蛋白质组分析.docx

蛋白质组分析.docx

《蛋白质组分析.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质组分析.docx（17页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

蛋白质组分析蛋白质组分析蛋白质组分析蛋白质组（proteome）源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，其定义为proteinsexpressedbyagenome，即一个基因组表达的全部蛋白质。

目前认为蛋白质组的内涵是一个细胞、一类组织或一种生物的基因组所表达的全部蛋白质。

蛋白质组学（proteomics）是研究蛋白质组的一门新兴学科，旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式。

蛋白质化学着重于单一蛋白质结构、功能的研究，例如某一种蛋白质或蛋白质亚基的全序列分析，三维立体结构的确定，这样的结构如何执行功能、在生理上所扮演的角色，以及代谢的生化机制等。

蛋白质组学则是研究多种蛋白质组成的复杂系統。

Proteomics的字尾“-omics”的意思是“组学”，代表对生物、生命体系研究工作方式的重新定义，也就是说，蛋白质组学是对基因组所表达的整套蛋白质的分析，其研究对象是多蛋白质混合物的“系统”行为，而不是“单一组成”的行为。

它通过对一个大系统中包含的所有蛋白质进行分离、鉴定、表征和定量，提供关于该系统准确和全面的数据和信息。

蛋白质组与基因组通常，一个细胞中表达两类基因：

必须功能蛋白质的基因；行使细胞专一性功能蛋白质的基因。

因此，一种生物有一个基因组，但有许多蛋白质组。

因此，蛋白质组与基因组在内涵上有很大的不同，主要表现在以下四个方面：

（1）蛋白质组具有多样性图11.1基因以多种mRNA形式剪接的示意图EXON：

外显子，真核细胞基因DNA中的编码序列。

这样的序列可转录为RNA并进而翻译为蛋白质。

P代表磷酸化，sugar代表糖基化，lipid代表脂肪酰化，Ub代表泛素化3。

（2）在蛋白质组的研究中，时间和空间的影响都不可忽视（3）蛋白质间主要以相互作用的形式参与生命活动（4）蛋白质组研究对技术的依赖性和要求远远超过基因组学蛋白质组学研究对生物分析化学提出的挑战表11.1目前蛋白质组学分析中使用的分离与鉴定技术6-12技术是否需要标记是否可用于PTM检测可测定的蛋白质分子量范围动态范围可分离的蛋白点数方法的适用范围传统的双向电泳方法（2-DE）否是10kD200kD1,0003,000定量困难，方法的重复性差荧光双向差示凝胶电泳（DIGE）Cy-2，3or5fluorophores标记伯氨基是10kD200kD10,00063,0007适用于检测高表达水平、长半衰期的蛋白质基于反相色谱的二维色谱系统8否是5kD的肽或蛋白质1002,500限于UV检测，未与MS联用LC-MS/MS多维色谱系统（MudPit）可以用N14/N15标记氨基酸是蛋白质经酶解后的多肽混合物10,000987210适用于较复杂的蛋白质混合物，进行MS分析前需进行分级分离MALDI-TOF-MS否是10kD，实际测定蛋白质经酶解后的多肽混合物25不适用通过肽质量指纹图鉴定已分离的蛋白质SELDI-TOF-MS11否是40kD25不适用利用蛋白质芯片对生物样品中蛋白质的质量进行分析ICAT分析技术以ICAT试剂标记巯基是蛋白质经酶解后的多肽混合物无数据49612适用于含巯基蛋白质的相对定量分析cICAT分析技术以可裂解的C12/C13ICAT试剂标记巯基否蛋白质经酶解后的多肽混合物10,000496适用于含巯基蛋白质的相对定量分析注：

2-DE，双向电泳（twodimensionalelectrophoresis）；DIGE，荧光双向差示凝胶电泳（fluorescencetwo-dimensionaldifferentialgelelectrophoresis）；MudPit，用于蛋白质分离的多维色谱（multi-dimensionalforproteinidentification）；SELDI-MS，表面增强激光解吸离子化质谱（surfaceenhancedlaserdesorptionionization-MS）；基质辅助激光解吸离子化质谱（MALDI-MS，matrix-assistedlaserdesorptionionization-MS）；ICAT，同位素标记的亲和标签（isotope-codedaffinitytag）技术；cICAT，可裂解的ICAT（cleavableICAT）技术；PTM，蛋白质翻译后的修饰（posttranslationalmodification）。

