一株海洋琼胶酶产生菌的分离筛选和初步鉴定.docx
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一株海洋琼胶酶产生菌的分离筛选和初步鉴定
一株海洋琼胶酶产生菌的分离、筛选和初步鉴定
刘美英，梅建凤，应国清，王鸿（浙江工业大学药学院，浙江杭州310014）
摘要：
目的从海水中分离活性较高的琼胶酶产生菌，以制备琼胶酶用于琼胶寡糖的生产，琼胶寡糖具有多种生物活性，在食品、化妆、医药等行业有广阔的应用前景。
方法以琼胶为唯一碳源，用稀释涂布平板法进行分离，平板透明圈法进行初筛，摇瓶培养法进行复筛，改进的DNS比色法进行酶活力的测定。
结果从海水中分离筛选到18株琼胶降解菌株，经复筛得到一株产酶活力较高的海洋细菌HS0326-601，并对该菌株进行了初步鉴定，结果表明其为革兰氏阴性细菌，菌体呈短杆状。
结论鉴于该菌株生长速度快，通过对其进一步的诱变和发酵条件优化，有望成为高产琼胶酶产生菌，从而为琼胶酶、琼胶寡糖的深入研究和开发应用奠定基础。
关键词：
琼胶降解菌；琼胶酶；分离；筛选
中国分类号：
文献标识码：
A文章编号：
0000-0000（2008）00-0000-00
Isolation,ScreeningandIdentificationofAgarase–ProducingBacteriafromtheSeawater
LIUMei-ying,MEIJian-feng,YINGGuo-qing*,WANGHong（Collegeofpharmaceuticalscience,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310014,China）
ABSTRACT:
OBJECTIVETodegradeagarintoagaro-oligosaccharidebytheagarasewithahigheractivity,thestrainswereseparatedfromseawater.Theagaro-oligosaccharidehaveshownwideapplicationvaluesinfoodindustry,cosmeticindustry,pharmaceuticalindustryandothersectors.METHODSTheagarase-producingbaceriawereisolatedbythespreadplatemethod,first-screeningbyclearhalosonagarplatecontainingagarasthesole-carbonsource,second-screeningofshakingculture.TheenzymaticactivitiesweredeterminedbyimprovedDNScolorimetrymethod.RESULTS18agar-degradingstrainswereisolatedfromtheseawater,andamorepowerfulagarase-producingmarinebacteriumwasobtained.ThestrainwasdesignatedasstrainHS0326-601andidentifiedpreliminarilyasGramnegative,rod-shaped.CONCLUSIONWithregardtoitshighgrowthspeed,iffurthertreatedwithmutagens,thestrainmightbeonewithahighenzymicactivityafterfermentationoptimization,anditcouldbeusedtothefurtherstudyandappliedtothepreparationofagaraseforagaro-oligosaccharideproductioninindustry.
