响应面法优化光合细菌R培养条件.docx
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响应面法优化光合细菌R培养条件
响应面法优化光合细菌培养条件
摘要:
文章首先用单因素法分别对光合细菌Rhodospirillum RubrumS1
的培养条件———温度、光照强度、接种量进行了考察,确定了最佳培养条件:
温度30℃,光照强度3000lx,接种量15%。
在此基础上,采用中心组合试验设计结合响应面分析法(Res
ponse Surface Methodology,RSM)对影响光合细菌
Rhodospirillum RubrumS1的发酵条件进行进一步优化。
结果表明,主要影响因素的最佳条件:
培养温度32.54℃,光照强度2995.85lx,接种量15.80%,光合细菌Rhodospirillum RubrumS1的类胡萝卜素产量为16.72mg/L,与理论值16.86mg/L相差0.83%。
因此,利用响应面分析法对光合细菌Rhodospirillum RubrumS1的培养条件进行优化合理可行。
关键词:
光合细菌Rhodospirillum RubrumS1;培养条件;响应面法
Optimization of Culture Conditions for Photosynthetic Bacteria
Rhodospirillum RubrumS1 by Response Surface Methodology
Abstract
:
In the paper
,
the single factor method is used to study the culture conditions of photosyn-
thetic bacteria
(
PSB
)
Rhodospirillum RubrumS1
,
including temperature
,
light intensity and inocula-
tion quantity.The optimal culture conditions are as follows
:
temperature of 30℃
,
light intensity of
3000lx and inoculation quantity of 15%.On the basis of the above conditions
,
Response Surface
Methodology
(
RSM
)
is adopted for further optimization of other factors that affect fermentation con-
ditions of PSB Rhodospirillum Rubrum S1.The results show that the optimal temperature is
32.54℃
,
light intensity is 2995.85lx and inoculation quantity is 15.80%.Besides
,
the output of
carotenoid is 16.72mg
/
L
,
which differs from the theoretical value 16.86mg
/
L by 0.83%.As a con-
sequence
,
RSM to optimize the culture conditions of PSB S1is reasonable and feasible.
Key words
:
photosynthetic bacteria Rhodospirillum RubrumS1
;
culture conditions
;
Response Surface
Methodology
收稿日期:
2013-02-23 *
通讯作者
作者简介:
潘艳(
1979-
),女,吉林长春人,博士,研究方向:
生物技术制药;
侯阿澧(
1977-
),男,副教授,研究方向:
多糖、蛋白质药物。
—
34
—
试验研究
2013
年第
8
期
总第
38
卷
中国调味品
CHINA CONDIMENT
光合细菌是地球上最古老、最原始的细菌类群之
一,富含丰富的类胡萝卜素等光合色素。
类胡萝卜素
作为全球生态系统中一大类色素,是自然界中十分重
要的色素之一。
据估计,每年天然产生的类胡萝卜素
达
1
亿吨
[
1
,
2
]
。
类胡萝卜素是重要的营养素来源
[
3
]
,
它作为一种功能性色素,被用于食品
[
4
]
和化妆品添加
剂
[
5
]
的同时,也受到医学界的广泛瞩目。
自
1956
年英
国人