图11.2蛋白质组学分析方法的灵敏度和分辨率13表11.1和图11.2表明，蛋白质组学研究对生物分析化学提出了很高的要求：

（1）对含有巨大数量的多蛋白质成分的复杂体系进行全分离是蛋白质组学研究迫切需要解决的问题。

（2）所建立的生物分析化学分离分析方法应具有很宽的动态范围，才能适应细胞内蛋白质组分析的要求。

（3）蛋白质组学研究对检测灵敏度也提出了很高的要求。

（4）原位、实时检测。

（5）对蛋白质相互作用的检测是蛋白质组学研究中一个非常重要的内容，因此，发展基于生物化学的新的、重现性好的蛋白质相互作用研究策略也是十分重要的。

蛋白质组学的分析策略与研究路线蛋白质组学的基本分析策略图11.3蛋白质组学分析的基本分析策略图11.4鸟枪法的基本分析策略蛋白质组学的研究路线一条路线类似于基因组学的研究，即力图查清人类34万个基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质数据库，从而获得有关生命活动的“全景式”信息。

另一条是基于比较的研究路线，称为比较蛋白质组学（comparativeproteomics），国外的文献中也有称为差异显示蛋白质组学（differentialdisplayproteomics）或表达蛋白质组学（expressionproteomics）。

图11.5比较蛋白质组学分析的研究路线双向电泳技术及其改进双向电泳（twodimensionalelectrophresis，2-DE）是当前蛋白质组学研究中分辨率最高、信息量最大的分离技术。

在比较蛋白质组学研究中，双向电泳还是不可缺少的手段。

目前所应用的二维电泳体系是由OFarrell等人于1957年发明，其原理是根据蛋白质的两个一级属性（等电点和相对分子质量），将一种蛋白质样品进行两次电泳，即：

在第一个方向上按等电点高低进行分离，称为等电聚焦；在第二个方向（与第一次电泳成直角的方向）上按相对分子质量大小进行分离。

蛋白质组学研究中用得最多的是由固相pH梯度等电聚焦（immobilizedpHgradientsisoelectricfocusing，IEF）/SDS-PAGE所构成的双向电泳体系。

双向电泳的流程图11.6双向电泳流程图19蛋白质样品的制备蛋白质样品制备的一般要求一般来说，一种理想的、有效的样品制备方法应满足以下要求：

应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性；溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态，避免溶解性低的蛋白质（如膜蛋白）在等电聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出；防止在样品处理过程发生蛋白质的化学修饰，包括蛋白质降解、蛋白酶或尿素热分解后所引起的修饰；排除核酸、多糖、脂类和其它干扰分子；同时，应避免处理环境对蛋白质的污染；尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白在可检测水平；尽可能缩短处理样品的时间，尽可能在低温环境中处理样品。

双向电泳图谱所传达的信息由双向电泳图可以得到：

蛋白质的分布范围（偏酸性或偏碱性）；表达蛋白质的可能个数（凝胶点的数目）；蛋白质的大概相对分子量；蛋白质的大概等电点；蛋白质相对表达丰度（点的灰度值）等信息。

图11.7双向电泳例图23图像分析技术图像分析包括图像采集、背景消减、斑点配比、数据库构建。

常用的图像采集系统有电感偶合装置（chargecoupleddevices，CCD）、光密度仪、激光诱导荧光检测器等。

无论何种采集系统，都必须具备透射扫描的功能以获得较高的灵敏度。

图像采集的信息为光密度值，一般来说，该光密度值与蛋白质点的表达丰度成正比。

影响图像采集质量的因素有：

扫描系统的分辨率、灵敏度，以及扫描时所选择的图像对比度和明亮度。

双向电泳图像分析通过软件的运行来实现。

软件分析所要做到的有以下几点：

蛋白质点数的统计；蛋白质点的定位、编号；相对丰度分析；在进行差异蛋白质组分析时，则要对相互对照样品的凝胶图像进行同步分析，比较对应蛋白点的表达丰度，获得差异蛋白质点的缺失、出现以及表达量的变化等信息。

目前有多种图像分析软件可以使用，如表11.6所列。

表11.6用于2-DE图像分析的软件工具软件名称来源应用FlikerNationalCancerInstitute（www.lecb.ncifcrf.gov/fliker/）可视的胶-胶对比PDQuestBio-Rad（）凝胶图像比较ImageMsterAmershamBiosciences（）凝胶图像比较DeCyderAmershamBiosciences（）2D-DIGE分析MelanieGenebio（http:

/Phoretix/ProgenesisNonlinearDynamics（http:

/InvestigatorHTAnalyzerGenomicSolutions（http:

/ProteomeWeawerDefiniens（http:

/Delta2DDecodon（http:

/2D-DIGE：

荧光双向差示凝胶电泳目前双向电泳技术存在的问题

（1）进行可完全重复的2-DE分析是困难的。

（2）许多较大的疏水蛋白质在IEF分析中的结果不理想。

（3）对相对分子质量过大（100,000）的蛋白质分离分析能力差。

（4）双向电泳不易实现自动化操作，因此，尚不能适应大规模蛋白质组分析的需要。

（5）双向电泳现有的主要染色技术的检测灵敏度较差。

图11.8目标蛋白拷贝数与胶上荷载的由细胞提取的蛋白质量的关系24双向电泳技术的改进目标主要有两个：

提高分辨率，增加可分离的蛋白点的数目；提高低丰度蛋白点的可检出程度。

11.4.5.1三步提取法图11.9三步提取法流程图11.4.5.2亚细胞器分离优点为：

增加了蛋白的点分离数量；可提高低丰度蛋白的检出；可明确蛋白点的亚细胞定位。

图11.10肝癌细胞QGY-7703全细胞及细胞核、20000g沉淀、100,000g沉淀、细胞质的双向电泳图荧光双向差示凝胶电泳技术（fluorescencetwo-dimensionaldifferentialgelelectrophoresis，2-DDIGE）2-DDIGE是由Amersham公司开发的一种改良技术。

它在传统双向电泳技术的基础上，结合多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光染料标记的样品。

在2-DDIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。

这种技术可检测到样品间小于10%的蛋白表达差异，统计学可信度达到95%以上。

图11.112-DDIGE的实验流程图蛋白质组学分析中的色谱技术及几种分离技术的“杂交”多维液相色谱技术多维液相色谱（multidimensionalHPLC，MDLC）技术是指连续使用几种液相色谱分离模式以使复杂混合物中的成分得到更大程度的分离的色谱技术。

与2-DE相比，多维液相色谱的主要优点为：

有高的选择性，能从含多种未知组分、组成复杂的蛋白质样品中分离出需要的组分；对于低丰度成分有很好的富集和检出能力；易于实现自动化操作，分析数据重现性好。

二维液相色谱的基本操作流程是：

样品在经过的基础上，利用高压切换阀，把谱图中的某个色谱峰（混合组分峰）的一部分（或全部）选择性地切换到二维色谱柱上进行再次分离。

常采用的二维液相色谱分离模式有：

离子交换色谱-反相液相色谱、色谱聚焦-反相液相色谱、分子排阻色谱-反相液相色谱、亲和色谱-反相液相色谱等。

图11.12酵母可溶性蛋白提取物的MDLC分析几种分离技术的“杂交”蛋白质混合物通过制备IEF、制备1D-SDS-PAGE或HPLC（如亲和色谱）分离整体蛋白质混合物，然后对分离得到的组分进行酶解，所产生的肽在进入MS前进行HPLC分离。

这种策略的优点在于：

利用电泳技术或HPLC技术对整体蛋白质混合物进行前端处理的样品量较大，可以达到若干毫克。

去除与分析目标不相关的蛋白质，提高MS检测低丰度组分的能力。

生物质谱在蛋白质组学分析中的应用在蛋白质组学的研究中，生物质谱可以开展三个方面的基础工作：

（1）以MALDI-TOF-MS或ESI-MS精确测定完整蛋白质或肽的相对分子质量；

（2）以MALDI-TOF进行肽质量指纹谱的测定，这是利用质谱测定由一种蛋白质酶解出的一组肽产物的技术；（3）以ESI-MS/MS或ESI-Q-TOF-MS进行肽序列的分析，这是测定一种蛋白质酶解出的一组肽产物中一种（或多种）肽的质量碎片谱图的技术。

精确测定完整蛋白质或肽的相对分子质量MALDI-TOF-MS测定相对分子质量

（1）MALDI-TOF-MS测定相对分子质量使用线性模式或反射模式。

（2）MALDI-TOF-MS对分析样品的要求。

（3）MALDI-TOF-MS分析中的基质选择。

（4）MALDI-TOF-MS分析中的质量校正。

表11.8肽质量准确度与蛋白质数据库检索结果分子离子误差（ppm）匹配蛋白质数所有种类a酵母b1975.954100075417310020076104461562.884100098212010019727101921055.541100013001731005147610876通过http：

/prospectorucsfedu网址用MS-FIT程序进行检索a：

所有种类蛋白质为52,205个;b：

酵母蛋白质为3653个ESI-MS测定相对分子质量在ESI条件下，能与多肽或蛋白质分子结合的质子数，也就是正电荷数，由分子中所含碱性氨基酸（ARG，LYS，HIS）总数和N-端氨基决定。

