生化分离课件考试用.docx
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生化分离课件考试用
第二章细胞分离与破碎
固液分离的类型
1、过滤(重力过滤器、压滤器、真空过滤器)2、离心3、重力沉降
发酵液的组成
悬浮液:
指固体颗粒在0.1m以上的固液分散体系。
生物细胞培养液基本上也是悬浮液。
培养液的组成:
复杂!
水70-80%、固体细胞及碎片20-30%(对微生物发酵)、少量的代谢成物、细胞破裂后的内容物、残存的培养基成分
预处理的目的:
改变发酵液的物理性质(黏度、颗粒大小、颗粒稳定性等),固液分离速度,分离器分离效率;
目标产物转移其中一相(多数为液相);
1、加热最简单、最经济的预处理方法是加热,加热不仅可以增加料液的操作特性,也可以对其进行灭菌。
但加热变性的方法只适合于对热稳定性的产物。
加热可产生:
黏度、促凝聚、固体成分体积、破坏凝胶结构、增加空隙率、去蛋白
2、调pH值:
方法简单有效、成本低廉。
pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质,适当调节pH可改善其过滤特性。
对于氨基酸、蛋白质等两性物质作为杂质存在于液体中时,常采用调pH至等电点使两性物质沉淀。
在膜分离中,发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附,常通过调整pH,改变易吸附分子的电荷性质,以减少吸附造成的堵塞和污染。
细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒,有利于固液分离。
3、凝聚和絮凝
通过电解质的加入促进原始溶液的凝聚和絮凝。
主要作用为增大混合液中悬浮粒子的体积,提高固液分离速度,同时可除去一些杂质。
凝聚和絮凝是两种方法,两个概念。
凝聚:
指在投加的化学物质(铝、铁的盐类或石灰等)作用下,胶体脱稳并使粒子相互聚集成1mm大小块状凝聚体的过程。
絮凝:
指使用絮凝剂(天然的和合成的大分子量聚电解质)将胶体粒子交联成网,形成10mm大小絮凝团的过程。
其中絮凝剂主要起架桥作用。
凝聚:
胶体粒子(10-100nm)在中性盐的促进下脱稳相互聚集成大粒子(1mm)
机理:
a中和粒子表面电荷
b消除双电层结构
絮凝:
大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状,形成絮凝团的过程
机理:
架桥作用
凝聚和絮凝技术能有效的改变细胞菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态,使其聚集起来,增大体积以便固液分离,常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中.
发酵液的带电现象
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面,一般都带有电荷。
带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。
通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷,由于静电引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于(即正离子)被吸附在其周围,在界面上形成了双电层。
凝聚剂种类:
A、无机盐类:
如硫酸铝、明矾、硫酸铁、硫酸亚铁、FeCl3、AlCl3、ZnCl2、硫酸镁等;
B、无机碱:
如Al(OH)3、Fe(OH)3、Ca(OH)2、CaO等;
C、聚合无机盐,如聚合铝、聚合铁。
机理:
A、破坏双电层,
B、水解后胶体吸附,
C、氢键结合等。
絮凝剂种类:
大多为高分子
A、阳离子类,如聚丙烯酰胺(+)、聚苯烯酸二烷基胺乙酯、聚二烯丙基四胺;
B、阴离子类,如聚丙烯酸纳、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺(-);
C、非离子类,如聚丙烯酰胺(0)、环氧化乙烯。
机理:
絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用
一种颗粒均匀、质地坚硬的粒状物质,用于扩大过滤表面的适应范围,减轻细小颗粒的快速挤压变形和过滤介质的堵塞。
使用方法:
A、预涂层;B、按一定比率混合。
助滤剂种类:
硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的炭、炉渣、重质碳酸钙,及它们的混合物等。
用量标准:
A、单位质量助滤剂所产生的最大滤液产量(最常用);B、或最长周期;C、或最快流速;D、或滤饼的最大空间利用度。
4、惰性助滤剂:
