布氏杆菌病的检测.docx

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布氏杆菌病的检测

布氏杆菌病的检测

牛布氏杆菌病的检测

1传统的检测方法

1.1细菌学检测

布氏杆菌需在实验室里进行。

初步分离时,须在5%~10%二氧化碳环境中方能生长,而且标本中必须存在大量活菌才能分离到该菌,培养细菌的周期长,需要花费大量的时间才能得出结果。

因此在布病的检测中已经逐渐被淘汰。

1.2血清学检测

该法同样要在实验室才能操作,虽然凝集试验（agglutinationtest）操作简便,且所需时间短,但由于IgM在pH为中性或弱酸性时凝集最活跃,所以凝集试验会因为抗体交叉反应而易出现假阳性反应。

判断结果有很大的误差,在2000年被OIE取消了其作为布氏杆菌病的检测方法[2]。

沉淀试验（Precipitationtests）是可溶性抗原与相应抗体结合,在适量电解质存在下,形成肉眼可见的白色沉淀,由于是人为的观察结果,因此存在很大的主观性,有时会因出现交叉反应而

误判结果,且有很大的局限性,不是一种理想的检测布病的方法。

补体结合试验（complement

使其水解、氧化或还原成另外一种带色物质。

由于在一定条件下,酶的降解底物和呈现色泽是成正比的,因此,可以应用酶测定仪进行测定,从而计算出参与反应的抗原和抗体的种类和含量。

自从1971年Engvall等和VanWeemen等分别报道酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunoassay

assay,ELISA）以来,ELISA得到了很大的发展,到目前其类型也很多,在此对常用的两种介绍如下。

2.1间接酶联免疫吸附试验__

1976年Carlsson第一次建立间接ELISA（indirectenzymelinkedimmunoassayassay,IELISA）法检测人布氏杆菌病,之后在多种动物上用该法检测布氏杆菌病。

1995年F.Bianciflori等用间接ELISA从羊奶中检测布氏杆菌病,其特异性和敏感性都特别高;1996年F.A.Uza等人用抗IgG1的单克隆酶轭合物间接ELISA诊断牛布氏杆菌病,检测了三组血清,第一组是没有注射疫苗的阴性血清,第二组是注射了疫苗的阴性血清,第三组是来自阳性牛的血清。

间接ELISA检测的特异性前两组分别是99.2%和99.6%,间接ELISA检测阳性血清的敏感性是99.5%;得出IELISA的敏感性和特异性都很高;1998年V.R.Vanzini等评价了间接ELISA在阿根廷奶牛中用奶和血清检测诊断布氏杆菌病的效果,在来自相同奶牛的奶和血清中间接ELISA检测的特异性和敏感性分别为:

奶样敏感性为99.6%特异性为99.1%;血清的敏感性为99.6%特异性98.6%。

奶和血清的敏感性相同而奶的特异性比血清的高[3]。

说明可以在检测奶牛布氏杆菌病的时候可以用奶代替血样,排除了采血带来的麻烦,大大地提高了检测效率。

2004赵云玲等人分别通过琥红凝集试验（RBPT）、试管凝集试验（SAT）、和酶联吸附（ELISA）试验检测某牛厂送检202份血清和129份乳清,所得的实验结果说明乳清完全可以代替血清用于牛布氏杆菌病的血清学检测;2001年V.R.Vanzini[4]等人比较了在大量奶样中用间接ELISA和用乳汁环状试验检

测流产性布氏杆菌抗体的差异,最后得出间接ELISA的敏感性（98.1%）高于乳汁环状试验（72.2%）,而间接ELISA的特异性（88.1%）低于乳汁环状试验（90.5%）,间接ELISA的敏感性比乳汁环状试验的高出很多,特异性和乳汁环状试验的差不多。

2004年C.Saegerman[5]等人评价了用单克隆抗体和蛋白G作为过氧化轭合物的三种血清间接ELISA诊断牛布氏杆菌病的效果,得出间接ELISA的敏感性和特异性都非常的高。

2004年刘耀兴等人对牛布氏杆菌病间接ELISA与血清试管凝集试验（SAT）、琥红平板凝集试验（RBPT）、缓冲平板凝集试验（BPAT）进行了临床运用比较。

结果表明间接ELISA和其他三种检测方法阳性和阴性符合率为100%,但间接ELISA法较SAT、RBPT、BPAT方法先进、快速、结果客观可靠。

根据使用的不同抗原、抗球蛋白酶结合物和底物或色原体产生了多种间接ELISA。

有几种商用间接ELISA在广泛的田间试验中得到验证并推广使用。

虽然间接ELISA是高度敏感的方法,但是它不能把S19疫苗免疫产生的抗体与致病株感染引起的抗体区别开来。

因此,更多地把间接ELISA作为普查检测方法而不是作为免疫家畜的检测方法。

2.2竞争酶联免疫吸附试验

传统的血清学检测方法和间接ELISA方法无法鉴别疫苗免疫产生的抗体和致病株感染引起的抗体。

为了把这两种抗体鉴别开来出现了竞争酶联免疫吸附试验（competitiveenzymelinkedimmunoassayassay,CELISA）。

1995年K.H.Nielsen等[3]用脂多糖作为抗原固定在聚苯乙烯基质上和O-型多糖（OPS）表位特异性单克隆抗体（M84）作为抗体,羊抗鼠IgG抗体酶轭合物作为检测抗体,用这种调整的CELISA检测注射S19疫苗牛的抗体和感染牛布氏杆菌牛的抗体。