蛋白质和多肽形成多电荷离子的特性使分析质量范围在24kDa（m/z）的四极杆和离子阱质量分析器可用于生物大分子的分离。

ESI-MS图不能直接获得蛋白质的相对分子质量信息，必须通过一个重组的过程，即用计算机软件处理多电荷谱图的原始数据，求算相对分子质量。

常用的是Mann等建立的“平均算法”34。

该算法利用蛋白质正离子的ESI-MS谱计算其相对分子质量是基于两个假定：

在一个多电荷离子系列中，相邻峰值相差1个电荷；电荷是由于阳离子的加成（通常为质子）所致。

显然，多电荷谱图的的分辨率越高，重组所得的结果越准确。

为了保证重组结果的可靠性，还需注意：

用于计算的多电荷峰的分布形状：

随着电荷的减少，由低丰度向高丰度再向低丰度变化；该算法需要有至少4个以上的多电荷离子方能保证其准确。

表11.10几种蛋白质的多重电荷数蛋白质分子量浓度（molL-1）电荷数质量范围（m/z）胰岛素5,7301.7469501,450细胞色素12,4001.3512215501,100溶菌酶14,3000.3510131,1001,500肌红蛋白17,00029.516276001,100-糜蛋白酶原A25,70019.017221,1001,500乙醇脱氢酶39,80012.532468001,300-淀粉酶54,7001.835588801,550伴清蛋白176,0000.2249641,2001,500图11.13溶菌酶的ESI-MS质谱图右上角的小图是溶菌酶的多电荷离子质谱图，大图是经“去卷积”数据处理的重组质谱图，溶菌酶的相对分子质量为14,305.7。

从重组谱图中可以看出，该分子质量峰有一定的宽度，这是由于同位素峰的影响造成的。

用肽质量指纹谱鉴定蛋白质肽质量指纹谱（peptidemassfingerprinting，PMF）是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱，由于其具有特征性，所以称为指纹谱。

PMF可用于蛋白质的鉴定，即用实验测得的蛋白质酶解肽段质量数在蛋白质数据库中检索，寻找具有相似肽指纹谱的蛋白质。

肽质量指纹谱的基本实验步骤肽质量指纹谱的基本实验步骤包括：

2-DE胶上切下需要鉴定的未知蛋白点，脱色；酶切；肽提取及MALDI-TOF质谱分析；数据库检索鉴定蛋白质。

图11.14用肽质量指纹图鉴定蛋白质的基本流程图PMF分析中所用的蛋白酶在PMF分析中，使用蛋白酶的目的是尽可能多的获得合适长度的肽片段供MS分析。

含有620个氨基酸残基的肽片段适合于MS分析和数据库比较。

氨基酸残基少于6个的肽太短，不能在数据库检索中产生唯一的序列匹配；而氨基酸残基多于20个的肽，难以获得序列信息。

对用于PMF的酶的一般要求是：

易得，纯度高，稳定性好，为提高PMF检索数据库的准确性，产生肽谱的酶切点至少要有两个。

在蛋白质组学分析中，常用的酶有胰蛋白酶和Glu-C。

PMF的数据库检索PMF所提供的是蛋白质经酶解后所得到的肽混合物的精确质量数据，要完成蛋白质的鉴定，还需要利用这些数据通过数据库检索寻找匹配的蛋白质。

开展数据库检索的基础是：

数据库的选择；肽质量指纹谱软件工具的选择与利用。

常用的软件有Mascot，PeptideSearch，MS-fit，ProFound等。

影响PMF结果的因素

（1）灵敏度。

（2）可检测到的肽段少，对数据库检索是不利的。

（3）精确度。

（4）质量校正是实验中必不可少的一步，尤其是对TOF质量分析器，质量校正非常重要而且需常规进行。

（5）分辨率。

（6）数据库。

（7）样品制备。

用串联质谱分析肽序列和鉴定蛋白质PMF是鉴定蛋白质的一种简单、可行的分析策略，在目前的蛋白质组学分析中，许多工作可以通过这一策略来完成。

例如，人血红蛋白链的胰蛋白酶消化产生14个胰蛋白酶酶解肽，其中，序列为VGAHAGEYGAEALER肽的M+1+单同位素精确质量（m/z）为1529.7348，而来自小鼠的血红蛋白链的IGGHGAEYGAEALER肽有4个氨基酸与之不同，其M+1+单同位素精确质量也是1529.348，PMF技术没有能力对这种序列的不同加以辨认。

