镜100×下高尔基体和线粒体
实验四动物细胞培养
细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养。
使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育等过程的观察。
因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离了生物机体后的—些变化。
细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等
Ⅰ清洗与灭菌
一、实验目的
1.了解细胞原代培养、传代培养的基本操作方法；
2.掌握细胞培养过程中的无菌操作技术；
3.学习倒置显微镜的使用及培养细胞的观察。
二、实验原理
清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。
细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。
清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。
如有毒的化学物质，也可能影响细胞生长。
灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。
假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
三、实验材料、用品
材料：
无臭氧型紫外灯，微孔滤膜（直径25）：
孔径为0.22μm，微孔滤膜（直径90）：
孔径为0.22μm，过滤器（直径25）。
药品：
70％或75％酒精，0.1％新洁尔灭，煤酚皂溶液（来苏儿水），0.5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸（工业），DEPC水[体积分数0.1％的焦炭酸二乙酯。
仪器：
超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。
四、实验步骤
（一）清洗
1.新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。
2.使用过的玻璃器皿的清洗
（1）使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。
（2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。
（3）浸酸性洗液过夜。
（4）从酸性洗液捞出后自来水冲洗10~15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。
（5）包装（牛皮纸或一般纸）。
（6）高压（15磅20min）或干热（170℃2h）灭菌。
（7）贮存备用。
3.胶塞的处理
（1）新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2％NaOH煮沸l0-20min。
（2）自来水清洗10次。
（3）再用1％稀盐酸浸泡30min。
（4）自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。
晾干，高压灭菌。
旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。
（二）消毒
1.物理消毒法
（1）紫外线消毒用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。
这是常使用的消毒方法之一。
（2）干热灭菌主要用于玻璃器皿的灭菌。
将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160℃，保温90~120min。
用于RNA提取实验的用品则需180℃，保温5~8h。
（3）湿热灭菌此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。
主要应用范围是布类、橡胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液（如Hanks液、PBS、20×SSC等）。
手动高压灭菌锅操作如下：
①首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。
②加热高压锅。
将放气阀打开，放气5~10min，以排除锅内的冷空气。
③待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用15磅（121℃）30min，胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅（115℃）20min。
调节火力大小保持该压力。
④停止加热，待压力自然下降至0再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。
（4）滤过除菌用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。
采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。
滤器型号按直径大小划分。
如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器（直径90mm、100mm、142mm……等），配以过滤泵使用。
过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器（直径20mm、25mm等）。
滤膜孔径有0.60μm、0.45μm、0.35μm、0.22μm、0.10μm等，以0.22μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。
①在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为0.22μm。
②用布包好，湿热灭菌后使用。
2.化学消毒法
常用的消毒液有如下几种：
（1）70％（或75％）酒精：
超净台里常备70％酒精棉球（卫生级酒精），用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。
（2）0.1％新洁尔灭：
主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。
超净台旁应常备盛有0.1％新洁尔灭溶液的容器及纱布。
（3）来苏儿水（煤酚皂溶液）：
主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。
使用浓度请按瓶上说明。
（4）0.5％过氧乙酸：
是强效消毒剂，10min即可将芽孢菌杀死。
用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。
（5）乳酸蒸气：
将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。
将门窗紧闭1—3d。
可将空气中漂浮的微生物杀死。
（6）37％甲醛加高锰酸钾：
使用前先紧闭门窗。
将37％甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。
用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。
1—3d后方可达到消毒空气的目的。
3.煮沸消毒急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15min后使用。
五、注意事项
1.清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10—15次。
因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。
清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。
千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。
Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。
如没有洗净会影响下一次使用的效果。
2.干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。
当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。
器皿烤完后，待温度降至100℃之下才能开烤箱门。
金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。
.
3.高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。
4.牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压（如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS等）。
5.滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜（有时可在上面加一层定性滤纸），包好，经高压灭菌后才能使用。
滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。
过滤时压力不宜过大，压力数字以2为宜。
压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。
装滤膜时位置要准确。
另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。
6.使用化学消毒法时，配制75％酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。
来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。
空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。
因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。
六、思考题
1.哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
2.紫外线消毒的适用范围和目的是什么?