KEYWORDS:
agarase-producingbacteria;agarase;isolation;screening
琼胶（agar）是一种从海洋红藻中提取得到的多糖，其在食品、医药卫生等行业已有悠久的应用历史，但由于琼胶黏度高，水溶性低，不易被吸收，因此在应用方面受到很大的限制。
而琼胶寡糖（agaro-oligosaccharide），即琼胶多糖经水解后聚合度为2~10的低聚糖，又称琼胶低聚糖，主要由琼二糖的重复单位连接而成，水溶性好，有利于人体吸收，大大提高了其应用价值，琼胶寡糖具有较强的抗癌[1,2]、抗氧化[3,4]、抗炎[2,5]及抗病毒[1,6]等活性，是一种极具开发潜力的低聚糖。
琼胶酶能降解琼胶生成琼胶寡糖,与琼胶的化学降解相比，琼胶酶降解琼胶则具有特异性强的优点，可选择性地酶解切断特定化学键，从而制得特定聚合度的寡聚糖，并且具有反应条件温和，降解过程易于控制，无副反应，环境污染少等优点，在制备琼胶寡糖中具有明显的优势。
除了制备琼胶寡糖之外，琼胶酶还可用作工具酶、用于回收DNA或RNA、海藻多糖结构的研究等[7,8]。
我国对于海藻多糖降解酶的研究尚处于起步状态，进行的研究大多局限于产酶菌株的筛选、酶的制备、纯化与性质分析、及酶的应用等方面，还未见关于其投入规模化发酵生产的报道，关键就在于缺乏酶活力高的菌株[9]。
因此筛选高产琼胶酶产生菌具有重要的理论意义和应用价值。
目前，琼胶酶产生菌可以从海水、海洋动物肠道、底泥等海洋环境以及湖泊、河流、排污口等陆地环境中获得[1,10~12]，甚至从菠菜根系中也可筛选到琼胶降解菌株[13]，但大多数琼胶酶产生菌从海洋环境中分离得到[1]。
本实验先后从舟山、台州等地采集海水样，从中分离筛选到一株活力较高的菌株，并对其进行了初步鉴定。
旨在为琼胶酶、琼胶寡糖的深入研究和开发应用提供基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1海水样品取自浙江舟山册子岛、金塘和朱家尖等藻类繁殖地和台州温岭箬横、坞沙门及三门等紫菜养殖地海水。
1.1.2培养基组成
①分离培养基（%）：
NaCl2.5；NH4Cl0.1；MgSO4•7H2O0.5；KCl0.1；FeSO4•7H2O0.002；CaCl20.02；NaH2PO40.06；琼脂2；pH7.0。
②斜面培养基（%）：
NaCl2.5；酵母浸出粉0.5；MgSO4•7H2O0.5；KCl0.1；FeSO4•7H2O0.002；CaCl20.02；NaH2PO40.06；葡萄糖0.1；琼脂2；pH7.0。
③复筛培养基（%）：
琼脂0.2；酵母浸出粉0.25；其他成分同海水分离培养基。
以上培养基均为121℃、20min灭菌；液体培养基装量为35ml/250ml摇瓶。
1.2方法
1.2.1海水样品的采集
采集海水样品装于塑料瓶中，紫菜等样品装于样品袋中。
采集的样品置于4℃冰箱保存。
1.2.2样品的驯化富集
取琼胶适量，海水样品40mL，在酒精灯旁加入250mL锥形瓶中，28℃、200r•min-1连续振荡培养，定期加入适量蒸馏水至原体积，目测培养液明显混浊后，取培养液4mL接种于含琼胶5g、36mL该海水样品的三角瓶中，重复上述培养过程。
1.2.3菌株的分离
采用稀释涂布平板法：
用无菌移液管吸取海水或富集样品5mL，加入含一层玻璃珠和45mL无菌人工海水的三角瓶中，200r•min-1振荡30min，混匀制成菌悬液，用无菌人工海水适当稀释，移取0.2ml涂布于分离培养基平板上，28℃培养，直至平板上长出菌落。
1.2.4菌株的初筛
观察平板上菌落形态，挑取周围形成明显凹陷的菌落，并在平皿底部作标记，再滴加卢戈氏碘液染色。
保留那些平板上能产生透明圈菌落的对应斜面，弃去染色后无透明圈菌落的对应斜面，将前者置于28℃培养，供复筛用。
1.2.5菌株的复筛
用接种环挑取初筛菌株的新鲜斜面菌苔2环，接入复筛摇瓶培养基中，28℃、200r•min-1发酵培养48h。
将发酵液于3000r•min-1下离心10min后取上清液测酶活力，筛选出产酶活力最高的菌株进行纯化。
1.2.6菌种纯化