Harmam
提出自由基学说
[
6
]
以后,抗氧化剂便成
为人们研究的热点。
类胡萝卜素在抗氧化介质模型中
的肿瘤防治机理显示出比酶更强的优势。
目前,光合
细菌
Rhodospirillum RubrumS1
培养条件对类胡萝
卜素产量的影响研究多限于单因素和正交设计,此设
计实验次数多且不准确。
本文在单因素试验的基础
上,采用响应面法对光合细菌
Rhodospirillum
RubrumS1
产类胡萝卜素的培养条件进行了优化,以
期提高光合细菌类胡萝卜素的产量,为深入研究和规
模化生产类胡萝卜素提供依据。
1
实验材料与仪器
1.1
实验菌株
光合细菌
Rhodospirillum RubrumS1
,日本关西
学院大学小山研提供。
1.2
培养基
柠檬酸为
3.5291g
/
L
,牛肉膏为
3.3190g
/
L
,
MgSO
4
为
0.5083g
/
L
,
FeSO
4
为
0.0194g
/
L
,
KH
2
PO
4
为
0.5g
和无菌水为
1L
。
1.3
实验仪器
LRH-300-GS
型人工气候箱
广东省医疗器械
厂;
721
型紫外分光光度计
上海光谱仪器有限公司;
MLS-3750
型高压自动灭菌锅
日本
SANYO
;超净
工作台
苏净集团安泰公司;
J6-Mi
型大容量冷冻离
心机
Beckman
厂家;
SBB
型沸水浴槽
一科仪器
厂;
THZ-82
型恒温振荡器
江苏省金坛市医疗器械
厂;
pHST-3F
型实验室
pH
计
上海雷磁;电热恒温
干燥箱
上海实验仪器厂;
ESJ200-4
型电子分析天平
沈阳龙腾电子有限公司。
2
实验方法
2.1
培养方法
按
10%
接种量将种子液接种于新鲜的液体培养
基中,在培养温度为
28℃
,光照强度为
4000lx
和厌
氧条件下培养
3
天。
2.2
菌体产量
在
Maria
等
[
7
]
的基础上加以改进。
菌液在
10000r
/
min
条件下离心
20min
,弃去上清液,菌体用
蒸馏水洗涤
2
次后再次离心。
所得菌体在
65℃
下烘
干至恒重。
2.3
类胡萝卜素测定方法
在王岁楼
[
8
]
的基础上加以改进。
菌体中加入浓度
为
5mL
,
3N
的盐酸,
28℃
下振荡
1.5h
后,沸水浴
4min
,迅速冷却,离心(
10000r
/
min
,
20min
)弃上清
液,沉淀用双蒸水洗涤
2
遍。
在所得菌体中加入
3mL
丙酮,
28℃
水浴振荡浸提
30min
,
10000r
/
min
冷冻离
心
20min
,取上清液。
适当稀释类胡萝卜素提取液,
于
480nm
处测定吸光值。
按以下公式计算类胡萝卜
素产量:
类胡萝卜素产量(
mg
/
L
)
=ADV
1
/
0.16V
2
。
式中:
A
为
480nm
处的吸光值;
D
为稀释倍数;
0.16
为类胡萝卜素消光系数;
V
1
为加入的提取剂体
积;
V
2
为用于提取色素的发酵液体积。
2.4
起始发酵培养条件的确定
2.4.1
温度的确定
本实验将培养温度分别设定
15
,
20
,
25
,
30
,
35
,
40℃
,培养条件见
2.1
。
实验时设置
3
个平行,测定类
胡萝卜素的平均含量,以类胡萝卜素产量为指标来确
定最佳培养温度。
2.4.2
光照强度
本实验将光照分别设定
1000
,
2000
,
3000
,
4000
,
5000lx
,培养条件见
2.1
。
实验时设置
3
个平行,测定
类胡萝卜素的平均含量,以类胡萝卜素产量为指标来
确定最佳培养温度。
2.4.3
接种量的确定
培养条件见
2.1
,只改变接种量。
分别在培养基
中接入
5%
,
10%
,
15%
,
20%
,
25%
种子液,实验时设
置
3
个平行,测定类胡萝卜素的平均含量,以类胡萝卜
素产量为指标来确定菌种最佳接种量。
2.4.4
中心组合优化培养基
采用响应面法在三因素三水平上对影响光合细菌
—
35
—
2013
年第
8
期
总第
38
卷
中国调味品
CHINA CONDIMENT
试验研究
Rhodospirillum RubrumS1
发酵的关键因子进行优
化,试验因子和水平见表
1
。
表
1
响应面分析因素与水平表
因素
水平
-1 0 1
培养温度(
Z
1
)(
℃
)
25 30 35
光照强度(
Z
2
)(
lx
)
2500 3000 3500
接种量(
Z
3
)(
%
)
10 15 20
3
结果与讨论
3.1
发酵培养条件的确定
3.1.1
培养温度对类胡萝卜素产生的影响
培养温度是工业微生物发酵过程中最重要的培养
条件。
在光合细菌
Rhodospirillum RubrumS1
发酵
过程中,温度是影响发酵很重要的因子。