II、原代细胞培养与观察
一、实验目的
1.了解细胞原代培养基本操作方法；
2.掌握细胞培养过程中的无菌操作技术；
3.学习倒置显微镜的使用及培养细胞的观察。
二、实验原理
动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将它分散成单个细胞后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
三、实验用品
1、器材
解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）等。
上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.9xl04Pa（15磅）灭菌30min备用。
此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。
2、试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）、无钙、镁溶液、细胞消化液：
0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTA
DMEM液
3、材料
乳鼠
四、实验方法
操作步骤
方法一：
胰酶消化法
1.洗手，用酒精擦手。
2.点燃酒精灯，将所需用品摆放整齐，方便自己操作。
3.取一只乳鼠，浸入75%乙醇中2~3s，然后取出来，放在灭菌好的培养皿中。
4.取材：
取出无菌的手术器械，如果乳鼠还没有死亡，用镊子夹其头部处死乳鼠。
用镊子提起腹部皮肤，用解剖剪充分剪开腹腔，将肝脏组织取下来，放入一个灭菌好的青霉素瓶中，用无菌吸管吸取3mlHanks液清洗2~3次，直至去掉血污为止。
5.消化：
将洗净的组织块移入干净的无菌的青霉素瓶中，将剪刀伸入瓶内反复剪切组织块，直至剪到0.5~1mm3大小的块状为止。
加入2ml0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动，去掉胰酶溶液，重新加入3ml胰酶溶液，盖好盖子，放在37℃水浴中消化20~30min，注意每间隔5min振摇一次。
视组织块变得疏松，颜色略变白时随即从水浴中取出，放入超净台内，用吸管反复吹打，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞，加入1~2ml培养液终止胰酶消化，静止片刻，让未被消化完的组织自然沉降，然后用吸管将细胞悬液移入无菌青霉素瓶中，盖好盖子。
6.离心：
将青霉素瓶做好标记，平衡后以1000r/min离心8min。
在超净台内弃上清，加入3ml培养液，吹打混匀后，取1滴去镜检，适当调整细胞密度。
7.细胞培养：
取1ml细胞悬液至一干净的培养皿中，再添加1~2ml培养液，盖上盖子后，轻轻摇匀，置37℃培养箱中培养。
8.观察：
每天对培养的细胞做常规检查，观察的主要内容是：
污染与否、细胞生长状态和pH（培养液颜色变化）等情况。
如发现培养液变为柠檬黄又显浑浊，表明可能被污染，细胞也就不易贴壁生长而逐渐死亡。
如培养液颜色为橘红色，一般说明细胞生长状态良好。
接种24h后，可见到许多细胞贴壁（由圆形悬浮状态的细胞延展成扁平状）。
随着培养时间的延长，细胞生长繁殖数量增加，培养液会逐渐变为黄色，这时可进行传代培养。
方法二：
1~4步骤同胰酶消化法
5.将洗净的组织块移入消毒的青霉素瓶中，用眼科剪刀剪切成0.5mm的小块，然后加入1~2滴培养液，轻轻吹打混匀。
用吸管分次吸取组织浆块，放入培养瓶壁上散开，然后翻转培养瓶，使贴服组织面朝上，加入3~4ml培养液，加盖，做标记后，放置一段时间后，待组织小块略干燥能牢固贴于瓶壁时，再慢慢翻转培养瓶（动作一定要轻，减少振动，防止组织块脱落），使组织块浸泡在培养液中静置培养。
6.观察：
同胰酶消化法。
.传代细胞培养与观察
一、实验目的
了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状况。
二、实验原理
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：
2或1：
2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。
这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA）所破坏。
所以—般采用胰蛋白酶和EDTA（乙二胺四乙酸盐）的混合物，做为消化液。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：
一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
三、实验用品
1、器材
解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）等。
上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.9xl04Pa（15磅）灭菌30min备用。
此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。
2、试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）
无钙、镁溶液
细胞消化液：
0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTA
DMEM液
3、材料
鸡胚细胞
四、实验方法
在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。
1.营养液配制:
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