有时加入某些不影响目的产物的反应剂,可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响,从而提高过滤速率。
加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀,如CaSO4、磷酸铝等。
生成的沉淀能防止菌丝体粘结,使菌丝具有块状结构,沉淀本身可作为助滤剂,并且能使胶状物和悬浮物凝固,从而改善过滤性能。
5.加入反应剂
例子:
在新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠,生成磷酸钙沉淀可充当助滤剂,另一方面可使某些蛋白质凝固。
环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理,生成磷酸钙沉淀,能使悬浮物凝固,多余的磷酸根离子还能除去钙、镁离子,并且在发酵液中不会引入其它阳离子,以免影响环丝氨酸的离子交换吸附。
发酵液的相对纯化
1. 无机离子的去除Ca2+、Mg2+、Fe2+等的去除。
Ca2+离子浓度较高时,可采用可溶性盐,如草酸钠等Mg2+离子的去除一般采用加入三聚磷酸钠。
磷酸盐处理,也能大大降低Ca2+、Mg2+离子的浓度。
铁离子,可加入黄血盐,使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。
利用各种沉淀方法,可以去除液相中各种蛋白质。
常用的有等电点沉淀法、变性沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、反应沉淀法等。
这些沉淀方法既可以作为除杂质的方法,也可以作为提取目标产物的技术手段。
2.杂蛋白的去除
酶解法可将混合液中的不溶性多糖物质酶解,使其转化为溶解度较大的单糖,从而改变流体的流动特性,提高过滤速率。
例如:
万古霉素用淀粉作培养基,发酵完成后,发酵液中多余的淀粉使混合液粘度较大,当加入0.025%的淀粉酶后,搅拌30min,再加2.5%助滤剂(硅藻土),可使过滤速率提高5倍。
3.多糖的去除
发酵液中有色物质可能是由于微生物生长代谢过程分泌的,也可能是培养基(如糖蜜、玉米浆等)带来的,色素物质化学性质的多样性增加了脱色的难度。
色素物质的去除,一般以使用离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭等材料的吸附法来脱色最为普遍。
4.有色物质的去除
例如:
活性炭可用于柠檬酸发酵液的脱色,盐型强碱性阴离子交换树脂可用于解朊酶和果胶酶溶液的脱色,磷酸型阴离子交换树脂被用于谷氨酸发酵液的脱色等。
一般发酵液的脱色往往是在过滤除去菌体后进行。
2.1细胞分离
大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发酵液中除去。
这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变化范围很宽。
浓度可高达每单位体积含60%的不溶性固体,又可低至每单位体积仅含0.1%。
粒径的变化可以从直径约为1um的微生物,到直径为1mm的不溶性物质。
对于这些浓度较小,粒径较大,硬度较强的不溶物,我们可以采用过滤方法分离。
牢记哦
当发酵液不易被过滤纯化时,我们可以采用离心的方法来分离。
与过滤设备相比,离心设备的价格昂贵。
但当固体颗粒细小而难以过滤时,离心操作往显得十分有效。
离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异,在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程,当静置悬浮液时,密度较大的固体颗粒在重力作用下逐渐下沉,这一过程称为沉降。
由于沉降和离心相似,这儿就放在一块讨论。
离心产生的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同。
通常情况下离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或浆体。
而过滤可获得的水分含量较低的滤饼。
但是,对大多数生物发酵液可以离心但不能有效地过滤分离,所以离心往往是很有效的方法。
颗粒的沉降
当一固体微粒通过无限连续介质时,它的运动速度受两种力的影响:
一是微粒受到因微粒和流体介质间密度不同而产生的浮力作用;二是微粒所受到的流体阻力作用。
颗粒沉降(Sedimentation)
根据沉降作用力可分为:
重力沉降、离心沉降
根据沉降粒子间相互影响程度可分为:
自由沉降和干扰沉降
4.1重力沉降(Gravitationalsedimentation)
(1)球形颗粒的自由沉降速度以重力的方向为正方向
什么情况下颗粒在流体中会发生沉降过程?