因此，对于难以通过PMF得到满意结果的，则需要通过ESI-MS/MS分析来进行蛋白质的鉴定。

ESI-MS/MS测序的关键步骤是在多肽一级质谱的基础上，选择母离子（parention），通常是（M+H）+或（M+nH）n+离子，使之进一步发生解离，得到更小的碎片离子，根据碎片离子之间的质量差来“拼接”、“复原”肽类分子的构成，从而进行氨基酸序列的推测。

碎片离子的产生模式产生碎片离子常采用碰撞诱导解离（collisioninduceddissociation，CID）、碰撞活化解离（collisionactivedissociation，CAD）、源后衰变（post-sourcedecay，PSD）等模式。

MS/MS中的肽离子裂解图11.15串联质谱CAD分析示意图图11.16肽的串联质谱碎片离子示意图蛋白质多肽主链开裂的主要方式有三种，即：

a/xb/y和c/z的成对出现。

一般而言，b/y开裂产物的丰度较高，a/x开裂在许多蛋白质的开裂中也占有主导地位，而c/z开裂则较少出现。

（1）酰胺键断裂，形成b离子、y离子。

b离子是电荷保留在N端的片段，y离子是电荷保留在C端的片段。

当母离子带有双电荷时，有可能产生一系列b离子和相应的y离子。

图11.17带有双电荷的SPAFDSIMAETLF2+可能产生的b、y离子系列（括号内为离子片断的质量数）

（2）羰基碳原子与相邻的碳原子间的C-C键断裂，形成a离子、x离子。

a离子是电荷保留在N端的片段，x离子是电荷保留在C端的片段。

（3）酰胺氮原子与相邻的碳原子间的N-C键断裂，形成c离子、z离子。

c离子是电荷保留在N端的片段，z离子是电荷保留在C端的片段。

通过MS/MS进行肽序列分析的基本原理在目前的MS/MS分析中，主要是根据完整或互补的y、b离子系列来确定肽的序列。

用ESI-MS/MS谱图鉴定蛋白质的策略

（1）串联质谱数据直接搜寻策略

（2）deNovo策略（3）肽序列标签（peptidesequencetags，PSTs）策略图11.18肽序列标签示意图肽序列标签是由一个肽段的分子量、该肽段的部分氨基酸序列、该肽段未测序前部分和测序后部分的质量组成表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（surface-enhancedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry，SELDI-TOF-MS）是在MALDI-TOF-MS基础上发展起来的一种有效的比较蛋白质组学研究技术。

这一技术最早由德国科学家Lueking等开始研究，美国赛弗吉公司（CiphergenBiosystemInc.）进行了系统研发，对MALDI-TOF-MS技术所使用的疏水性样品板表面进行了系统的改进，发展成为蛋白质芯片（proteinchiparrays）系列。

蛋白质芯片的种类与特点分为化学表面芯片（chemicalsurfacesproteinexpressionprofiling）和生物表面芯片（biochemicalsurfacesproteininteractionassays）两大类。

化学表面芯片化学表面芯片是基于色谱的原理设计的，即将色谱介质铺于芯片材料表面，形成一个特殊的物理化学表面，通过色谱介质与目标蛋白的相互作用，结合样品中的蛋白质，再经洗脱液去除非特异结合蛋白质和其它杂质，最后用SELDI-TOF-MS分析保留在芯片上的目标蛋白，获得有关的信息。

目前商品化的化学表面芯片有五种：

（1）疏水芯片（hydrophobicproteinchiparray）。

（2）弱阳离子交换芯片（weakcationicexchanger）。

（3）强阴离子交换芯片（stronganionicexchanger）。

（4）金属离子捕获（immobilizedmetalaffinitycapture，IMAC）芯片。

（5）正相亲水芯片（normalphaseproteinchip）。

生物化学表面芯片生物化学表面芯片是基于生物分子相互作用的原理设计的，用于进行蛋白质-蛋白质、DNA或RNA-蛋白质、药物-蛋白质相互作用研究。

这类芯片是将蛋白质、多肽等具有生物活性的分子固定于芯片表面，通过生物亲合作用，特异性地捕获样品中的目标蛋白，再经洗脱液去除非特异结合蛋白质和其它杂质，最后用SELDI-TOF-MS分析保留在芯片上的蛋白，获得有关的信息。

生物化学表面芯片的灵敏度极高，可以定量检测fmol级的蛋白，线性关系可达到R=0.995。

由于采用飞行时间质谱为芯片的检测手段，因此可以区分与同一抗原决定簇相结合的不同分子量的蛋白质。

在大规模的比较蛋白质组学研究中，SELDI-TOF-MS策略有其技术上的优势。

例如，在从体液样品发现生物标志的研究中，可以同时使用三种芯片，以CM10