检测了1446个来自未感染布氏杆菌群的血清,其特异性为99.7%;检测了636份来自感染布氏杆菌群的血清,其敏感性为100%。

这种方法的主要原理是疫苗免疫引起的低亲合力的抗体是由于免疫消除引起的短暂暴露抗原所引起的,而持续抗原田间感染中,抗体的亲合力是不断升高的。

这样竞争性抗体就能有选择地抑制结合疫苗所产生的抗体而不是野毒株所产生的抗体。

因为CELISA可以消除因接种疫苗而产生的残余抗体所引起的大部分反应,CELISA对牛布氏杆

菌OPS表位特异性单克隆抗体有很高的特异性,所以单克隆抗体的选择及其独有的特异性和亲和力对CELISA法的诊断有明显的影响。

酶联免疫吸附试验（ELISA）具有很强的敏感性和特异性,它既可检测IgG和IgM,又可检测IgA类抗体。

CELISA法还适用于鉴别自然感染与人工免疫病例。

但目前尚无公认的诊断标准。

它和平板反应法相比,二者的特异性都很高,识别阳性和阴性血清能力几乎为100%,但ELISA法的敏感性远远高出平板反应法,研究证明一般高出3~4倍。

3分子生物学检测方法

3.1PCR法

自从1978年以来许多检测布氏杆菌的基础PCR得到了发展,最早检测布氏杆菌的基础PCR是针对布氏杆菌上高度保守的单个基因（如BCSP31和16SrRNA基因）而设计的。

主要是用于鉴定布氏杆菌种的类型,1990年Fekete第一次报道了PCR基础诊断方法,这种方法扩增了635bp的编码43-KDS19牛布氏杆菌外膜蛋白序列,他们都能够证明这种方法对布氏杆菌的特异性,也可以应用于所有的物种和亚种,其敏感性特别好（不少于100种细菌）。

然而,由于所有权的原因引物和靶序列没有发表,但他们的成功很大程度上鼓舞了人们进一步用PCR对布氏杆菌病的检测。

接着被探索的基因靶子是16SSrRNA,1992年HermanandDeRidde根据流产性布氏杆菌16S系列设计一对引物,成功地扩增了从牛布氏杆菌和其他布氏杆菌种中预计的800bp的序列,证明了这些序列具有高度的保守性,并且这种检测可以延伸到全基因。

1992年Baily根据编码BCSP31的基因建立了一种新的PCR,这种PCR分析法设计了专一的一对低聚核甙酸引物,扩增了223bp的产物。

并且证明了对于牛布氏杆菌和羊布氏杆菌的敏感性和特异性都非常的高[6]。

2002年E.Navarro等[7]用PCR扩增了人布氏杆菌的三个不同的基因,这三个基因分别是编码牛布氏杆菌抗原31kDa的基因、牛布氏杆菌16SrRNA序列和编码外膜蛋白的基因。

它们对检测提纯的布氏杆菌DNA显示出不同的敏感性（8fg~20pg）。

在中国也有学者对布氏杆菌的PCR检测方法有所研究,1999年金红等[8]建立了IS6501锚定PCR法,这种方法可用于鉴定布氏杆菌并区分不同毒株和生物型,最具有意义的是可鉴别野毒株与疫苗株;2003年王胜昌[9]等根据编码31kDa布氏杆菌蛋白的基因（BSCP31）,设计两对引物。

对布氏杆菌R型（粗糙型）抗原及S型（光滑型）抗原、大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌分别采用两种提取、纯化DNA的方法,并以纯化的各细菌DNA为摸板,分别进行内、外引物PCR反应及套式PCR反应,反应时以灭菌超纯水作为空白对照。

结果显示:

进行内、外引物PCR反应和套式PCR反应时,布氏杆菌R型及S型均出现预期的扩增带594bp、460bp及

460bp,且套式扩增后条带亮度明显增强,而作为验征PCR特异性或对照的大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、螺旋杆菌、绿腺杆菌、灭菌超纯水均无扩增带。

验证敏感性时用外引物对布氏杆菌R型、S型DNA进行扩增后,最低可检测到1pg的布氏杆菌DNA。

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4展望

布氏杆菌病是一种人畜共患疾病,在全世界许多国家都有分布,不论它在哪个国家暴发都会给该国带来巨大的经济损失,甚至造成人员的死亡,因此它在公共卫生上有很重要的意义。

目前对该病的治疗没有特效药,因此要加强对该病的检测和预防,由于传统的检测方法有很多的缺点和局限性,不能在全世界范围内消灭布氏杆菌病。

近年来随着分子生物学的不断发展和各项技术的广泛应用,为细菌分类鉴定提供了一些有效的新方法,使细菌分类鉴定工作从一般表型特征鉴定深化为遗传特征的鉴定,从一般形态、生理生化、血清学试验深入到细胞分子学水平。

可以在基因水平上对布氏杆菌病进行检测,提高了检测的准确性和速度。

同时基因疫苗也在研制当中,很快将运用于临床,为防制布氏杆菌病提供了有力的保障。