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坛紫菜的分类学研究

坛紫菜（Pyropiahaitanensis）核糖体基因簇序列的测定

张皓何渊沈颂东

苏州大学医学部基础医学与生物科学学院邮编：

215123

作者简介：

张皓（1985-），男，江苏太仓人，硕士，主要研究方向为基层医学与养殖E-mail：

richard02@

何渊（1990-），男，江苏太仓人，硕士，主要从事藻类细胞发育与分子机理研究。

E-mail：

756072102@。

通信作者：

沈颂东（1968-），男，博士，教授，主要从事藻类细胞发育与分子机理研究。

E-mail：

shensongdong@

摘要：

坛紫菜是我国独有的栽培紫菜物种，而目前对坛紫菜分类学层面上仍缺乏有效的分子鉴定技术。

本研究通过PCR方法，对采自福建省莆田海区坛紫菜样品核糖体基因簇序列进行了测定，目的是为坛紫菜分类及种质鉴定提供分子生物学证据。

测定结果表明，坛紫菜样品的18SrDNA的全长序列长度为2953bp；28SrDNA部分序列3603bp，且不含内含子；5.8SrDNA长度为158bp，该区域的5’端和3’端十分保守，在紫菜属中差异较小；ITS1的长度为334bp；ITS2为678bp。

已经测定IGS区的部分长度为3555bp，该区域存在复杂二级结构。

通过对坛紫菜核糖体基因簇序列的分析表明，其能够成为紫菜分类鉴定与系统演化的分子标记。

关键词：

坛紫菜；核糖体；顺反子；系统演化

ThenuclearribosomalDNA（nrDNA）cistronsequenceofPyropiahaitanensis（Bangiales,Rhodophyta）

HaoZhang,YuanHe,SongdongShen

SchoolofBiologyandBasicMedicalSciences,SoochowUniversity,Suzhou215123,China

Abstract:

PyropiahaitanensisisauniquecultivatedlaverinChina,whilethelackofeffectivemolecularidenfiticationtechnologyaffectsthetaxonomyofP.haitanensis.ThestudysequencedthenuclearribosomalDNA（nrDNA）cistronsequenceofP.haitanensisfromPutian,FujiangProvincebypolymerasechainreaction（PCR）,inordertoprovidemolecularbiologicalevidienceforclassificationandgermplasmidentificationofP.haitanensis.Resultsshownthateachunitiscomposedofthesmall-subunit（SSU）rRNAgeneofwhichthefulllengthis2953bp;thepartialsequenceofthelarge-subunit（LSU）rRNAgeneofwhichthelengthis3603bpwithoutanyintrons;thelengthofthe5.8SrRNAgeneis158bp,the5’and3’terminalsequencesofthegenicregionsoftheribosomalcistronareextremelyconservativeamonggenusofPyropia;thelengthofITS1is334bpandITS2is678bp;thepartialsequenceofIGSis3555bp,duetoacomplicatedsecondarystructureexsitsinIGSregionmakessequencinguntoward.ThoughtheanalysisofnuclearribosomalDNAsequence,itcanbeamolecularmakerforthetaxonomicidentificationofPyropia.

KeywordsPyropiahaitanensis;ribosome;cistron;systemevolution

引言

紫菜广泛分布于世界各地，自然生长的紫菜数量十分有限，因此目前用作食用以及研究的紫菜主要是通过人工养殖，我国紫菜产量居世界首位，紫菜已成为重要的经济海藻之一[1]。

坛紫菜（Pyropiahaitanensis）隶属于红藻门（Rhodophyphyta），原红藻纲（Protoflorideophyceae），红毛菜目（Bangiales），红毛菜科（Bangiaceae），紫菜属（Pyropia），原产于福建的平潭、莆田、惠安等地，系暖温性海藻，是我国特有的也是主要的栽培品种之一，其产量约占全国紫菜产量的75%，是具有重要经济价值的红藻[2]。

坛紫菜生物学特征类似于红藻门中的其他紫菜，具有异形世代交替的生活史，包括大型的叶状体和小型的丝状体两个阶段，叶状体阶段是作为食用的阶段，而对于种质保存则以丝状体阶段为主[3]。

对叶状体的形态学描述通常作为区分不同紫菜属的经典分类方式，实际分类中，研究者更倾向于根据地理位置和其他的一些环境条件来进行区分，因此缺乏一些稳定的分类特性是区分紫菜属的一个巨大障碍[4]。

随着基础研究的加强，坛紫菜的育种及栽培技术得到了显著提高，但其种质资源的研究暴露出了很大问题，缺乏科学有效的种质鉴定技术严重影响了坛紫菜的良种选育和广泛推广，因此开发一些有效的种质鉴定技术变得非常重要[5]。