不同培养温
度对光合细菌
Rhodospirillum RubrumS1
生长效果
的影响,见图
1
。
图
1
培养温度对类胡萝卜素产生的影响
由图
1
可知,当温度高于
15℃
时,随着温度的提
高,类胡萝卜素产量在逐渐增加;至
30℃
时,类胡萝卜
素产量达到最高值;但温度高于
30℃
时,光合细菌
Rhodospirillum RubrumS1
的类胡萝卜素产量开始
缓慢降低,确定最佳温度为
30℃
。
3.1.2
光照对类胡萝卜素产生的影响
光合细菌在黑暗条件下,色素合成能力很微弱;在
弱光下,则通过加大色素的合成以吸收较多的光能;而
光照强度超过极限值后,色素的合成及光合成膜的形
成受到抑制,使色素分解,类胡萝卜素产量反而有所下
降。
因此,光合细菌
Rhodospirillum RubrumS1
的类
胡萝卜素合成需要适当的光照强度。
光照强度对类胡
萝卜素的影响见图
2
。
图
2
光照强度对类胡萝卜素产生的影响
由图
2
可知,光合细菌在光照强度在
1000~
3000lx
范围内,其类胡萝卜素、菌体产量均随着光照
强度的增加而增加;
4000~5000lx
光照条件下,细胞
老化较快,易出现细胞碎片附壁现象。
因而,
3000lx
是光合细菌
Rhodospirillum RubrumS1
的适宜光照
强度。
3.1.3
接种量对类胡萝卜素产生的影响
将光合细菌
Rhodospirillum RubrumS1
接种液
体按
5%
,
10%
,
15%
,
20%
,
25%
接种量接种于光合细
菌培养基中,置于
30℃
,光照强度
3000lx
培养,定时
取样测定其生长情况。
接种量对类胡萝卜素的影响见
图
3
。
图
3
接种量对类胡萝卜素产生的影响
由图
3
可知,随着接种量的增加,光合细菌的生长
速度相应地增加。
然而,当接种量大于
15%
以后,增
加不明显,因此确定
15%
是最佳的接种量。
3.2
中心组合培养条件优化结果
在单因素结果的基础上,以
X
1
=
(
Z
1
-30
)/
5
,
X
2
=
(
Z
2
-3000
)/
500
,
X
3
=
(
Z
3
-15
)/
5
为自变量,以
类胡萝卜素产量
Y
为响应值,进行三因素三水平的响
应面分析试验,实验结果见表
2
。
—
36
—
试验研究
2013
年第
8
期
总第
38
卷
中国调味品
CHINA CONDIMENT表
2
响应面分析方案及实验结果
试验号
X
1
X
2
X
3
Y
1-1-1 0 14.92
2-1 1 0 15.84
3 1-1 0 16.81
4 1 1 0 15.98
5 0-1-1 15.69
6 0-1 1 15.16
7 0 1-1 15.49
8 0 1 1 16.50
9-1 0-1 15.11
10 1 0-1 15.79
11-1 0 1 15.67
12 1 0 1 16.33
13 0 0 0 16.73
14 0 0 0 16.80
15 0 0 0 16.69
表
2
中试验点
1~12
为析因试验,
13~15
为中心
试验。
15
个试验点分为析因点和零点,其中析因点为
自变量取值在
X
1
,
X
2
,
X
3
所构成的三维顶点。
零点为
区域的中心点,零点试验重复
3
次,用以估计试验误
差。
对表
2
中数据进行分析,得到响应值对
3
个自变
量的多项二次回归方程为
Y=16.73983+
0.420938X
1
+0.152625X
2
+0.197562X
3
-
0.416604X
1
X
1
-0.4365X
1
X
2
-0.005875X
1
X
3
-
0.435479X
2
X
2
+0.3865X
2
X
3
-0.595854X
3
X
3
。
式中:
Y
为响应值类胡萝卜素产量,
X
1
,
X
2
和
X
3
分别为温度、光照强度和接种量的编码值。
模型的预
测值和真实值高度相关,相关系数为
R=95.68%
。
这
表明了拟合的二次响应面方程很好地解释了中心组合
实验。
方程中的各个因子对响应值的影响关系可以通
过
t-
检验进行研究。
回归模型的系数显著性检验的结果见表
3
。
模型系
数检验结果表明:
回归方程的一次项
X
2
对模型的影响非
常显著,
X
2
对模型影响较显著。
同时
X
1
X
1
,
X
2
X
2
项对模
型也有极高的显著性,这说明模型的响应值变化相对复
杂,不是简单的线性关系,曲面效应显著。
表
3
回归分析结果
方差来源
自由度
DF
平方和
SS
均方
MS
F
值
F
Pr>F
X
1
1 1.4175 1.4175 28.0526 0.0032
X
2
1 0.1864 0.1864 3.6880 0.1129
