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南瓜种籽中活性物质提取工艺的优化

摘要:

南瓜籽中含有丰富的植物甾醇，角鲨烯，维生素E、胡罗卜素等活性物质，其中植物甾醇，角鲨烯，维生素E都属于不皂化物的重要组成部分。

本试验首先进行单因素实验，以不皂化物的提取率为指标，考察不同皂化时间、皂化温度、液料比、KOH-乙醇溶液浓度四个因素对南瓜籽中不皂化物质提取量的影响，在单因素实验的基础上，再选用响应面（RSM）法，优化最佳皂化工艺条件。

最终确定在皂化时间为1.5h、皂化温度为69℃、液料比为10mL/g和KOH-乙醇浓度为2mol/L时，不皂化物的理论得率为1.37%。

关键词：

南瓜种籽活性物质提取优化

前言

1.1南瓜籽简介

南瓜（CucurbitmoschataDuch），属葫芦科一年生草本植物，又名倭瓜、番瓜、饭瓜、窝瓜等。

南瓜以其营养价值极高被世界营养学家公认为是21世纪的保健食品。

南瓜的果实、茎、叶、花朵和种子中含有丰富的胡罗卜素、多糖、南瓜子氨酸、环丙基氨基酸（CTY）、南瓜子碱、葫芦巴碱、膳食纤维、抗菌活性蛋白，植物甾醇，角鲨烯，维生素E等[1]。

特别是由于科学技术的发展，国外一些科学技术先进的国家对南瓜所具有的保健功能有了更多新的发现，并对过去已知和新发现的这些功能给予很高评价，从而显著地提高了南瓜在蔬菜生产和加工领域的地位，南瓜生产和消费迅速发展。

南瓜籽味甘、性温,归脾、胃、大肠经,有驱虫、下乳、健脾、利水之功效,主治绦虫、蛔虫、钩虫病、百日咳、产后缺乳、腹胀、产后手足浮肿、痔疮等症[2]。

南瓜籽中油脂量较高,其保健功效成分主要存在于南瓜籽油中,油脂成分占到干质量的35%~50%,最高的可达到64.4%[3]。

南瓜种子中含有丰富的植物甾醇，角鲨烯，维生素E、胡罗卜素等活性物质。

具有驱除寄生虫、降低胆固醇、抗炎、抗氧化、缓解高血压、治疗和预防前列腺增生等作用。

虽然我国籽用南瓜的栽培面积逐年扩大，但是籽用南瓜的加工利用很少，没有进行南瓜籽的深层开发。

1.2不皂化物简介

不皂化物包括自然界中的脂类物质如甾醇，烃类，醇类，脂肪族和萜烯醇类等。

不皂化物：

在本标准规定的操作条件下，试样用氢氧化钾皂化后的全部生成物用一种特定的溶剂提取，蒸发溶剂、干燥后的残留物,用质量百分含量表示。

生育酚，脂肪醇，角鲨烯和植物甾醇等属于不皂化物的组成部分[4]-[6]，其中植物甾醇占重要部分[7],除了南瓜籽等3种籽油外，几乎所有的油不皂化物中甾醇部分占大约30%[8]，研究表明，南瓜籽不皂化物中含有植物甾醇（β-谷甾醇和豆甾醇33.3mg/100g籽），角鲨烯（89.0mg/100g籽）和生育酚（15.7mg/100g籽）[9]。

油不皂化物中含有角鲨烯，角鲨烯是三萜类开环化合物,是甾醇和4-甲基甾醇的生源前体,有助于提高油类的氧化稳定性[10]，油不皂化物含有生育酚和甾醇具有抗氧化作用，对油的稳定性起到重要作用，可考虑不皂化物作为天然抗氧化剂使用[11]。