近年来，分子生物学技术得到了快速发展，越来越多的研究倾向于采用分子生物学方法结合传统细胞生物学等方法来对紫菜属进行分类，这使得分类鉴定工作变得更为精确和高效。

在海藻的分子生物学层面的分类研究中，核糖体DNA被越来越多的关注[6-8]。

核糖体RNA基因（rDNA）是植物界最保守的基因之一[9]，由高度串联的重复序列构成，且拥有转录活性的多基因家族，它以成簇的方式储存在一条或者多条染色体的核仁区。

真核生物的rRNA包括基因内间隔区（IGS），18SrDNA（SSU），内转录间隔区1（ITS1），5.8SrDNA，内转录间隔区2（ITS2）和28SrDNA（LSU），其中18SrDNA、5.8SrDNA和28SrDNA顺序串联，构成了一个转录单位，又称顺反子（cistron）。

18S、5.8S、28S被两个内转录间隔区（ITS）1和2分隔开来。

而转录单位之间又被基因内间隔区（IGS）分隔开，IGS则包含一个非转录间隔区（NTS）以及一个外转录间隔区（ETS）。

核仁区有很多这样的串联重复单元，这些重复单元的进化趋于同步，可称之为协同进化，从而使转录单元在同一种群间保持同质性[10-11]。

然而同一重复单元的不同区域由于具有不同的功能，导致进化速率存在差异，研究人员运用进化速率较慢相对来说较为保守的18srDNA和28srDNA作为区分紫菜种上的分子标记[12]，而进化速率略快的ITS区则结合5.8srDNA用来对紫菜种间进行区分[13-14]，IGS区则是高度可变区，是一种较为灵敏的分子标记，已经应用于紫菜种下的分类鉴定工作中[15-16]。

本文选取福建莆田的坛紫菜作为实验材料，测定其核糖体RNA基因，得到了大部分的基因簇序列，为紫菜属的系统进化、分类鉴定提供有价值的信息，另外本文获取坛紫菜核糖体基因簇序列的方法也可为今后获取其他红藻的序列提供重要的参考信息。

图1.核糖体DNA重复单元的基本结构图

Figure1.SchematicdiagramofthetandemrepeatedribosomalDNA

1材料与方法

1.1实验材料

本实验使用坛紫菜叶状体于2012年采自福建莆田栽培海区筏架，阴干后，放置于-20℃保存。

1.2研究方法

1.2.1DNA提取

将样品放入消毒海水中复苏，挑取健康完整叶状体，超纯水清洗3次，吸水纸吸去藻体表面水分。

将混合的叶状体和单个的叶状体叶片分别置于研钵中，经液氮充分研磨成粉末状。

采用CTAB法[17]进行DNA的提取:

加入适量60℃水浴的CTAB裂解提取液，充分混匀。

将600μL混匀的液体分别转移到1.5ml的Eppendorf管中，60℃温浴3个小时。

取出样品，分别向每管中加入1/3体积的5mol/L醋酸钾，和样品等体积的氯仿：

异戊醇（24:

1），振荡充分混匀，至溶液无分层现象。

8000rpm，离心15min，将上清液移至新管，加入2/3体积的异丙醇，上下混匀，13000rpm，4℃，离心20min，沉淀DNA。

用70%的乙醇清洗沉淀1-2次，沉淀在无菌风下吹干后溶于400μL1×TE缓冲液中。

沉淀完全溶解后，重复氯仿：

异戊醇（24:

1）的抽提步骤。

在上清液中加入两倍体积的无水乙醇，上下混匀，13000rpm，4℃，离心20min，沉淀DNA。

沉淀在无菌风下吹干后溶于50μL0.1×TE缓冲液中备用。

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.2.2引物的设计及PCR

扩增各个区段的引物序列及位置如表1所示。

由于IGS有复杂结构，因此设计了多对引物进行扩增。

利用提取的福建莆田坛紫菜DNA作为模板，所用50μL的PCR反应体系中含有5μL模板DNA，5μLdNTPMixture（2.5mmol/Leach），上下游引物（20μmol/L）各1μL，5μL10×LAPCRBuffer（Mg2+plus），0.3μLTaq（5U/μL），32.7μLddH2O。

PCR条件如表2。

表1：

PCR的引物

Table1:

PrimersusedforPCR

Region

Primers

Sequence（5’-3’）

Sourceofprimer

SSU

SSUF

CAACCTGGTTGATCCTGCCAGT

18S:

1-22（GenBankNo.AB013177）

SSUR

AATGATCCTTCCGCAGGTTCAC

18S:

2328-2349（GenBankNo.AB013177）

LSU

LSUF

CCATAACGCATCAGGTCC

28S:

1937-1954（GenBankNo.JQ236860）

LSUR

CGTCAATGAGGCGAGAAA

IGS:

1505-1522

ITS

ITS1F

TCGCTCCTACCGATTGAATG

李艳燕（2010）

ITS1R

CTCCTATTAGCGGGCACT

李艳燕（2010）

IGS

ITS2F

TCGCAACGATGAAGAACG

李艳燕（2010）

ITS2R

TAAGTTCAGCGGGTGGTC

李艳燕（2010）

IGS1F

TGCTGGAATGGACGATAA

李艳燕（2010）

IGS1R

AGCCATTCGCAGTTTCAC

李艳燕（2010）

IGS2F

CTTCTGGATGCGGGACGAGTAA

28S:

1895-1916（GenBankNo.JQ236860）

IGS2R

CCCAAGGTATGTATGCGAGGTA

IGS:

326-347（GenBankNo.JN983469）

IGS3F

CCATAACGCATCAGGTCC

28S:

1937-1954（GenBankNo.JQ236860）

IGS3R

CGTCAATGAGGCGAGAAA

IGS:

1505-1522

表2：

扩增不同区域时的PCR条件

Table2.PCRreactionprofilesforamplifyingregionsoftheribosomalunit

SSUF/R

LSUF/R

ITS1F/R

ITS2F/R

①95℃3min

①94℃5min

②94℃30s

②94℃1min

②98℃10s

③56℃30s

③55℃30s

③55℃1min

③52℃1min

④72℃3min

④72℃2min

④72℃1.5min

④72℃1min

⑤②-④35cycles

⑥72℃7min

⑥72℃10min

IGS1F/R

IGS2F/R

IGS3F/R

①95℃3min

②94℃30s

③60℃30s

③55℃30s

④72℃7min

④72℃2min

⑤②-④45cycles

⑤②-④30cycles

⑤②-④35cycles

⑥72℃7min

1.2.3PCR产物的克隆及测序

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收得到的目的片段与克隆载体pEASY-T3于25℃连接10min，重组质粒转入Trans1-T1感受态细胞中，在含有IPTG、X-gal、Amp+的LB平板上培养过夜。

挑取白色单菌落于LB培养液中，37℃摇菌过夜，抽提质粒，使用质粒PCR的方法鉴定阳性重组子。

每个平板至少挑取3个阳性克隆送往苏州金唯智生物技术有限公司测序。

ABC

图2.引物扩增电泳图

Figue2.GelelectropherogramofPCRamplificationproducts.

M为TakaraDL5000DNAmarker

图A为IGS扩增条带，条带1-3分别为引物IGS1F/R,IGS2F/R,IGS3F/R扩增的条带；图B为引物SSUF/R扩增得到的SSUrDNA条带；图C为引物LSUF/R扩增得到的LSUrDNA条带。

1.2.4序列分析比对及拼接

利用NCBI服务器上的BLAST软件对测序结果进行同源性检测[18]，用MegaBlast对得到的序列进行对齐来确定坛紫菜各区域比对的长度及边界，并利用DNAMAN进行多重序列比对。

2结果

2.1SSUrDNA序列

通过对坛紫菜不同个体的PCR扩增得到了SSUrDNA的长度为2953bp，与GenBank中已有的坛紫菜SSUrDNA序列（JN104583.1）的同源性为99%，覆盖率为79%，和另一序列（AB015795）的同源性为99%，覆盖率为78%。