X
3
1 0.3122 0.3122 6.1794 0.0554
X
1
X
1
1 0.6408 0.6408 12.6821 0.0162
X
1
X
2
1 0.7621 0.7621 15.0826 0.0116
X
1
X
3
1 0.0001 0.0001 0.0027 0.9603
X
2
X
2
1 0.7002 0.7002 13.8574 0.0137
续
表
方差来源
自由度
DF
平方和
SS
均方
MS
F
值
F
Pr>F
X
2
X
3
1 0.5975 0.5975 11.8252 0.0185
X
3
X
3
1 1.3109 1.3109 25.9433 0.0038
回归
9 5.5898 0.6211 12.2914 0.0065
线性
3 1.9161 0.6387 12.6400 0.0090
平方
3 2.3139 0.7713 15.2641 0.0060
交互
3 1.3598 0.4533 8.9702 0.0187
通过多元回归方程所做的响应曲面图及其等高线
图见图
4
。
所拟合的响应曲面和等高线图能比较直观
地反应各因素和各因素间的交互作用。
图
4
(
a
)(
b
)(
c
))响应面及等高线图
由图
4
可知,
3
个响应曲面均为开口向下的凸形曲
面,同时等高线最小椭圆的中心在所选的
-1~1
范围
内,说明响应值(类胡萝卜素产量)在
3
个因子设计的范
围内存在最大值,说明这
3
个因子在此范围内的优化是
合理可行的。
图
4
(
a
)中的等高线为椭圆形状,同时低编
码值的
X
1
和高编码值的
X
1
时,响应值
Y
随着
X
2
的变
化,变化趋势不同;同时也表现在
X
2
变化时,
X
1
在高低
不同的取值时,
Y
值的变化趋势也不同,说明
X
1
(温度)
和
X
2
(光照强度)的交互效应显著,这与方差分析的结
果相吻合。
图
4
(
c
)中表现了和图
4
(
a
)中同样的效应,
X
2
在低水平和高水平时,随着
X
3
的增大,
Y
值表现出不同
的趋势,说明
X
2
(光照强度)和
X
3
(接种量)的交互效应
显著,这也与方差分析的结果相吻合。
利用
SAS
工具箱对回归方程进行一阶求偏导,得到
响应值(
Y
)处于最大值时的
X
1
,
X
2
,
X
3
的编码值分别为
X
1
=0.5084
,
X
2
=-0.0083
,
X
3
=0.1606
,即最佳提取工艺
条件:
培养温度为
32℃
,光照强度为
2995.85 1x
,接种量
为
15.8%
,此时预测值为
16.86mg
/
L
。
3.3
验证实验
为了检测模型和优化结果的准确性,配制分析得
到的最优条件进行发酵实验,
3
次平行验证的平均类
胡萝卜素产量为
16.72mg
/
L
,理论值为
16.86mg
/
L
,
与理论值相差
0.83%
,在模型允许的误(下转第
42
页)
—
37
—
2013
年第
8
期
总第
38
卷
中国调味品
CHINA CONDIMENT
试验研究
由表
3
可知,含防腐剂的对照蚝油样品防霉效果
最好,霉菌数在保存期内逐渐下降;去除防腐剂后,其
防霉效果明显降低,
3
天就出现长霉,
7
天则进一步长
霉、变稀。
使用优化条件制备的蚝油,其抑菌能力明显
优于去除防腐剂的对照样品,霉菌数在保存期内没有
发生增加,产品感官上也没有出现长霉、变稀等霉变现
象,说明样品有较好的抑菌能力。
结果表明:
利用食
盐、
pH
和乙醇的协同抑菌作用可明显提高蚝油的防
霉效果。
3
结论
通过分离纯化及返接验证试验,得到了引起蚝油
霉变的两株霉菌。
食盐和乙醇对两株霉菌的抑菌作用随着其含量的
增加而增强,降低
pH
对霉菌也有一定的抑制效果,但
单一因素的抑菌效果均不理想。
13%
的盐含量只能在
一定程度上抑制霉菌的生长速度,并不能完全抑制或
杀死微生物;单独依靠调节
pH
在蚝油中发挥的抑菌
作用很弱;
5%
的乙醇对抑制霉菌的生长速度有一定的
效果,
1%
的乙醇几乎没有抑菌作用。
三种因素综合对目标菌有较好的抑制作用,正交
试验结果表明三种因素的抑菌强弱顺序为食盐
>
乙醇
>pH
;最优组合为食盐含量
13%
,
pH 4.5
,乙醇含量
3%
,此条件下蚝油有较好的防霉效果。
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,蚝油[
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.
(上接第
37
页)差范围之内。
说明模型能较好地预测实
际发酵情况,得到的结果可以在实践中应用。
4
结论
本文