2试验材料与方法

2.1原料来源

本试验选用黑龙江省宝库1号裸仁南瓜籽为原料，由黑龙江省讷河市宝库良种繁育研究所提供。

2.2仪器与试剂

2.2.1仪器

仪器名称

生产公司

W201恒温浴锅

上海申胜生物技术有限公司

电热恒温水浴锅

上海市医疗器械五厂

202-2A型电热恒温干燥箱

天津市泰斯特仪器有限公司

B型玻璃仪器气流烘干器

郑州杜甫仪器厂

R-205旋转蒸发仪

上海申胜生物技术有限公司

SHB-3型循环水多用真空泵

郑州杜甫仪器厂

SHB-Ⅲ型循环水多用真空泵

郑州长城科工贸有限公司

FW100型高速万能粉碎机

天津市泰斯特仪器有限公司

电子天平

上海梅特勒—托利多仪器有限公司

2.2.2试剂

试剂名称

纯度

试剂来源

无水乙醇

分析纯

天津市天力化学试剂有限公司

正己烷

分析纯

天津市天力化学试剂有限公司

氢氧化

分析纯

天津市天力化学试剂有限公司

盐酸

分析纯

天津市科密欧化学试剂有限公司

无水硫酸钠

分析纯

天津市天力化学试剂有限公司

乙醚

分析纯

天津市天力化学试剂有限公司

2.3试验方法

2.3.1南瓜籽粉的制备

南瓜籽经过筛选，除去杂质后粉碎过筛，储存于-20℃冰箱中，备用。

2.3.2实验流程及原理

实验流程见图2-1：

图2-1南瓜籽中提取不皂化物实验流程

实验原理见图2-2：

图2-2南瓜籽中提取不皂化物实验原理

2.3.3南瓜种籽中提取不皂化物质最佳皂化条件研究

首先进行单因素实验，考察不同料液比、KOH-乙醇溶液浓度、皂化时间和皂化温度这四个因素对非皂化物质提取率的影响，确定较优水平；在单因素实验的基础上，再选用响应面安排试验，对试验结果进行优化，从而确定最佳皂化工艺条件。

2.3.3.1不同皂化时间对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响

精确称取2g样品，在优化后酸解条件的基础上，以液料比为15mL/g加入0.5mol/L的KOH-乙醇溶液，于温度为80℃水浴上回流加热，皂化时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，考察不同皂化时间对不皂化物提取的影响，每项实验重复三次。

2.3.3.2不同皂化温度对南瓜种籽对不皂化物质提取率的影响

精确称取2g样品，以液料比为15mL/g加入0.5mol/LKOH-乙醇溶液，分别在温度为30、40、50、60、70、80、90℃条件下进行皂化，皂化时间为1h，研究不同皂化温度对不皂化物提取的影响，每项实验重复三次。

2.3.3.3不同液料比对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响

精确称取2g样品，分别以液料比为5、10、15、20、25mL/g加入0.5mol/LKOH-乙醇溶液，于皂化温度为80℃，皂化时间1h条件下进行皂化处理，研究不同液料比对不皂化物提取的影响，每项实验重复三次。

2.3.3.4不同KOH-乙醇溶液浓度对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响

精确称取2g样品，以液料比为15mL/g分别加入浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mol/LKOH-乙醇溶液，于皂化温度为80℃，皂化时间1h条件下进行皂化反应，研究不同KOH-乙醇溶液浓度对不皂化物提取的影响，每项实验重复三次。

2.3.4响应面法确定不皂化物最佳皂化工艺参数

2.3.4.1响应面实验

通过以上单因素试验，确定液料比、KOH-乙醇溶液浓度、皂化时间和皂化温度这四个因素的较优水平，用响应面法设计实验。

2.3.4.2响应面验证实验

精确称取2g样品，按响应面实验得出的最优皂化工艺条件进行实验，实验重复三次。

对试验结果进行分析，确定不皂化物最佳皂化工艺条件。

3结果与分析

3.1南瓜种籽中提取不皂化物质最佳皂化条件研究

3.1.1不同皂化时间对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响

不同皂化时间对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响，见图3-1：

图3-1不同皂化时间对不皂化物提取率的影响

在图3-1中可以看出在不同皂化时间对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响的单因素实验中，皂化时间较短时，南瓜籽组织中的结合态的活性物质还没有完全与KOH-乙醇溶液反应中，收率不高，但是随着皂化时间的加长，到1.5h，不皂化物的提取率显著的上升，并达到最高值。

但是超过1.5h收率开始缓慢下降，原因是随着皂化时间的加长，提取出的不皂化物容易在长时间皂化条件下发生包裹，影响了不皂化物的提出，最后确定皂化时间选择1.5h为宜。

3.1.2不同皂化温度对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响

不同皂化温度对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响见图3-2：

图3-2不同皂化温度中对皂化物提取率的影响

在图3-2中可以看出在不同皂化温度对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响的单因素实验中，在皂化温度很低时，南瓜籽脂萃取物与KOH-乙醇溶液不能充分反应，甚至没有发生反应，所以提取出不皂化物含量少，但是随着皂化温度的升高，到70℃，不皂化物的含量显著的上升，并达到最高值。

但是超过70℃含量开始下降，最后确定皂化温度选择60℃为宜。

3.1.3不同液料比对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响

不同液料比对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响见图3-3：

图3-3不同液料比对不皂化物提取率的影响

在图3-3中可以看出在不同液料比对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响的单因素实验中，从5：