序列如下：

CAACCTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAACACTTTTATACACGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAAACAGTTATAGTTCCTTTGAGAACCACACTACTTGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACATGCCGCAACGCCCGACTCACGAAGGGTGGTATTTATTGGATAAAAAGCCATCGTGCTCCTTCCAGAGCGCTTTGAGATGATTCACAATAACTTGTCGGATCGCATGGCCTTGTGCTGGCGACTGCTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGAGTATTGGTCTACCATGGTGTCGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACTCGGGGAGGTAGTGACAAAAAATAACAATAGGGGGCCCTTTGGGCCTTCTAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTATCGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGAACCTAGTTCCACTCGTTGCTCGCCTCGTGCTGTGATTGCATATGCACAGGCGCACCGCGTGAAGCGTCAAGCCCTCGTTAAAATAAAACAGCGCCAGATGTCTCTTTCCGGAAGCAGGGTGACTTGTGGAAGGCAAGCAGGCAAAAGATGGGAACCTATTTTCTTTTGGGAAAATCAATGAGCCCCCATCATACACTTCTAAATTGTCGGGGAGTGCCCGCCAAGCCTTTGACTACCGCGGTCCGCCGAGAGATGAGAGCGAGCAATCGTTCAGGACGCAGCAGTGTACGTAGTGGTACATGGATGGTAAAAACGTCAAGGGTAGGGTTGATCCGCAGGGAAGCGCGAGTGCTTCTGTCATTTGGCCTTTTGGTGGCCGCGTGGCGAGATGCAAAGGCGAACCTTCAGAGACTCTAATGGAGTGGGCGCAAGCTTAAGGGAGAGTCCAATCCACTGGGAAAAAAACCAGGTCCACAGGAGTAACGGGATTTTGCTCGCCCCGGAGGACTGTGGAAGGCGACCAAGCGTCTTAAGGGCGCAGCGTTGTCGGGTATGAATGGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAACGCTCGTAGTCGGACCTCGGAGCGCCCTCACGGGCCGGGCTTCTGCCCTTGTGCCAGTGGGAGTTTGTCTCCTTTTGTCGGGACGCGGTGTGTGGGGCCTTGACTGGTTCCGCGCGTTTATACCTGCGGGCCGACCGTTTACTGTGAAGAAAGTAAAGTGTTCAAAGCAGGCCAATGCCTTGAATATGTGAGCATGGAATAATAGAATAGGACTTGGGCTCTATTTTGTTGGTTTCCAGTGACCAAGTAATGATTAATAGGGATGGTTGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTGATGGAAGACGTACAACTGCGAAAGCATCTGCCATGGATGTTTTCATTGATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACGATGCCGACTGGGGATTGGCGGGGCTTCTAATTCATGTCCACGTCAGCACCCTAAGGGAAACCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCGGACAGAAGTATGATTGACAGACTGAAAGCTCTTTCTTGATTTTTTGGTTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTCGTCCTGCTAAATAGGTGCGCGCATGCCAGCACTGCGTTCTTACCTTCTTAGAGGGACTATGCGCGTCTAGCGTATGGAAGATTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGATGCATTCAACGAGTTTCACTTGATAGTCCTGGGTCGGAAGGCTCGGGTAATCTTTTGAAAGTGCATCGTGCTGGGGATAGATCATTGCAATTTTTGATCTTAAACGAGGAATTCCTTGTAGGCGCAGGTCATCAGCCTGCGCCGAATACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAATGGTCCGATGAAATGTCCGGATCGTGGCTACTGTGATGGACTCTGTCCAGAGCGGCAGCCGTGAGAAGCTCATTAAATCTTATCATTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTATTTTGTGGATGGACACCCCGACGGGTGGTCCTTCCGTAGGAAAACGTACACGAAGCCTTTGCAGCCCGAAAGGGTGCACAGGACGCGACTAGGAAAAAAAGGATTCTGTGGTCAATGCAAGCGGCGGCCACCGCCCCCCCCCCCACCTCGCCGAGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGAGGGACAGCTGCGACTTTCTCAAATTGCGGGAACACCCTAAAGTCAGCAAACACCGCGGCTTGGCGCGAAAAGCGCCAGGCGCAGCAGTCGGGGTAGCGCCCTGACGGATGGTAATAGCCTTTGTTGAATGGAACAATGGGCAATCCGCAGCCAAGCCCCTAAGGCCCCTCGCGGCTATGGGGAAGGTTCACAGACTGTAAGGGAAGGGGTTTTTCTGCTATGAAGAGCTTAAGAGACAGTCGGTCCCCTGCGAAAGCAGAGTCTCATGTGAGGAAGGCGCCCAGGAAAAAGTGGGTGCTGGAGAGCCATGGGAGCCCTTTCTCGTTCGGGGGGGGGGCGGGGAGTTTTCCAAGACGAGAAAAATAATACACGTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT

GenBank中已有长度为2334bp，本研究将其延伸了619bp，得到了全长序列。

2.2LSUrDNA序列

获得LSUrDNA的长度为3603bp，和GenBank中已有的坛紫菜LSUrDNA序列（JQ236860.1）的同源性为100%，覆盖率为55%，和和另一序列（JN104581.1）的同源性为100%，覆盖率为32%，因此得到的序列为坛紫菜LSUrDNA的部分序列：

CGGAGGATAAGAAACTAAAAAGGATTCCCTCAGTAGCGGCGAGCGAAGCGGGAAAAGCTCAACATGAAAACCGGTAGGGGTACACCCCCCCCTGACCGGGTTGTAGGGTAAAGTGGTGTCGTCAGTGTCGAGTCGGATATAAATCCCGTTTGGAATGGGGTGTCATAGAGGGTGATAACCCGTCTTGATCCGACATGCCGATGCGTTACGATGACCTTACAAAGAGTCGGGTTG

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