用接种环挑取复筛得到的新鲜斜面种菌苔，用无菌人工海水适当稀释，取0.2mL涂布于分离培养基平板上。
28℃培养，直至平板上长出菌落，将单菌落挑至斜面上培养。
然后进行复筛，方法同1.2.4，筛选出产酶活力最高的菌株用于发酵产酶。
1.2.7琼胶酶活力的测定
①粗酶液的制备将发酵液于3000r•min-1下离心10min后上清液即为粗酶液。
②改进的DNS比色法测定琼胶酶活力用pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制0.2%的琼胶底物溶液20mL。
加入4mL待测酶液，35℃、150r•min-1摇床反应1h。
立即取1mL反应液于带有刻度的试管中，加入0.5mLDNS溶液于沸水浴中共热5min后立即冷却至室温，定容至10mL。
测520nm波长处的吸光度。
③酶活力单位定义在上述反应条件下，1mL酶液1min产生lμg还原糖为一个酶活（U）。
1.2.8菌体浓度的测定采用紫外-可见分光光度法在620nm波长下测定培养液的吸光度。
1.2.9菌株的初步鉴定
琼胶降解菌株的初步鉴定按参照文献[14]进行。
首先观察菌落形态、镜检观察个体形态，革兰氏染色，再作进一步鉴定。
2结果与分析
2.1琼胶降解菌株的筛选
2.1.1菌株的初筛
在对舟山、台州各地的海水样进行早期筛选后发现，温岭箬横紫菜养殖地的海水样中的琼胶酶产生菌较多，且产酶活力也较高。
故在本研究中对该海水样进行驯化富集，以琼胶为唯一碳源进行富集培养，以期获得更多、酶活力更高的琼胶降解菌株。
平板培养后用卢戈氏碘液染色，琼胶与碘结合而被染色。
产琼胶酶的菌株，由于其菌落周围琼胶被降解形成琼胶寡糖，而琼胶寡糖具有还原性，不能着色，因此其菌落周围可形成透明圈，这样便可以很好地从海水样中分离筛选到琼胶降解菌。
观察培养基平板可发现菌落所在的培养基呈釜底形凹陷，并且有较大的透明圈，筛选的平板透明圈见图1。
采用此法，分离到了18株琼胶降解菌，分别测定其菌落直径和透明圈直径，结果见表1。
图1琼胶酶筛选平板经卢戈氏碘液染色后的照片
Fig.1PhotographoftheagarplatestainedbyLugol’sforagarolyticstrainsscreening
表118株琼胶降解菌菌落直径和透明圈直径
Tab.1Diameterofcolonyandhalofrom18strains
Strains
Diameterofcolonies（DC）/cm
Diameterofinnerclearhalos（DH）/cm
HCvalue（DH/DC）
1
0.214
0.438
2.047
2
0.230
0.466
2.026
3
0.202
0.428
2.119
4
0.162
0.360
2.222
5
0.186
0.390
2.097
6
0.524
1.018
1.943
7
0.120
0.304
2.533
8
0.240
0.484
2.017
9
0.216
0.398
1.843
10
0.198
0.412
2.081
11
0.100
0.286
2.860
12
0.054
0.208
3.852
13
0.118
0.246
2.085
14
0.214
0.536
2.505
15
0.188
0.488
2.596
16
0.830
2.016
2.429
17
0.200
0.452
2.260
18
0.210
0.510
2.429
由表1可以看出，6、14、16号菌株所产的透明圈较大，但由于即使同一个平皿上长出的菌落，其大小也不一，细胞生物量也有所不同，透明圈的大小并不能反映菌株产酶的比活性，因此分别测定它们的菌落直径，但发现这18株菌株的HC值（DH/DC）也相差不大。
为了客观地反映菌体的生长和产酶能力，将此18株菌株进行进一步的筛选。
2.1.2菌株的复筛
利用平板初筛只能定性地挑选出产酶菌株，而以摇瓶培养形式进行的复筛则可以定量地比较各菌株产酶活力及其菌体生长情况。
复筛培养基仍以琼胶作为唯一碳源，培养48h后分别测定发酵液的琼胶酶活力和菌体浓度。
结果见表2。
表2复筛各菌株产酶活力的比较