1开始不皂化物质提取量开始升高，10:

1时达到最高值，之后随着液料比的增大，提取量逐渐减小，是因为当南瓜籽脂提取物与碱已经充分接触，继续增加液料比会降低溶液浓度，从而提取率降低，所以液料比选择10:

1为宜。

3.1.4不同KOH-乙醇溶液浓度对不皂化物质提取率的影响

不同KOH-乙醇溶液浓度对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响见图3-4：

图3-4不同KOH-乙醇溶液浓度对不皂化物提取率的影响

在图3-4中可以看出在不同KOH-乙醇溶液浓度对南瓜种籽中不皂化物质提取率的影响的单因素实验中，当KOH-乙醇浓度较低时，皂化反应不完全，因而提取率随着浓度的增大而增高，当浓度达到2mol/L时达到最高，之后再增大碱的浓度，提取率缓慢降低，因而确定KOH-乙醇溶液浓度为2mol/L为宜。

3.2响应面法确定不皂化物最佳酸解工艺参数

响应面的优化完整的设计为表1所列的由南瓜籽中不皂化物提取的单因素实验统计计算出的29个组合，其中包括由南瓜籽中提取不皂化物质的单因素实验确定的五个重复的中心点（见表2）和其他24组结果（见表2）。

表中A为皂化时间、B为皂化温度、C为液料比和D为KOH-乙醇溶液浓度。

表1.设计实验测试的因素和水平

因素Lowlevel（−1）Mediumlevel（0）Highlevel（+1）

皂化时间（A,h）1.01.52.0

皂化温度（B,℃）607080

液料比（C,mL/g）5:

110:

115:

1

KOH-乙醇溶液浓度（D，mol/L）1.02.03.0

3.2.1响应面法确定不皂化物最佳皂化工艺参数结果分析

根据调查区域内的独立变量的函数，不皂化物产量的数学模型是由下面的公式表示：

不皂化物质提取率=+1.37-0.010*A-8.775E-003*B-7.092E-003*C+0.023*D-0.015*A*B-0.040*A*C+0.017*A*D+0.024*B*C-7.100E-003*B*D

+5.000E-004*C*D-0.096*A2-0.078*B2-0.055*C2-0.18*D2

（1）

决定系数（R2=0.9969）表明，该模型充分代表所选择的参数之间的真正关系。

调整的决定系数（adj-R2=0.9938）表示式1是适合来表示不皂化物的响应面实验。

高的adj-R2是更好的观察和预测值之间的相关程度的标准。

同时，一个非常较低的值的变异系数（C.V.%）的0.64的精确度清楚地表明实验值的可靠性。

在表3的数据表明，不皂化物的线性相关系数和二次项系数（A^2，B^2，C^2，D^2）是非常非常小的显着的p值（P<0.01），其他长期系数BD、CD不显着（P>0.05）。

表3.不皂化物提取率的回归模型的方差分析结果

SourceSumofDFMeanF-valuep-value

SquaresSquare

unsaponifiablematter（R2=0.9969;adj-R2=0.9938;C.V.%=0.64）

Model0.27140.019322.98<0.0001significant

A-皂化时间1.310E-00311.310E-00322.220.0003

B-皂化温度9.240E-00419.240E-00415.670.0014

C-液料比6.035E-00416.035E-00410.230.0064

D-KOH-乙醇浓度6.193E-00316.193E-003105.00<0.0001

AB9.333E-00419.333E-00415.820.0014

AC6.504E-00316.504E-003110.28<0.0001

AD1.176E-00311.176E-00319.950.0005

BC2.247E-00312.247E-00338.09<0.0001

BD2.016E-00412.016E-0043.420.0857

CD1.000E-00611.000E-0060.0170.8983

A20.06010.0601015.64<0.0001

B20.03910.039662.88<0.0001

C20.02010.020331.00<0.0001

D20.2110.213608.92<0.0001

Residual8.257E-004145.898E-005

LackofFit7.731E-004107.731E-0055.880.051notsignificant

PureError5.259E-00541.315E-005

CorTotal0.2728

（a）（b）（c）

（d）（e）（f）

图3-5响应面等高线图

响应面等高线图为自变量对提取不皂化物收率的影响：

（a）皂化时间和皂化温度，（b）皂化时间和液料比，（c）皂化时间和KOH-乙醇溶液浓度，（d）皂化温度和液料比，（e）皂化温度和KOH-乙醇溶液浓度，（f）液料比和KOH-乙醇溶液浓度