重力沉降(Gravitationalsedimentation)
颗粒做匀速运动,沉降速度恒定不变,该速度称为自由沉降速度。
(2)阻力(曳力)系数(Dragcoefficient)
与流体的流动阻力系数类似,阻力(曳力)系数与颗粒沉降雷诺数有关,即
注意:
其中d为颗粒直径,u0为颗粒的沉降速度,ρ、μ分别为流体的密度与粘度。
通过实验得到曳力系数与雷诺数的关系绘成算图,将他们回归成关联式为:
④Re0>200000后,ζ骤然下降,在Re0=(3~10)×105范围内可近似取ζ=0.1。
以上的沉降过程为在重力作用下球形颗粒的自由沉降:
①颗粒为球形;
②颗粒沉降时彼此相距较远,互不干扰;
③容器壁对沉降的阻滞作用可以忽略;
④颗粒直径不能小到受流体分子运动的影响。
在实际情况中还需考虑以下因素的影响:
①干扰沉降;
②端效应;
③分子运动;
④非球形;
⑤液滴或气泡的运动。
2.1.2离心沉降
离心力:
Stock’sForce(粘滞力):
离心沉降速度:
分离因子定义Fr:
离心力/重力加速度(g)的比值
意义:
衡量离心设备的离心程度的重要技术参数,用于离心机的分类
注意:
离心沉降与重力沉降的类比。
颗粒离心沉降的速度方向是由圆心沿径向指向外周,但由于颗粒和流体同时做圆周运动,颗粒的实际运动轨迹是一个半径逐渐扩大的螺旋线。
离心沉降速度并不是颗粒的实际运动速度,只是其在径向上的分量。
省略部分见PPT
2.1.3过滤(Filtration)
概念过滤是在外力作用下,利用过滤介质使悬浮液中的液体通过,而固体颗粒被截留在介质上,从而实现固液分离的一种单元操作。
过滤介质具有多孔结构,可以截留固体物质,而让液体通过;我们把待过滤的悬浮液成为滤浆,而过滤后分离出的固体称为滤渣或滤饼,通过过滤介质的液体称为滤液。
(1)过滤介质:
过滤介质应具有以下特性:
多孔性,足够的机械强度,尽可能小的流动阻力,耐腐蚀性,耐热性,易于再生。
工业上常见的过滤介质:
织物介质、堆积介质、多孔固体介质、多孔膜。
(2)过滤分类:
深层过滤(Deepbedfilteration)滤饼过滤(Cakefilteration)
(3)过滤推动力:
重力(漏斗过滤)、压力(加压过滤)或真空(抽滤)、离心力(离心过滤)。
(4)滤饼的可压缩性
(5)助滤剂助滤剂本身就是一性能良好的过滤介质,是一种坚硬、不规则的小颗粒,它能形成结构疏松、空隙率大、不可压缩的滤饼,很大程度改善过滤难度。
助滤剂使用方法主要有两种:
混合、预涂。
2.1.3.1过滤速度
过滤过程数学描述
达西方程:
1、适用于不可压缩和简单的可压缩滤饼
2、普遍使用于生物分离过程
过滤基础理论:
省略部分见PPT
Conclusions:
结论
离心和过滤是去除不溶物的主要方法,生物分离工业首先要去除不溶物大的、硬的不溶物可用过滤方法去除。
对于大部分发酵液,助滤剂或者其它预处理方法有利于过滤,但也有没有效果的。
另外一些小的、难过滤的固体颗粒可用离心分离
第二章细胞分离与破碎2
2.2细胞破碎
胞外产品:
各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物
细胞本身:
单细胞蛋白(SCP)
胞内产品:
碱性磷酸酯酶,基因工程产物,植物细胞产物等
2.2.1细胞的结构
细菌:
肽聚糖,多糖,磷壁酸,主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。
酵母菌:
葡聚糖,甘露聚糖,蛋白质,主要阻力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度。
真菌:
多糖,蛋白质,脂类,葡聚糖,几丁质,主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。
细胞壁的组成和破碎阻力
一、物理法
二、化学法
固体剪切法(珠磨法)
酶溶法
液体剪切法
化学降解法(酸碱法)
撞击法
表面活性剂法
超声法
有机溶剂膨胀法
渗透法
萃取法
细胞破碎理论
见PPT
2.2.3细胞破碎技术
2.2.3.1机械破碎主要有高压匀浆、珠磨、撞击破碎和超声波破碎等方法
操作简介
见PPT
优点
A、在大规模cell破碎中,高压匀浆机和珠磨机用得最多;
B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌;
C、珠磨机可用于酵母和细菌,但对真菌菌丝和藻类更合适.
