色谱峰色谱柱及参数.docx
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色谱峰色谱柱及参数
死时间(deadtime,t0)--不保留组分的保留时间。
即流动相(溶剂)通过色谱柱的时间。
在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
死体积(deadvolume,V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。
它包括4部分:
进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被流动相占据,Vm)、柱出口管路体积、检测器流动池体积。
其中只有Vm参与色谱平衡过程,其它3部分只起峰扩展作用。
为防止峰扩展,这3部分体积应尽量减小。
V0=F×t0(F为流速)
梯度方法的建立:
Rs:
分离度,表示两峰分离程度的物理量。
k:
容量因子,表示某溶质在固定相和流动相中物质的量的比,在等度洗脱中。
一种物质的k值是恒定不变的。
上面两试针对的是梯度洗脱,
表示的平均容量因子。
a:
分离因子,两个溶质的容量因子的比。
通常k大的作为分子。
表示两物质分离能力的大小。
N:
理论塔板数,表示柱子的分离能力,也就是柱效。
:
梯度时间;F:
流速;
:
死体积;
:
梯度变化范围。
常见问题和维护:
整个液相系统最值得关注的常数:
压力
除体系受到污染之外,几乎所有柱前的问题都能在压力变化上表现出来。
压力来源:
泵上的压力传感器
最常见的问题:
压力小(几乎为零):
说明没有流动相流过柱子。
可能原因:
柱前漏夜
流速设为0了
流动相干了
吸滤头没有放流动相液面之下
流路中有大段气泡
处理方法:
漏液:
从泵的出口到柱子的前端接口(柱后漏液几乎不会影响压力值)顺次检查。
泵上有自己的漏液传感器。
检测到漏液。
会停止工作并蜂鸣,变红。
同时显示错误信息:
ERROR:
LEAKDETECTED。
发现漏液点,先停泵,重新接好。
将漏液擦干。
有的漏液不明显,这时压力的也不会太小,检查时要注意,可用手仔细摸各个接口,感觉是否湿冷。
流路中有大段气泡:
通过大流速(如5ml/min)冲洗可以去除泵体内气泡。
也就是常说的PURGE。
按下泵的面板上的purge键即可。
每次PURGE的时间和流速可以在面板上设定。
通常不改。
初始值应该是5ml/min,3min。
但有时候泵体内空气太多,purge都不可以,或者很难抽上流动相,这是可以在purge的同时,用注射器,在泵的废液出口处抽。
直到没有气泡。
关于偶尔出现的气泡,不用太过在意,因为:
1.有脱气机在。
2.在purge时,由于流速太大,难免会出现气泡。
尤其是在purge阀开超过180度,废液出口处出现气泡就跟平常了。
3.只要气泡不在泵腔内堆积,就几乎不会影响到分析结果。
只要出了泵口,在高压下会
被压缩的很小。
不影响流路的延续性。
所以,只要观察压力变化,如果压力没有异常波动,就行。
在泵体内有气泡堆积时,压力波动会变大。
什么样的波动算正常,需要大家注意观察。
根究经验,在以恒定流速,梯度不变时,面板上以MP为单位的显示值应该几乎不变。
频繁出现的气泡会影响到流路的延续性,应该注意。
吸滤头堵,管路脏(通常是水相)有可能带来频繁出现的气泡。
可以先A,B的溶剂瓶调换一下。
PURGE三五次。
后换回来,再PURGE两次。
清洗一下管路。
压力过大:
说明流路堵了
逐段排查,先从柱(预柱)前接口(因为柱子最易堵)断开,以一定流速走:
压力正常,说明是柱子及其后的某一段堵了(通常是柱子)。
换柱子(或预柱)。
压力还高:
说明是柱前某段堵了。
这时再将进样器出口(接柱子)的peek管接头拧下:
压力正常:
说明是这段peek管堵了。
换peek管。
压力还高:
说明是进样器之前的部分堵了。
通常是进样器六通阀堵了。
反冲或清洗流通阀。
其它部分依次类推。
压力波动大:
说明流路中的液流不平稳,这时色谱图通常保留时间不稳定,峰型也不好。
得到的线性,重复性也不会好。
可能原因:
泵体内有气泡,泵头单向阀坏。
先确认是哪一台泵有问题。
先走100%A相。
看是否压力还是波动大,还大则说明A泵有问题。
压力正常则说明A泵正常。
再走100%的B相,过程如上。
确认好泵之后,先purge一下,以驱赶气泡。
Purge两次后,还是压力波动大,这有可能单向阀坏了,需要清洗或更换。
Ctc自动进样器的常用维护操作(实验室现场操作):
换针:
调针位:
调针位:
设定洗针体积:
一些小概念:
PEEK:
聚醚醚酮
色谱管道,外径多为1/16inch,1inch=2.54cm,1/16in=2.54cm,内径大小以颜色标准,红色(我们用的)最小,为0.13mm(应该是国际统一标准)
PEEK接头手紧即可
不锈钢接头要用工具紧
接头分一体的和分为主体和压紧环两部分的。
后者在拧紧的过程中,不易带动管道扭曲变形。
不锈钢的压紧环是一次性的
单位换算:
1MPa=10bar=7500.6torr=14.5psi
Psi:
poundpersquareinch(psi)
Torr:
托里彻利,标准大气压的1/760。
也就是mmHg(毫米汞柱)
其它问题:
残留大:
很可能是洗针过程有问题,注意观洗针时有没有抽上液体,抽上来的液体是否有很多气泡。
出现过由于转子磨损,洗针液不能顺畅流出进样口。
造成洗针不充分。
清洗或更换转子。
也可能进样过程有问题,注意观察进样针活塞是否推到底。
可能由于流通阀堵塞,造成压力大,进样针没法推到底。
重现性不好:
内标波动大,可能喷雾针脏了,使得喷雾不均匀。
可能是液相方法没有开发好。
峰型差,峰太宽都有可能造成面积不重复(不会差别太大)。
注意观察重现性不好的那几针,是否峰型比较特殊,保留时间也有较大变化,如果是,很有可能是由于pump里进了气泡,造成流速不稳,这点可以从压力变化得到确认,但是好像没法记录压力曲线。
质谱检测器的色谱图:
chromatogram,强度和时间的图。
等同于紫外检测的色谱图。
质谱检测器的光谱图:
spectrum,某一时间点(段时间内平均)的强度相对质荷比的图
下图上半为一色谱图,下半部为图是灰色方块(2.5min左右)内,平均强度相对质荷比的光谱图。
类似于紫外中的全波长图。
分辨率:
unit分辨率定义为半峰宽为0.7。
其意义如下:
=
W
W=1.70
=0.7则W=0.7*1.70=1.19
差不多刚好实现单位质荷比的分离
线性范围:
信号强度与样品浓度的关系可用如下关系式表示:
R=ARCX。
R为信号强度大小,AR为响应因子。
C为样品浓度,X为指数。
X=1,表示在线性范围之内,考虑到实验误差等因素。
一般只要X在0.98-1.92之间,就认为还在线性范围之内。
线性范围是一个浓度范围,下限比较难测。
通常就以最小检测量或最小检测浓度作为线性范围的下限。
检测器的线性范围