Tab.2Comparisionofagaraseactivityproducedbydifferentstrains
Strains
Enzymeactivity/U
Concentrationofstrains（OD620）
1
9.38
1.964
2
4.25
1.086
3
9.20
1.612
4
5.09
0.813
5
4.43
0.719
6
12.09
1.190
7
5.09
1.444
8
3.59
1.469
9
4.90
0.618
10
5.46
1.572
11
6.02
0.807
12
3.87
0.693
13
5.09
1.134
14
4.81
1.534
15
6.58
0.762
16
11.25
0.285
17
5.27
1.012
18
6.58
1.639
由表2可见，6和16号菌株的酶活较高，分别为12.09U和11.25U，选前者作为高产菌株，编号为HS0326-6。
在此值得一提的是，16号菌株的透明圈直径为2.016cm，其HC值为2.429cm，而6号菌株透明圈和HC值各为1.018cm和1.943cm。
可见16号菌株的透明圈和HC值均比6号大，而前者的酶活却不如后者，其他菌株的情况也与此类似，这就说明在评价菌株产酶活性高低时，应以摇瓶复筛数据为准，而初筛中透明圈和HC值的大小仅作参考。
这与汤海青[9]指出的“透明圈的大小与菌株产酶活性的高低有一定正相关”并不一致。
关于透明圈和酶活之间的关系，有待进一步研究。
2.1.3菌种纯化
从自然环境中的微生物样品，经过一次分离形成单菌落，转接斜面培养得到的菌株，因脱离了自然环境条件，在传代培养中细胞发生性状衰退的频率增加，直接使用往往存在酶活急剧下降，甚至丧失酶活，需要经过多次纯化培养才能达到稳定的遗传。
实验对复筛得到的高产琼胶降解菌株HS0326-6进行试管斜面活化和平板再次纯化，以筛选出产酶活力较高且稳定的菌株。
经过纯化培养，得到高产菌株HS0326-601，其酶活为20.78U，较纯化前提高了72%，且酶活稳定。
2.2菌株HS0326-601的初步鉴定
菌株HS0326-601在分离培养基平板上培养，3-4d天可以形成菌落，菌落大小中等。
菌落形态特征为：
菌落呈圆形，淡黄色，边缘整齐，表面湿润，中央凹陷，不透明（图2）。
斜面培养21h左右菌苔铺满斜面，菌苔呈淡黄色，厚度中等（图3）。
镜检观察菌株的个体形态和革兰氏染色结果表明，菌株HS0326-601为革兰氏阴性细菌，菌体呈短杆状，见图4。
图2琼胶降解菌的平板纯化图
Fig.2Clonesofagarolyticbacteriainplatecultivation
图3琼胶降解菌的斜面培养
Fig.3Tubecultureofagarolyticbacteria
图4显微镜观察的菌体（放大1000倍）
Fig.4Theshapeofstrainobservedbymicroscopy（×1000）
3讨论
3.1在对紫菜养殖地的海水样、紫菜样及土样进行早期筛选后发现，海水样中筛选到的琼胶降解菌株较多，且产酶活力明显高于后两者。
故本实验对海水样进行驯化富集，以期获得更多、产酶活力更高的琼胶降解菌株。
3.2本实验中发现，透明圈和HC值均较大的菌株，其酶活不一定较高，说明在评价菌株产酶活性高低时，我们应以摇瓶复筛数据为准，而初筛中透明圈和HC值的大小仅作参考。
3.3菌株HS0326-601在分离培养基平板上生长较慢，一般需要3~4d左右才能长成大小适宜的单菌落。
而斜面培养时生长则较快，培养21h左右即可长出较厚的菌苔。
鉴于该菌株生长速度快，通过对其进一步的诱变和发酵条件优化，有望成为高产琼胶酶产生菌，从而为琼胶酶、琼胶寡糖的深入研究和开发应用奠定基础。
此外，实验中还发现此类菌株对环境变化较为敏感，遗传性能不够稳定，多次传代后产酶活力有所下降。
因此，在后续实验中，除了对菌种进行保藏之外，还需对菌株进行定期活化。
目前正在对此菌株进行进一步的鉴定，同时，为提高其产酶活力，对该菌株的诱变选育和发酵条件优化也正在进行之中。
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