2.2.3细胞破碎技术
3)撞击破碎法
操作:
细胞喷雾高速冻结300m/s氮气流
优点:
A、细胞破碎仅发生在撞击的一瞬间,破碎程度均匀,避免反复和过度破碎;
B、破碎的程度可无级调节,避免细胞内部结构的破坏,特别适合于细胞器的回收;
C、实验室和工业规模均可应用,细胞浓度在10-20%,实验室规模的间歇处理能力在50-500mL/h,工业规模的连续处理在10,000mL/h以上。
4)超声破碎法(15—25kHz)
Ultrasonication超声波
超声波破碎仪
超声波破碎法(Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。
超声波振荡器有不同的类型,常用的为电声型,它是由发生器和换能器组成,发生器能产生高频电流,换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。
超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式,一般破碎效果后者比前者好。
机理在超声作用下产生的空穴化作用(cavitation),空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。
优点:
适合于多种细胞的破碎
缺点:
A、影响因素多,如振幅、黏度、表面张力、液体体积和流速、探头材料和形状;B、超声产生超氧离子毒害作用;C、有效能量的利用率低;D、产热大,需控温;E、不易放大,仅应用于实验室规模的细胞破碎。
2.2.3.2化学破碎法
酶溶法、酸碱法、有机溶剂胞溶法、表面活性剂法
酶溶法:
利用酶分解细胞壁上特出的化学键,使细胞壁破碎。
优点:
A、产品释放的选择性;
B、提取速度和收效高;
C、产品的破坏小;
D、对外界环境,如pH和温度等要求低;
E、不残留细胞碎片。
酶解(酶溶法Enymaticlysis)
利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞,使细胞壁受到部分或完全破坏后,再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜,进一步增大胞内产物的通透性。
溶菌酶(lysozyme)适用于革兰氏阳性菌细胞的分解,应用于革兰氏阴性菌时,需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。
真核细胞的细胞壁不同于原核细胞,需采用不同的酶。
自溶作用是酶解的另一种方法,利用生物体自身产生的酶来溶胞,而不需外加其他的酶。
在微生物代谢过程中,大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶,以便生长过程继续下去。
可是,改变其生长环境,可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶,以达到自溶目的。
酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸,通常采用6mol/LHCl。
碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。
天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等
合成的表面活性剂可分离子型和非离子型,离子型如十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型);十六烷基三甲基溴化铵(阳离子型)。
非离子型如TritonX-100和吐温(Tween)等
有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等
2.2.3.3物理渗透法
渗透压冲击法:
渗透压冲击是较温和的一种破碎方法,将细胞放在高渗透压的溶液中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液),由于渗透压的作用,细胞内水分便向外渗出,细胞发生收缩,当达到平衡后,将介质快速稀释,或将细胞转入水或缓冲液中,由于渗透压的突然变化,胞外的水迅速渗入胞内,引起细胞快速膨胀而破裂。
冻结-融化法
将细胞放在低温下冷冻(约-15℃),然后在室温中融化,反复多次而达到破壁作用。