响应面方法，在确定独立变量的最佳值方面，发挥了关键作用。

根据因变量可以到达最大响应。

在响应面图中，响应面积得到的不皂化物提取率随着两个连续变量改变，其他变量均固定在其各自的零水平的基础上。

图3-5（a）表示在固定的液料比和KOH-乙醇溶液浓度时酸解时间和酸解温度的交互作用和对不皂化物收率的影响，从图中，我们可以看到，在一定范围内增加皂化时间和皂化温度使提取率增高，皂化时间（1.5h），皂化温度（70℃），皂化时间和皂化温度的改善不会进一步增加不皂化物收率。

图3-5（b）显示了皂化时间和液料比对不皂化物收率的影响，随着皂化时间和液料比增加不皂化物质提取率增大，但达到一定值，皂化时间（1.5h）和液料比（10:

1）时则不在升高。

图3-5（c）表示皂化时间和KOH-乙醇溶液浓度对不皂化物提取率的影响，当皂化时间和KOH-乙醇溶液浓度达到1.5h和2.0mol/L，使不皂化物提取率提高到最大值。

但超出这个水平，不皂化物的提取率下降。

图3-5（d）表示皂化温度和液料比对不皂化物提取率的影响，随着皂化温度和液料比增加不皂化物质提取量增大，但达到一定值温度和液料比为（70℃）和（10:

1）时则不在升高，。

图3-5（e）表示皂化温度和KOH-乙醇溶液浓度对不皂化物提取率的影响，由图可以看出较低温度和低浓度的KOH-乙醇对不皂化物的提取效果很差。

图3-5（f）表示液料比和KOH-乙醇溶液浓度对不皂化物提取的影响，随着液料比和KOH-乙醇溶液浓度增加不皂化物质提取量增大，但达到一定值液料比和KOH-乙醇溶液浓度为（10:

1）和（2mol/L）时则不在升高。

4结论

本论文主要研究南瓜籽中提取不皂化物的最佳皂化条件，根据实验设计首先进行单因素实验，以不皂化物的收率为指标，考察不同皂化时间、皂化温度、液料比和KOH-乙醇溶液浓度这四个因素对南瓜籽中不皂化物质提取率的影响，确定各单因素试验的较优水平；在单因素试验的基础上，再选用响应面（RSM）法Box-Behnken试验设计，优化最佳皂化工艺条件。

（1）皂化时间的单因素试验结果表明，皂化时间较短时，南瓜籽组织中的结合态的活性物质还没有完全与KOH-乙醇溶液反应中，收率不高，但是随着皂化时间的加长，到1.5h，不皂化物的提取率显著的上升，并达到最高值。

但是超过1.5h收率开始缓慢下降，原因是随着皂化时间的加长，提取出的不皂化物容易在长时间皂化条件下发生包裹，影响了不皂化物的提出，最后确定皂化时间选择1.5h为宜。

（2）皂化温度的单因素试验结果表明，在皂化温度很低时，南瓜籽脂萃取物与KOH-乙醇溶液不能充分反应，甚至没有发生反应，所以提取出不皂化物含量少，但是随着皂化温度的升高，到70℃，不皂化物的含量显著的上升，并达到最高值。

但是超过70℃含量开始下降，最后确定皂化温度选择70℃为宜。

（3）液料比的单因素试验结果表明，从5：

1开始不皂化物质提取量开始升高，10:

1时达到最高值，之后随着液料比的增大，提取量逐渐减小，是因为当南瓜籽脂提取物与碱已经充分接触，继续增加液料比会降低溶液浓度，从而提取率降低，所以液料比选择10:

1为宜。

（4）KOH-乙醇溶液浓度的单因素试验结果表明，当KOH-乙醇浓度较低时，皂化反应不完全，因而提取率随着浓度的增大而增高，当浓度达到2mol/L时达到最高，之后再增大碱的浓度，提取率缓慢降低，因而确定KOH-乙醇溶液浓度为2mol/L为宜。

（5）响应面试验中各个因素P值的大小我们可以得出，影响南瓜籽中不皂化物提取量的因素主要次序为D>A>B>C，即KOH-乙醇溶液浓度>皂化时间>皂化温度>液料比。

最终确定在皂化时间为1.49h、皂化温度为69℃、液料比为10:

1和KOH-乙醇溶液浓度为2.06mol/L时，不皂化物的理论得率最高为1.37%，从而为不皂化物的分离纯化奠定基础，同时也为南瓜籽资源的开发利用提供一定的理论依据。

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