响应面法优化光合细菌R培养条件.docx

1、响应面法优化光合细菌R培养条件响应面法优化光合细菌培养条件摘要：文章首先用单因素法分别对光合细菌 的培养条件温度、光照强度、接种量进行了考察，确定了最佳培养条件：温度，光照强度，接种量。在此基础上，采用中心组合试验设计结合响应面分析法（，）对影响光合细菌 的发酵条件进行进一步优化。结果表明，主要影响因素的最佳条件：培养温度，光照强度，接种量，光合细菌 的类胡萝卜素产量为，与理论值 相差。因此，利用响应面分析法对光合细菌 的培养条件进行优化合理可行。关键词：光合细菌 ；培养条件；响应面法 ：，（） ，： ，（），：；收稿日期：通讯作者作者简介：潘艳（），女，吉林长春人，博士，研究方向：生物技术制

2、药；侯阿澧（），男，副教授，研究方向：多糖、蛋白质药物。试验研究年第期总第卷中 国 调 味 品光合细菌是地球上最古老、最原始的细菌类群之一，富含丰富的类胡萝卜素等光合色素。类胡萝卜素作为全球生态系统中一大类色素，是自然界中十分重要的色素之一。据估计，每年天然产生的类胡萝卜素达亿吨，。类胡萝卜素是重要的营养素来源，它作为一种功能性色素，被用于食品和化妆品添加剂的同时，也受到医学界的广泛瞩目。自年英国人提 出自由基学说以后，抗氧化剂便成为人们研究的热点。类胡萝卜素在抗氧化介质模型中的肿瘤防治机理显示出比酶更强的优势。目前，光合细菌 培养条件对类胡萝卜素产量的影响研究多限于单因素和正交设计，此设计实

3、验次数多且不准确。本文在单因素试验的基础上，采 用 响 应 面 法 对 光 合 细 菌 产类胡萝卜素的培养条件进行了优化，以期提高光合细菌类胡萝卜素的产量，为深入研究和规模化生产类胡萝卜素提供依据。实验材料与仪器实验菌株光合细菌 ，日本关西学院大学小山研提供。培养基柠 檬 酸 为，牛 肉 膏 为，为，为，为和无菌水为。实验仪器型人工气候箱广东省医疗器械厂；型紫外分光光度计上海光谱仪器有限公司；型高压自动灭菌锅日本；超净工作台苏净集团安泰公司；型大容量冷冻离心机厂家；型沸水浴槽一科仪器厂；型恒温振荡器江苏省金坛市医疗器械厂；型实验室计上海雷磁；电热恒温干燥箱上海实验仪器厂；型电子分析天平沈阳龙腾

4、电子有限公司。实验方法培养方法按接种量将种子液接种于新鲜的液体培养基中，在培养温度为 ，光照强度为和厌氧条件下培养天。菌体产量在等的 基 础 上 加 以 改 进。 菌 液 在条件下离心，弃去上清液，菌体用蒸馏水洗涤次后再次离心。所得菌体在 下烘干至恒重。类胡萝卜素测定方法在王岁楼的基础上加以改进。菌体中加入浓度为，的盐酸， 下振荡后，沸水浴，迅速冷却，离心（，）弃上清液，沉淀用双蒸水洗涤遍。在所得菌体中加入丙酮，水浴振荡浸提，冷冻离心，取上清液。适当稀释类胡萝卜素提取液，于处测定吸光值。按以下公式计算类胡萝卜素产量：类胡萝卜素产量（）。式中：为处的吸光值；为稀释倍数；为类胡萝卜素消光系数；为加

5、入的提取剂体积；为用于提取色素的发酵液体积。起始发酵培养条件的确定温度的确定本实验将培养温度分别设定，培养条件见。实验时设置个平行，测定类胡萝卜素的平均含量，以类胡萝卜素产量为指标来确定最佳培养温度。光照强度本实验将光照分别设定，培养条件见。实验时设置个平行，测定类胡萝卜素的平均含量，以类胡萝卜素产量为指标来确定最佳培养温度。接种量的确定培养条件见，只改变接种量。分别在培养基中接入，种子液，实验时设置个平行，测定类胡萝卜素的平均含量，以类胡萝卜素产量为指标来确定菌种最佳接种量。中心组合优化培养基采用响应面法在三因素三水平上对影响光合细菌年第期总第卷中 国 调 味 品试验研究 发酵的关键因子进行

6、优化，试验因子和水平见表。表响应面分析因素与水平表因素水平 培养温度（）（） 光照强度（）（） 接种量（）（） 结果与讨论发酵培养条件的确定培养温度对类胡萝卜素产生的影响培养温度是工业微生物发酵过程中最重要的培养条件。在光合细菌 发酵过程中，温度是影响发酵很重要的因子。不同培养温度对光合细菌 生长效果的影响，见图。图培养温度对类胡萝卜素产生的影响由图可知，当温度高于 时，随着温度的提高，类胡萝卜素产量在逐渐增加；至时，类胡萝卜素产量达到最高值；但温度高于 时，光合细菌 的类胡萝卜素产量开始缓慢降低，确定最佳温度为。光照对类胡萝卜素产生的影响光合细菌在黑暗条件下，色素合成能力很微弱；在弱光下，则

7、通过加大色素的合成以吸收较多的光能；而光照强度超过极限值后，色素的合成及光合成膜的形成受到抑制，使色素分解，类胡萝卜素产量反而有所下降。因此，光合细菌 的类胡萝卜素合成需要适当的光照强度。光照强度对类胡萝卜素的影响见图。图光照强度对类胡萝卜素产生的影响由 图可 知，光 合 细 菌 在 光 照 强 度 在范围内，其类胡萝卜素、菌体产量均随着光照强度的增加而增加；光照条件下，细胞老化较快，易出现细胞碎片附壁现象。因而，是光合细菌 的适宜光照强度。接种量对类胡萝卜素产生的影响将光合细菌 接种液体按，接种量接种于光合细菌培养基中，置于，光照强度培养，定时取样测定其生长情况。接种量对类胡萝卜素的影响见图