由于冷冻,一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂,从而增加细胞的亲水性能,另一方面胞内水结晶,形成冰晶粒,引起细胞膨胀而破裂。
对于细胞壁较脆弱的菌体,可采用此法。
机械法和化学法的比较
机械破碎法缺点:
A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高),易使产品变性失活;
B、非专一性,胞内产物均释放,分离纯化困难;
C、细胞碎片大小不一,难分离。
化学破碎法缺点:
A、费用高;
B、引起新的污染,尤其是其他化学方法;
C、一般只有有限的破碎,常需与其他物理法连用。
破碎方法的选择的一般原则
A、提取产物在细胞质内,用机械法破碎
B、提取产物在细胞膜附近,用化学法
C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合,可采用化学法和机械法结合的方法
破碎技术杂交研究应注意的问题
A、杂交技术可产生很大优势。
B、破碎技术对下游分离技术的影响。
破碎颗粒清除,产物的分离纯化
C、在发酵阶段,考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的影响
D、菌种的培育,胞内产物胞外产物
细胞破碎的评价
破碎率定义
见PPT
2.2.4目标产物的选择性释放
利用珠磨法破碎酵母细胞时,酵母内各种酶的释放速率常数不同。
一般靠近细胞壁和细胞膜的酶释放速度快,而细胞内部或细胞器内的酶随破碎的进行缓慢释放出来。
因此,选择发现地释放目标产物是可能的,关键是要知道目标产物的性质和在细胞同存在的位置,选择适当的破碎方法和操作条件。
选择性释放目标产物的一般原则:
⑴仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围。
当目标产物存在于细胞膜附近时,可采用较混和的方法,如酶溶法(包括自溶法)、渗透压冲击法和冻结-融化法等。
当目标产物存在于细胞质内时,则需采用强烈的机械破碎法。
(2)选择性溶解目标产物。
当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时,调节溶液PH值,离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如:
螯合剂、表面活性剂等,使目标产物容易溶解释放。
同时,溶液性质应使其他杂质不易溶出。
另外机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和,在相同的目标产物释放率条件下,降低细胞的破碎程度。
第三章初级分离6
3.1沉淀分级
沉淀是物理环境的变化引起溶质溶解度降低、由液相变成固相析出生成固体凝聚物(aggregates)的现象。
常用加入试剂的方法,改变溶剂和溶质的能量平衡来降低其溶解度,使产物离开溶液生成不溶性颗粒,沉降析出。
沉淀具有浓缩与分离的双重作用。
与结晶联系:
在本质上都是新相析出的过程,主要是物理变化,当然也存在化学反应的沉淀或结晶。
区别:
结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出,沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出。
优点
A、设备简单、成本低、放大容易,产物浓度越高沉淀越有利,收率越高;
B、原料液体积很快地减小10~50倍,从而简化生产工艺、降低生产费用;
C、使中间产物保持在一个中性温和的环境;
D、及早地将目标pro.从其pro.水解酶分离出来,避免pro降解,提高产物稳定性;
E、用沉淀法作为pro色谱分离前处理,可使使用色谱分离的限制因素降低到最少。
缺点:
A、沉淀物可聚集有多种物质,如大量盐类和溶剂,所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低;
B、过滤较困难
3.1.1蛋白质的表面特性
蛋白质溶解:
相似者相溶
aa的亲水性和疏水性:
有利因素:
亲水性,包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水aa所占的比例等。
如白蛋白
不利因素:
疏水性,包括暴露的疏水基团、疏水aa所占的比例等。
如纤维蛋白原。
蛋白质的溶解与什么有关呢?
蛋白质的溶解行为是一个独特的性质,由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。
蛋白质在自然环境中通常是可溶的,所以其大部分是亲水的,但其内部大部分是疏水的。
一般而言,小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。
蛋白质是两性高分子电解质(amphotericpolymer),主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。
在水溶液中,多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势,使亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。
即便如此,一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面,形成疏水区。
疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大,疏水性强。
因此,蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。
蛋白质溶液的稳定因素
⑴蛋白质周围的水化层(hydrationshell)可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。
⑵蛋白质分子间静电排斥作用。
(存在双电层)
因此,可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度(ζ电位)降低蛋白质溶液的稳定性,实现蛋白质的沉淀。
注:
泽塔Zeta(大写Ζ,小写ζ)
蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球体,这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的,换句话说,该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒。
因此,蛋白质的沉淀,实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。
蛋白质粒子在水溶液中是带电的,带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。
因溶液是电中性的,水中应有等当量的反离子存在。
蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。
吸引力
颗粒间的相互作用
颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。
VanderWaals力
Keeson引力(偶极力)
Debye引力(诱导力)
London引力(色散力)是最重要的一种引力,因为所有分子都是可以被极化的,所以它是普遍存在的。
颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。
在低离子强度时,颗粒距离处在中间状态,双电层斥力占优势,可看为一个凝聚的势垒;在高离子强度时,吸引力超过排斥力,相互间的总位能表现为吸引位能。
虽然这个理论所假定的条件并不完全适合于蛋白质分子,但该理论对于理解破坏蛋白质溶液的稳定性仍有很大帮助,同时还有助于针对具体蛋白质选择最合适的沉淀剂及技术。
DLVO理论
见PPT
蛋白质沉淀方法分类
1)、盐析法
2)、有机溶剂沉淀法
3)、|pH水–pI|Value调节法
4)、亲水聚合物沉淀法
5)、聚电解质絮凝法
6)、高价金属离子沉淀法
7)、亲和沉淀法
3.1.2盐析沉淀
机理:
A、zetapotential;B、hydrationshell
盐溶:
“盐溶”现象—低盐浓度下,蛋白质溶解度增大
盐析:
“盐析”现象—高盐浓度下,蛋白质溶解度随之下降
3.1.2盐析沉淀
计算:
Cohn经验公式
见PPT
方法:
A、“Ks”分级盐析法:
在一定pH值及温度下,改变盐浓度(即I)达到沉淀的目的。
B、“β”分级盐析法:
在一定I下,改变溶液的pH值及温度达到沉淀的目的。
C、应用:
一般的初步分离用第一种方法,进一步纯化时用第二种方法。
3.1.2盐析沉淀
Ks盐析法:
由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感,易产生共沉淀现象,因此常用于提取液的前处理。
β盐析法:
由于溶质溶解度变化缓慢,且变化幅度小,因此分辨率更高,常用于初步的纯化。
3.1.2盐析沉淀影响因素
A、无机盐种类一系列盐沉淀蛋白质的能力进行了测定研究。
阴离子排序为:
柠檬酸根3->酒石酸根3->F->IO-3>H2PO-4>SO-4>CH3COO->Cl->ClO-3>Br->NO-3>ClO-4>I->CNS-;
对阳离子排序为:
Al3+>H+>Ba2+>Ca2+>Cs+>NH4+>K+>Na+>Li+
结论:
a不同种类的盐主要影响Ks;
b离子半径小,带电多,电荷密度高,盐析效果好。
无机盐的挑选原则:
a较高的盐析效能;
b高溶解度,能配置高离子强度的盐溶液;
c溶解度受温度的影响小;
d盐溶液的密度小,便于蛋白质沉淀和离心分离;
e不易引起蛋白质的变性;f价格低廉;
最常用(NH4)2SO4
优点:
符合上述要求;
缺点:
水解后溶液pH降低,在高pH下产氨,腐蚀性强,有异味,有毒,终产物必须除尽。
次常用Na2SO4其缺点:
在400C以下溶解度较低,主要用于热稳定蛋