8、。图接种量对类胡萝卜素产生的影响由图可知，随着接种量的增加，光合细菌的生长速度相应地增加。然而，当接种量大于以后，增加不明显，因此确定是最佳的接种量。中心组合培养条件优化结果在单因素结果的基础上，以（），（），（）为自变量，以类胡萝卜素产量为响应值，进行三因素三水平的响应面分析试验，实验结果见表。试验研究年第期总第卷中 国 调 味 品表响应面分析方案及实验结果试验号 表中试验点为析因试验，为中心试验。个试验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在，所构成的三维顶点。零点为区域的中心点，零点试验重复次，用以估计试验误差。对表中数据进行分析，得到响应值对个自变量 的 多 项 二 次 回 归 方

9、 程 为 。式中：为响应值类胡萝卜素产量，和分别为温度、光照强度和接种量的编码值。模型的预测值和真实值高度相关，相关系数为。这表明了拟合的二次响应面方程很好地解释了中心组合实验。方程中的各个因子对响应值的影响关系可以通过检验进行研究。回归模型的系数显著性检验的结果见表。模型系数检验结果表明：回归方程的一次项对模型的影响非常显著，对模型影响较显著。同时，项对模型也有极高的显著性，这说明模型的响应值变化相对复杂，不是简单的线性关系，曲面效应显著。表回归分析结果方差来源自由度平方和均方值 续表方差来源自由度平方和均方值 回归 线性 平方 交互 通过多元回归方程所做的响应曲面图及其等高线图见图。所拟合

10、的响应曲面和等高线图能比较直观地反应各因素和各因素间的交互作用。图（）（）（）响应面及等高线图由图可知，个响应曲面均为开口向下的凸形曲面，同时等高线最小椭圆的中心在所选的范围内，说明响应值（类胡萝卜素产量）在个因子设计的范围内存在最大值，说明这个因子在此范围内的优化是合理可行的。图（）中的等高线为椭圆形状，同时低编码值的和高编码值的时，响应值随着的变化，变化趋势不同；同时也表现在变化时，在高低不同的取值时，值的变化趋势也不同，说明（温度）和（光照强度）的交互效应显著，这与方差分析的结果相吻合。图（）中表现了和图（）中同样的效应，在低水平和高水平时，随着的增大，值表现出不同的趋势，说明（光照强度

11、）和（接种量）的交互效应显著，这也与方差分析的结果相吻合。利用工具箱对回归方程进行一阶求偏导，得到响应值（）处于最大值时的，的编码值分别为，即最佳提取工艺条件：培养温度为，光照强度为，接种量为，此时预测值为。验证实验为了检测模型和优化结果的准确性，配制分析得到的最优条件进行发酵实验，次平行验证的平均类胡萝卜素产量为，理论值为，与理论值相差，在模型允许的误 （下转第页）年第期总第卷中 国 调 味 品试验研究由表可知，含防腐剂的对照蚝油样品防霉效果最好，霉菌数在保存期内逐渐下降；去除防腐剂后，其防霉效果明显降低，天就出现长霉，天则进一步长霉、变稀。使用优化条件制备的蚝油，其抑菌能力明显优于去除防腐

12、剂的对照样品，霉菌数在保存期内没有发生增加，产品感官上也没有出现长霉、变稀等霉变现象，说明样品有较好的抑菌能力。结果表明：利用食盐、和乙醇的协同抑菌作用可明显提高蚝油的防霉效果。结论通过分离纯化及返接验证试验，得到了引起蚝油霉变的两株霉菌。食盐和乙醇对两株霉菌的抑菌作用随着其含量的增加而增强，降低对霉菌也有一定的抑制效果，但单一因素的抑菌效果均不理想。的盐含量只能在一定程度上抑制霉菌的生长速度，并不能完全抑制或杀死微生物；单独依靠调节在蚝油中发挥的抑菌作用很弱；的乙醇对抑制霉菌的生长速度有一定的效果，的乙醇几乎没有抑菌作用。三种因素综合对目标菌有较好的抑制作用，正交试验结果表明三种因素的抑菌强

13、弱顺序为食盐乙醇；最优组合为食盐含量，乙醇含量，此条件下蚝油有较好的防霉效果。参考文献：吴健勋，黄建蓉食 品 防 腐 剂 对 菌 落 总 数 检 测 影 响 的 研究食品科技，（）：丁培峰纳他霉素和茶多酚在酱油中的应用研究中国调味品，（）：张日生，晏会英霉克在调味品蚝油中的防腐应用食品工业科技，（）：任 艳艳，张水华，李沛，等酵母味素在蚝油生产中 的 应用中国调味品，（）：王向阳，姜丽佳真空包装腌萝卜干中腐败微生物的抑制研究中国调味品，（）：李德新，郭凤根，王仕玉，等种抑菌剂对蛇足石杉内生真菌黑曲 霉 的 抑 制 效 果 研 究 安 徽 农 业 科 学，（）：，熊家娟药品中防腐剂的抗菌效力测定与评价中国药事，（）：李凤琴，李玉伟，王晔茹，等食品用防腐剂防腐效果的测定和评价程序研究卫生研究，（）：，蚝油（上接第页）差范围之内。说明模型能较好地预测实际发酵情况，得到的结果可以在实践中应用。结论本文